Name: Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der zellulären Inkorporation und des anschließenden biologischen Abbaus chemisch synthetisierter Eisenoxid-Nanopartikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Erfahren Sie die Magnetometriesynthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für biomedizinische Anwendungen mit humanen Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die präzise Quantifizierung zellulärer Biotransformationen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der Europäischen Union (ERC-2014-CoG-Projekt MaTissE #648779) unterstützt. Die Autoren möchten die CNanoMat physikalisch-chemische Charakterisierungsplattform der Universität Paris 13 würdigen.

1. Synthese magnetischer Nanopartikel
<ol><li>Kernsynthese – Mikrowellen-unterstützt<ol>
<li>400 mg Eisen(III) Acetylacetonat auflösen (>99,9%) in 10 ml Benzylalkohol (BA, 99,8%) innerhalb einer 30 ml Monowellenglasdurchstechflasche.</li>
		<li>Erhöhen Sie die Temperatur der Suspension von 25 auf 250 °C in 20 min (bei einer Geschwindigkeit von 11,25 °C/min) und halten Sie sie 30 min mit einem Mikrowellenreaktor bei 250 °C.</li>
		<li>Übertragen Sie die in Benzylalkohol suspendierten Nanopartikel in eine Glasdurchstechflasche und trennen Sie die Nanopartikel mit einem Neodymmagneten 30 min.</li>
		<li>Waschen Sie den Niederschlag in der vorherigen 100 ml Glasdurchstechflasche mit 10 ml Dichlormethan, 1 M Natriumhydroxid, Ethanol, pH 7 Wasser (dreimal) mit einem Neodym-Magnetfürst für 5 min pro Schritt, um Nanopartikel zu pelletisieren und den Überstand zu entfernen.</li>
		<li>Stellen Sie die Nanopartikelsuspension in Wasser mit 1 M Salzsäure auf pH2 und dann in 100 kDa Ultrazentrifugalfiltern bei 2.200 x g für 10 min zentrifugieren.</li>
		<li>Entfernen Sie das Filtrat, fügen Sie 12 ml 10-2 M Salzsäure in die Nanopartikellösung und Zentrifuge in 100 kDa Ultrazentrifugalfilter bei 2.200 x g für 10 min (dreimal). Anschließend die Nanopartikellösung innerhalb von 10 ml von 10-2 M Salzsäure vor der Beschichtung verdünnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beschichtung<ol>
<li>175 mg Zitronensäure und Polyacrylsäure in Wasser bei pH 2 in einer 100 ml Glasdurchstechflasche verdünnen und den pH-Wert mit einer 1 M Salzsäurelösung auf 2 einstellen.</li>
		<li>Fügen Sie die 10 ml-Nanopartikel wässrige Dispersion in die Beschichtungsmoleküllösung ein, was einem Massenverhältnis von 5 zwischen dem Beschichtungsmolekül und den Nanopartikeln entspricht. Rühren Sie für 2 h unter magnetischem Rühren bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Nach der Reaktion den pH-Wert auf 7 mit 1 M Natriumhydroxid einstellen.</li>
		<li>Zentrifuge die Nanopartikellösung 3 mal mit deionisiertem (DI) Wasser in 100 kDa Ultrazentrifugalfiltern bei 2.200 x g für 10 min; Filtrat entfernen und die Nanopartikellösung in 12 ml DI-Wasser verdünnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kultur und magnetische Kennzeichnung von Stammzellen
<ol><li>Kultur humane mesenchymale Stammzellen (MSC) im vollständigen mesenchymalen Stammzellwachstumsmedium (MSCGM) bei 37 °C und 5%CO2. Wenn die Zellen bei 90% Zusammenfluss sind, fügen Sie 10 ml Trypsin-EDTA vorgewärmt bei 37°C pro 150 cm2 Kolben hinzu und lassen Sie für 2-3 Minuten die Zellen zu lösen.<ol>
<li>Um zu wissen, wann die Zellen abgetrennt sind, beobachten Sie sie mit einem Hellfeldmikroskop. Setzen Sie die abgetrennten Zellen in MSCGM wieder auf und teilen Sie sie in vier 150 cm2-Flaschen. Verstärken Sie die Zellen auf diese Weise bis Durchgang 4 bis 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Lösung magnetischer Nanopartikel für die Zellbeschriftung vor: Dispergieren Sie die gewählte Konzentration von Eisenoxid-Nanopartikeln im serumfreien Roswell Park Memorial Institute Medium (RMPI-1640) ohne Glutamin. RPMI wird für die Inkubation von Nanopartikeln (und die damit verbundenen Spülschritte) verwendet, da es eine geringere Ionenstärke als DMEM hat und Nanopartikelaggregationsereignisse besser verhindert.</li>
	<li>Wenn sich die Zellen in Durchgang 4 oder 5 und 90 % konfluent befinden, entfernen Sie das MSCGM-Medium, spülen Sie die Zellen mit serumfreiem RPMI (ohne Glutamin) aus und fügen Sie 10 ml Eisenoxid-Nanopartikellösung pro 150 cm2 Kulturkolben hinzu, was das minimale Volumen ist, das erforderlich ist, um alle Zellen abzudecken.</li>
	<li>Bei 37 °C und 5%CO2 für 30 min inkubieren und dann die Nanopartikellösung entsorgen. Einmal mit serumfreiem RPMI-1640 (kein Glutamin) waschen und mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) über Nacht mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin (25 ml pro 150 cm2 Kolben) bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren, um eine vollständige Internalisierung der Nanopartikel zu ermöglichen.</li>
</ol>3. Bildung von Stammzellsphäroiden
<ol><li>Frisch vorbereitendes Zellsphäroid-Kulturmedium bestehend aus DMEM-Hoher Glukose mit L-Glutamin, ergänzt mit 50 M L-Ascorbinsäure 2-Phosphat, 0,1 M Dexamethason, 1 mM Natriumpyruvat, 0,35 mM L-Prolin und 1% universaler Kulturergänzung, die Insulin, HumanTransferrin und Selensäure (ITS-Premix) enthält.</li>
	<li>Lösen Sie die magnetischen MSCs, indem Sie 10 ml 0,05% Trypsin-EDTA vorwärmte bei 37 °C pro 150 cm2 Kolben für 2-3 Minuten hinzufügen. Wenn die Zellen abgetrennt werden, inaktivieren Sie sofort das Trypsin, indem Sie 1/3 des Volumens von DMEM hinzufügen, das mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin vorgewärmt bei 37 °C ergänzt wird.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 260 x g für 5 min, aspirieren Sie die Medien und setzen Sie die Zellen in einem kleinen Volumen (weniger als 1 ml pro 150 cm2 Kolben) des Zellsphäroid-Kulturmediums wieder auf, z. B. mit 200.000 Zellen in etwa 50 l Medium. Zählen Sie die Zellennummer mit einem Hämozytometer, und passen Sie die Lautstärke bei Bedarf an.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml frisch zubereitetes Zellsphäroid-Kulturmedium in ein 15 ml steriles konisches Zentrifugenrohr und fügen Sie das Volumen der resuspendierten Lösung hinzu, die 200.000 Zellen entspricht.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie diese magnetisch beschrifteten Zellen bei 180 x g für 3 min, wie z. B. die Bildung eines Zellpellets an der Unterseite des Rohres und halten Sie den Überstand, das das Zellkulturmedium ist.</li>
	<li>Öffnen Sie die Rohre leicht, um Luftaustausch zu ermöglichen und bei 37 °C mit 5%CO2 für bis zu 21 Tage zu brüten, Kulturzeit, entlang der die Zellen eine kohäsive 3D-Struktur bilden, die zu einem voll ausgebildeten Sphäroid führt. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche.</li>
	<li>An bestimmten Tagen die Sphäroide zweimal mit Einem Cakodylatepuffer aus 0,2 M in demineralisiertem Wasser verdünntem Cakodylat waschen und mit 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Kakokylatpuffer in destilliertem Wasser 30 min bei Raumtemperatur verdünnt fixieren. Bewahren Sie die festen Sphäroide in PBS auf, bis sie für die VSM-Messung oder TEM-Bildgebung verwendet werden. Dieser Fixierungsschritt stoppt alle biologischen Prozesse und ermöglicht eine langfristige Konservierung.</li>
</ol>4. Quantifizierung magnetischer Nanopartikel in Lösung und in Cellulo mit einem vibrierenden Probenmagnetometer (VSM)
<ol><li>Legen Sie entweder ein bestimmtes Volumen magnetischer Nanopartikellösung (maximal 10 l) oder ein einzelnes Zellsphäroid in den Probenhalter, der speziell für den VSM entwickelt wurde.</li>
	<li>Fügen Sie die Probe in den VSM ein, und scannen Sie nach Stichprobenversatz. Platzieren Sie die Probe an der Position, die dem Magnetisierungsmaximum entspricht.</li>
	<li>Führen Sie die erste Messung bei einem niedrigen Magnetfeld (zwischen -1500 Oe und +1500 Oe) mit einer Rate von 20 Oe/s durch.</li>
	<li>Führen Sie eine zweite Messung bei einem hohen Magnetfeld (zwischen -30 000 Oe und +30 000 Oe) mit einer Rate von 200 Oe/s durch.</li>
</ol>5. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Analyse
<ol><li>Für die Nanopartikellösungen 10 l der wässrigen Lösung auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter ablagern und bei Raumtemperatur trocknen lassen.</li>
	<li>Bei den in Zellen internalisierten Nanopartikeln die fixen Zellsphäroide mit Oolong Tea Extract (OTE) mit 0,5% in 0,1 M Cacodylatpuffer verdünnt, postfix mit 1% Osmiumtetroxid mit 1,5% Kaliumcyanoferrat und anschließenddehydratisiert in abgestuften Ethanolbädern, die in Epon enthalten sind. Schneiden Sie Ultrasections von 70 nm und legen Sie sie auf Cooper Grids.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder mit einem Elektronenmikroskop bei 80 kV mit einer Vergrößerung von 1k für die Beobachtung ganzer Zellen bis 40k für die Beobachtung von endosomalen Kompartimenten auf.</li>
</ol>

<ol><li>Azevedo-Pereira, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+as+a+tool+to+track+mouse+neural+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo.</a> Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).</li>
<li>Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+forces+to+promote+stem+cell+aggregation+during+differentiation%2C+and+cartilage+tissue+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling.</a> Advanced Materials. 25 (18), Deerfield Beach, Fla. 2611-2616 (2013).</li>
<li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+spheroids+using+magnetic+nanoparticles+for+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture.</a> Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+artificial+skeletal+muscle+tissues+by+a+magnetic+force-based+tissue+engineering+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).</li>
<li>Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+magnetic+cell+sheet+patches+for+advanced+strategies+in+tendon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).</li>
<li>Du, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+magnetic+tissue+stretcher+for+remote+mechanical+control+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation.</a> Nature Communications. 8 (1), 400(2017).</li>
<li>Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine%3A+A+novel+green+precursor+for+synthesis+of+magnetic+CoFe2O4+nanoparticles+and+pH-sensitive+magnetic+alginate+beads+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery.</a> Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).</li>
<li>Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+iron+oxide+nanoparticles+for+drug+delivery%3A+applications+and+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).</li>
<li>Cazares-Cortes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+in+magnetic+hyperthermia%3A+From+the+%22hot-spot%22+effect+for+local+delivery+to+combined+magneto-photo-thermia+using+magneto-plasmonic+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).</li>
<li>Espinosa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+%28Hyper%29Thermia+or+Photothermia%3F+Progressive+Comparison+of+Iron+Oxide+and+Gold+Nanoparticles+Heating+in+Water%2C+in+Cells%2C+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo.</a> Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660(2018).</li>
<li>Plan Sangnier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+thermal+therapy+with+genetically+engineered+magnetite+magnetosomes%40RGD%3A+Photothermia+is+far+more+efficient+than+magnetic+hyperthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia.</a> Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).</li>
<li>Pham, B. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+and+Clearance+of+Stable+Superparamagnetic+Maghemite+Iron+Oxide+Nanoparticles+in+Mice+Following+Intraperitoneal+Administration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).</li>
<li>Kolosnjaj-Tabi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotransformations+of+magnetic+nanoparticles+in+the+body%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Biotransformations of magnetic nanoparticles in the body.</a> Nano Today. 11 (3), 280-284 (2016).</li>
<li>Bargheer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+degradation+of+radiolabeled+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+and+quantum+dots+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Beilstein+Journal+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice.</a> Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).</li>
<li>Freund, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+widely+applicable+method+to+59Fe-radiolabel+monodisperse+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+for+in+vivo+quantification+studies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies.</a> ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).</li>
<li>Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+genotoxicity+and+tissue+distribution+of+nano+and+micron+sized+iron+oxide+in+rats+after+acute+oral+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).</li>
<li>Levy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+in+vivo+biotransformation+of+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles.</a> Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).</li>
<li>Briley-Saebo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+cellular+distribution+and+degradation+of+iron+oxide+nanoparticles+following+single+intravenous+injection+in+rats%3A+implications+for+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging.</a> Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).</li>
<li>Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Clearance+and+Toxicity+of+Monodisperse+Iron+Oxide+Nanocrystals%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals.</a> ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).</li>
<li>Sangnier, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+magnetic+nanoparticle+surface+coating+on+their+long-term+intracellular+biodegradation+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells.</a> Nanoscale. , (2019).</li>
<li>Mazuel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magneto-Thermal+Metrics+Can+Mirror+the+Long-Term+Intracellular+Fate+of+Magneto-Plasmonic+Nanohybrids+and+Reveal+the+Remarkable+Shielding+Effect+of+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold.</a> Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997(2017).</li>
<li>Van de Walle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+magnetic+nanoparticles+from+nano-degradation+products+revealed+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).</li>
<li>Mazuel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+Intracellular+Biodegradation+of+Iron+Oxide+Nanoparticles+Evidenced+Magnetically+at+Single-Endosome+and+Tissue+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels.</a> ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).</li>
<li>Bee, A., Massart, R., Neveu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+very+fine+maghemite+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetism+and+Magnetic+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthesis of very fine maghemite particles.</a> Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).</li>
<li>Feldmann, C., Jungk, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyol-Mediated+Preparation+of+Nanoscale+Oxide+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).</li>
<li>Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Highly+Crystalline+and+Monodisperse+Maghemite+Nanocrystallites+without+a+Size-Selection+Process%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).</li>
<li>Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetite+Nanocrystals%3A+Nonaqueous+Synthesis%2C+Characterization%2C+and+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility.</a> Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).</li>
<li>Richard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USPIO+size+control+through+microwave+nonaqueous+sol-gel+method+for+neoangiogenesis+T2+MRI+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent.</a> Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).</li>
<li>Ngo, A. T., Pileni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblies+of+Ferrite+Nanocrystals%3A+Partial+Orientation+of+the+Easy+Magnetic+Axes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+synthesis+conditions+on+the+properties+of+citric-acid+coated+iron+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Microelectronic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles.</a> Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+stem+cells+and+macrophages+with+gold+and+iron+oxide+nanoparticles+-+The+choice+of+the+best+suited+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles - The choice of the best suited particles.</a> Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).</li>
<li>Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+Basic+principles%2C+limits+of+detection%2C+and+pitfalls+of+highly+sensitive+SQUID+magnetometry+for+nanomagnetism+and+spintronics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics.</a> Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101(2018).</li>
<li>Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetophoresis+and+ferromagnetic+resonance+of+magnetically+labeled+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells.</a> European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).</li>
<li>Jing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+intracellular+magnetic+nanoparticle+uptake+measured+by+live+cell+magnetophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis.</a> The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).</li>
<li>Van de Walle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+situ+magnetic+measurement+of+the+intracellular+biodegradation+of+iron+oxide+nanoparticles+in+a+stem+cell-spheroid+tissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model.</a> Nano Research. , (2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Mit einer schnellen und effizienten Mikrowellen-basierten Synthese können magnetische Nanopartikel leicht synthetisiert, mit kontrollierter Größe und weiter mit bestimmten Molekülen beschichtet werden. Ein kritischer Schritt ist es, das Eisensalz und den Benzylalkohol unter Vakuum zu lagern, um eine kleine Dispersion in der Größe zu halten. Der Benzylalkohol wirkt sowohl als Lösungsmittel als auch als Liganden und ermöglicht es, kalibriertes blankes Eisenoxid direkt zu erhalten, ohne dass zusätzliche Liganden benötigt we...

Das Interesse an den magnetischen Merkmalen von Eisenoxid-Nanopartikeln für eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen ist gestiegen. Ihre Reaktion auf Magnetresonanz macht sie zu zuverlässigen Kontraststoffen für die Magnetresonanztomographie (MRT), ein Vorteil in der regenerativen Medizin, wo Zellen, die mit magnetischen Nanopartikeln gekennzeichnet sind, nach der Implantation1in vivo nachverfolgt werden können. Mithilfe von Magnetfeldern können Zellen auch in der Ferne geführt werden; auf diese Weise können zelluläre Sphäroide2,3, Ringe4, oder Blatt5 magnetisch und auch aus der Ferne stimuliert6, ein Vorteil in der Entwicklung von Gerüst-freien Geweben. Die Möglichkeiten für diese Nanopartikel umfassen auch Arzneimittelabgabesysteme7,8 und magnetische und photoinduzierte hyperthermische Behandlung, um Krebszellen9,10,11abzutöten. Bei all diesen Anwendungen werden die Nanopartikel entweder durch intravenöse Injektion oder durch direkte Internalisierung in Zellen in die biologische Umgebung integriert und dann im Inneren gelassen, was ihr intrazelluläres Schicksal in Frage stellt.
In-vivo-Analysen vermittelten ein allgemeines Verständnis des Schicksals der Nanopartikel im Organismus: Bei injektionn in den Blutkreislauf werden sie zunächst hauptsächlich von den Makrophagen der Leber (Kupffer-Zellen), Milz und Knochenmark erfasst, nach und nach abgebaut und verbinden sich mit dem Eisenpool des Organismus12,13,14,15,16,17,18,19. Qualitative Beobachtungen sind nur durch die Zirkulation der Nanopartikel im gesamten Organismus möglich. Typischerweise kann die Getriebeelektronische Mikroskopie (TEM) verwendet werden, um die Nanopartikel direkt zu beobachten und das Vorhandensein von Eisen in den Organen kann über die Dosierung bestimmt werden. In jüngerer Zeit wurde ihr Schicksal direkt an einem Zellpool bewertet, d.h. in einem engen Kreislauf ohne Eisenflucht, was eine quantitative Messung ihrer Biotransformationen auf Zellebene20,21,22ermöglicht. Solche Messungen sind durch die Analyse der magnetischen Eigenschaften der Nanopartikel möglich, die eng mit ihrer strukturellen Integrität verbunden sind. Vibrierende Probenmagnetometrie (VSM) ist eine Technik, bei der die Probe periodisch vibriert, so dass die Spulenmessung des induzierten Flusses das magnetische Moment der Probe am angelegten Magnetfeld liefert. Eine solche synchrone Detektion ermöglicht eine schnelle Messung, die ein Mittel zur Bestimmung der magnetischen Momente einer großen Anzahl von Proben20,21,22,23ist. Die makroskopische magnetische Signatur, die von VSM abgerufen wird, gibt dann einen quantitativen Überblick über die gesamte biologische Probe, die direkt mit der Größe und Struktur der Nanopartikel korreliert. Insbesondere liefert es das magnetische Moment bei der Sättigung (ausgedrückt in emu) der Proben, was eine direkte Quantifizierung der Anzahl der in der Probe vorhandenen magnetischen Nanopartikel bzw. ihrer spezifischen magnetischen Eigenschaften darstellt.
Es hat sich gezeigt, dass die intrazelluläre Verarbeitung magnetischer Nanopartikel eng mit ihren strukturellen Merkmalen verbunden ist20. Diese Funktionen können über optimale Syntheseprotokolle gesteuert werden. Jedes Protokoll bietet Vorteile und Einschränkungen. Eisenoxid-Nanopartikel werden häufig in wässrigen Lösungen durch Kopräzipation von Eisenionen synthetisiert24. Um die Grenzen der Polydispersität der Nanopartikelgröße zu überwinden, wurden andere Synthesemethoden wie polyolvermittelte Sol-Gel-Methoden entwickelt25. Nicht wässrige Ansätze durch thermische Zersetzung führen zur Produktion sehr gut kalibrierter Eisenoxid-Nanopartikel26. Die Verwendung von massiven Mengen an Tensiden wie Oleylamin oder Ölsäure erschwert jedoch deren Funktionalisierung und Wassertransfer für biomedizinische Anwendungen. Aus diesem Grund synthetisieren wir solche magnetischen Nanopartikel über einen nicht wässrigen Sol-Gel-Weg, der zu hoher Kristallinität, Reinheit und Reproduzierbarkeit führt27. Dieses Protokoll erzeugt gut kontrollierte Nanopartikel in Größe, die durch Temperaturschwankungen28abgestimmt werden können. Dennoch hat die mikrowellenunterstützte nicht wässrige Sol-Gel-Route eine obere Größengrenze der erhaltenen Nanopartikel von etwa 12 nm. Dieses Verfahren wäre nicht für Anwendungen mit ferromagnetischen Partikeln bei Raumtemperatur geeignet. Neben der Kernsynthese ist ein weiteres Hauptmerkmal die Beschichtung. An der Oberfläche des Nanopartikels liegend, fungiert die Beschichtung als Verankerungsmolekül, das die gezielte Internalisierung der Nanopartikel unterstützt, oder sie kann das Nanopartikel vor dem Abbau schützen. Da Benzylalkohol gleichzeitig als Sauerstoffquelle und Liganden dient, werden nackte Nanopartikel ohne zusätzliche Tenside oder Liganden hergestellt. Die Nanopartikel werden dann nach der Synthese ohne Tensidaustausch leicht oberflächenfunktionalisiert.
Dabei werden zwei Arten von Nanopartikeln bewertet, die den gleichen Kern besitzen und sich in der Beschichtung unterscheiden. Der Kern wird mit einer schnellen und hocheffizienten Mikrowellentechnik synthetisiert. Die beiden verglichenen Beschichtungen bestehen aus Zitronensäure, einer der am häufigsten als Beschichtungsmittel in biomedizinischen Anwendungen29,30und Polyacrylsäure (PAA), einer polymeren Beschichtung mit einer hohen Anzahl von Chelatfunktionen. VSM-Magnetometriemessungen werden dann zuerst verwendet, um die Nanopartikelaufnahme durch die Zellen zu quantifizieren, und dann als direkte Bewertung der strukturellen Integrität von Nanopartikeln bei der Internalisierung in Stammzellen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Inkubationskonzentration die Aufnahme von Nanopartikeln beeinflusst und dass die Beschichtung ihren Abbau beeinflusst, wobei die große Anzahl von Verankerungsmolekülen von PAA den Kern vor Dementstehen schützt.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Benzylalkohol für die Synthese</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.22259</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Bereiten Sie eine 1 mM Stammlösung her, die zu 100 % in Ethanol verdünnt ist, und lagern Sie sie bei -20 % C</td></tr><tr><td>Dichlormethan &ge; 99% stabilisiert, GPR RECTAPUR</td><td>VWR Chemicals</td><td>23367</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit Glutamax I</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>Kein Natriumpyruvat, kein HEPES</td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Formalinlösung 10% neutral gepuffert</td><td>Sigma</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure, 1,0 N standardisierte Lösung</td><td>Alfa Aesar</td><td>35640</td><td></td></tr><tr><td>Eisen(III)-acetylacetonat (> 99,9 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517003</td><td></td></tr><tr><td>ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)</td><td>Corning</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure 2-phosphat</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Bereiten Sie eine frische konzentrierte Lösung (25 mM) vor, verdünnt in destilliertem Wasser</td></tr><tr><td>L-Prolin</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td>Eine in destilliertem Wasser verdünnte Stammlösung von 175 mM herstellen und bei 4 μg lagern; C</td></tr><tr><td>Mesenchymale Stammzelle (MSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Monowellen-Glasfläschchen</td><td>Anton Paar</td><td>82723_us</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowellenreaktor</td><td>Anton Paar</td><td>Monowave 300</td><td></td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit medium</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Für das komplette Medium fügen Sie das mitgelieferte BulletKit (mit Serum, Glutamin und Antibiotika) zum MSCGM-Medium</td></tr><tr><td>PBS ohne CaCl2 mit CaCl2 hinzu o MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (10.000 U/ml)/Streptomicin (10.000 μm; g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poly(acrylsäure, Natriumsalz)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>416010</td><td>MW = 1200 g/mol</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640, kein Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>31870-025</td><td>Kein Natriumpyruvat, kein HEPES</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid, 1,0N standardisierte Lösung</td><td>Alfa Aesar</td><td>35629</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvatlösung 100mM</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Steriles konisches Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>15 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat</td><td>VWR</td><td>33615.268</td><td>Bereiten Sie eine 1 M Stammlösung in destilliertem Wasser verdünnt vor und lagern Sie sie bei 4 μV; C</td></tr><tr><td>Tri-Natriumcitrat-Dihydrat, zertifiziert AR für die Analyse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10396430</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Zentrifugalfilter</td><td>Amicon</td><td>AC S510024</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung der magnetometrie zur Überwachung der zellulären inkorporation und des anschließenden biologischen abbaus chemisch synthetisierter eisenoxid-nanopartikel

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetische Nanopartikel aus Eisenoxid stellen ein besonderes Interesse für eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen dar, für die sie oft in Zellen verinnerlicht und dann im Inneren belassen werden. Eine Herausforderung besteht darin, ihr Schicksal in der intrazellulären Umgebung mit zuverlässigen und präzisen Methoden zu beurteilen. Hierbei stellen wir die Verwendung des vibrierenden Probenmagnetometers (VSM) vor, um die Integrität magnetischer Nanopartikel in Zellen präzise zu quantifizieren, indem sie ihr magnetisches Moment messen. Stammzellen werden zuerst mit zwei Arten von magnetischen Nanopartikeln beschriftet; Die Nanopartikel haben den gleichen Kern, der über eine schnelle und effiziente Mikrowellen-basierte nichtwässrige Solgelsynthese entsteht und unterscheiden sich in ihrer Beschichtung: Das häufig verwendete Zitronensäuremolekül wird mit Polyacrylsäure verglichen. Die Bildung von 3D-Zellsphäroiden wird dann durch Zentrifugation erreicht und das magnetische Moment dieser Sphäroide wird zu unterschiedlichen Zeiten mit dem VSM gemessen. Das erhaltene Moment ist ein direkter Fingerabdruck der Integrität der Nanopartikel, wobei abnehmende Werte auf einen Nanopartikelabbau hindeuten. Bei beiden Nanopartikeln nimmt das magnetische Moment im Laufe der Kulturzeit ab und offenbart ihren biologischen Abbau. Eine schützende Wirkung der Polyacrylsäurebeschichtung wird auch im Vergleich zu Zitronensäure gezeigt.

Mit Hilfe der Mikrowellen-gestützten Synthese werden magnetische Nanopartikel mit einem monodispersen Kern von 8,8 ± 2,5 nm Kerngröße hergestellt und entweder mit Citrat oder PAA beschichtet (Abbildung 1A). Stammzellen werden dann mit diesen Nanopartikeln in Kulturmedium in einer gegebenen Konzentration für 30 Minuten dispergiert, was zu ihrer Endozytose und Einschließung innerhalb der zellulären Endosomen führt (Abbildung 1B). Die magnetischen Stammzellen werde...

Eisenoxid-Nanopartikel werden über ein nicht wässriges Sol-Gel-Verfahren synthetisiert und mit anionischen Kurzmolekülen oder Polymeren beschichtet. Die Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der Integration und Biotransformation magnetischer Nanopartikel in menschlichen Stammzellen wird mit einem vibrierenden Probenmagnetometer (VSM) demonstriert.

Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der zellulären Inkorporation und des anschließenden biologischen Abbaus chemisch synthetisierter Eisenoxid-Nanopartikel

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Dieses Video stellt eine schnelle und effiziente Methode zur Synthese magnetischer Nanopartikel und zum Einsatz von Magnetometrie zur Fotografie der Transformation in der biologischen Umgebung vor. Magnetische Nanopartikel haben erhöhte Aufmerksamkeit für biomedizinische Anwendungen angezogen, Und es ist wichtig zu verstehen, dass Schicksal einmal in Zellen verinnerlicht. Dies wird hier durch Messung des zellulären Magnetismus erreicht.Sowohl bei der Synthese magnetischer Nanopartikel als auch bei Messungen könnte das Ergebnis durch Kontamination beeinflusst werden. Verwenden Sie gut gereinigte chemische Durchstechflaschen und stellen Sie sicher, dass die Magnetometer-Ausrüstung frei von Verunreinigungen ist. Der Magnetometrie-Probenhalter wird in der Regel für Pulverproben verwendet.Wir zeigen, wie der Einsatz des Halters an flüssige oder biologische Proben angepasst werden kann. In einer 30 Milliliter Manawelle Glas durchalle40 Milligramm Eisen drei Acetylacetonat in 10 Milliliter Benzylalkohol auf. Mit Hilfe eines Mikrowellenreaktors wird die Suspension bei einer Geschwindigkeit von 11,25 Grad Celsius pro Minute von 25 Grad Celsius auf 250 Grad Celsius erhitzt und bei 250 Grad Celsius erhalten.Um die Nanopartikel zu trennen, wenden Sie einen Neodym-Magneten für 30 Minuten an. Um die Nanopartikel zu pellet, führen Sie eine Reihe von Waschungen mit 10 Milliliter der bezeichneten Waschflüssigkeit und auftragen einen Neodym-Magnet für fünf Minuten. Entfernen Sie das Filtrat und fügen Sie 12 Milliliter von 10 zu den minus zwei Molsalzsäure.Zentrifugieren Sie die Suspension und einen 100-Kilodalton-Filter bei 2, 200 mal G für 10 Minuten. Dann setzen Sie die Nanopartikel in 10 Milliliter n10 bis minus zwei Molsalzsäure aus. Bereiten Sie die Beschichtungsmoleküllösung wie im Manuskript beschrieben vor.Fügen Sie die 10 Milliliter Nanopartikel wässrige Dispersion in die Beschichtungsmoleküllösung mit einem Massenverhältnis von fünf zu eins zwischen den Beschichtungsmolekülen und den Nanopartikeln hinzu. Dann rühren Sie das Gemisch für zwei Stunden bei Raumtemperatur mit einem Magnetischen Rührer. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, stellen Sie den pH-Wert des Gemischs mit einem Mol-Natriumhydroxid auf sieben an.Wenn die Kultur der humanen mesenchymalen Stammzellen in Durchgang fünf und 90% konfluent ist, entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen mit serumfreiem RPMI ohne Glutamin ab. Zu jedem 150 Quadratzentimeter Großen Kulturkolben 10 Milliliter der Nanopartikelsuspension hinzufügen. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 30 Minuten.Dann entsorgen Sie das Medium, das die Nanopartikelsuspension enthält, und waschen Sie die Zellen einmal mit serumfreiem RPMI 1640. Fügen Sie DMEM ergänzt mit 10%FBS und 1%penicillin Streptomycin. Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren, um eine vollständige Internalisierung der Nanopartikel zu ermöglichen.Fügen Sie 10 Milliliter 0,05% Trypsin EDTA für 37 Grad Celsius zu jedem Kolben magnetisch beschrifteter MSCs hinzu. Nach zwei bis drei Minuten, wenn die Zellen abgetrennt sind, sofort inaktivieren das Trypsin durch Hinzufügen eines Drittels des Volumens der vorgewarnten ergänzten DMEM. Zentrifugieren Sie die abgetrennten Zellen bei 260 mal G für fünf Minuten.Das Medium ansaugen und die Zellen in einem kleinen Volumen zellsphäroiden Kulturmediums in einer Konzentration von etwa 200.000 Zellen pro 50 Mikroliter wieder aussetzen. Fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitetes Zellsphäroid-Kulturmedium zu einem 15 Milliliter sterilen konischen Zentrifugenrohr hinzu. Fügen Sie dann ein Volumen der Zellsuspension hinzu, das 200.000 Zellen entspricht.Zentrifugieren Sie diese magnetisch beschrifteten Zellen drei Minuten lang bei 180 mal G, um ein Zellpellet am Boden des Rohres zu bilden. Dann legen Sie die Röhre in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, so dass die Kappe leicht für den Gasaustausch geöffnet. Legen Sie entweder ein bestimmtes Volumen magnetischer Nanopartikel oder eine feste einzelzellig-sphäroide Suspension in das vibrierende Probenmagnetometer oder VSM, Probenhalter.Bei Bedarf kann PTFE-Band verwendet werden, um Leckagen zu verhindern. Legen Sie den Probenhalter in den VSM ein und scannen Sie nach Probenversatz. Platzieren Sie die Probe an der Position, die dem Magnetisierungsmaximum entspricht.Führen Sie die erste Messung bei einem niedrigen Magnetfeld zwischen negativen 1, 500 Oersteds und positive m150 500 Oersteds mit einer Rate von 20 Oersteds pro Sekunde durch. Führen Sie eine zweite Messung bei einem hohen Magnetfeld zwischen null Oersteds und positiven 30.000 Oersteds mit einer Rate von 200 Oersteds pro Sekunde durch. 10 Mikroliter Nanopartikel, die in einer wässrigen Lösung dispergiert sind, wurden im vibrierenden Probenmagnetometer gemessen.Die Steigung des zweiten Teils der Kurve ist die diamagnetische Konstante, die das diamagnetische Signal des Wassers und des Probenhalters darstellt. Diese diamagnetische Konstante wurde vom magnetischen Moment der Lösung subtrahiert, um nur das magnetische Moment der Nanopartikel zu erhalten. Das magnetische Moment bei der Sättigung wurde dann bestimmt.Beschichtete Nanopartikel wurden in Stammzellen verinnerlicht. Elektronenmikroskopische Bilder zeigen die citratbeschichteten und PAA-beschichteten Nanopartikel, die in den Endosomen eingeschlossen sind. Nachdem die Zellen durch Zentrifugation pelletiert wurden, bildeten sie ein Zellsphäroid, das über einen längeren Zeitraum in Kultur gehalten werden kann.Einzelne Zellsphäride wurden ebenfalls mit dem VSM gemessen und das magnetische Sättigungsmoment wurde verwendet, um die Menge der Nanopartikel in einer Zellprobe zu berechnen. Die Aufnahme der Nanopartikel hängt von ihrer Inkubationskonzentration ab. Eine Abnahme des Magnetismus der Zellsphäride im Laufe der Zeit deutete auf den biologischen Abbau der Nanopartikel hin, der durch Elektronenmikroskopie bestätigt wurde.Der Abbau war bei den citratbeschichteten Nanopartikeln erheblicher als bei den PAA-beschichteten Nanopartikeln. Mit Hilfe der Magnetometrie kann der Abbau magnetischer Nanopartikel in Zellen genau quantifiziert und die Auswirkungen der Zukunft von Nanopartikeln auf das an Rohverhalten Interessierte bewertet werden. In diesem Protokoll wurden die Magnetometriemessungen an Zellsphäroiden durchgeführt, können aber auf Zellen zur Suspension oder zu Organen ausgedehnt werden.Mit der beschriebenen Methode sind Sie in der Lage, die Wechselwirkungen von neu gestalteten magnetischen Nanopartikeln in verschiedenen Zellsystemvon Interesse zu erforschen, aber auch Sie können ihre in vivo Bioverteilung und Schicksal verfolgen.

using-magnetometry-to-monitor-cellular-incorporation-subsequent

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben eine Technik zur Kennzeichnung und Verfolgung von Stammzellen mit FDA-Zulassung, superparamagnetische Eisenoxid (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Diese zellulären bildgebendes Verfahren, das Magnetresonanz-(MR)-Bildgebung nutzt zur Visualisierung, ist leicht zugänglich für die langfristige Überwachung und Diagnose von Erfolg oder Misserfolg Stammzellen engraftments bei Patienten.

Labeling Stammzellen mit Ferumoxytol, eine FDA-Zulassung Eisenoxid-Nanopartikel

Quelle: Arias, S. L., et al. Herstellung einer funktionalisierten magnetischen bakteriellen Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikeln. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert die In-situ-Synthese von Magnetit-Nanopartikeln in einem bakteriellen Nanocellulose-Pellikel, das von Gluconacetobacter xylinus produziert wird. Es erklärt, wie magnetische bakterielle Nanocellulose durch Eisenioneninfusion, alkalische Fällung und Reinigung erzeugt wird.

Erzeugung von magnetit-eingebetteten bakteriellen Nanocellulose-Pellikeln

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung einer bakteriellen Nanocellulose (BNC) magnetisch für Anwendungen bei der Rekonstruktion geschädigter Blutgefäße. Das BNC wurde durch den Stamm G. xylinus synthetisiert. Andererseits wurde die Magnetisierung des BNC durch in situ Ausfällung von Fe2+ und Fe3+ Eisenionen innerhalb des BNC-Netzes realisiert.

Die Herstellung einer funktionalisierter magnetischer bakterielle Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikel

Gezielte Zellverabreichung ist nützlich in einer Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen.  Das Ziel dieses Protokolls ist es, superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPION) zur Markierung von Zellen zu verwenden und dadurch magnetische Zell-Targeting-Ansätze für ein hohes Maß an Kontrolle über die Zellabgabe und -lokalisierung zu ermöglichen.

Zellmarkierung und Targeting mit superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel

Mikrowellen-Technologie ermöglicht extrem schnelle Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für Atherosklerose Plaquecharakterisierung. Die Verwendung eines Aminobisphosphonat in der Außenseite des Nanopartikels bietet eine schnelle Anreicherung in der atherosklerotischen Bereich.

Mikrowelle gesteuerte Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für die schnelle Erkennung von Atherosclerosis

Ein Protokoll für die Synthese und Kationisierung von Kobalt-dotiertem Magnetoferritin wird vorgestellt, sowie eine Methode zur schnellen Magnetisierung von Stammzellen mit kationisiertem Magnetoferritin.

Synthese von kationisiertem Magnetoferritin für ultraschnelle Magnetisierungs von Zellen

Wir beschreiben Sie ein Verfahren zur Detektion von chemischen Elementen vorhanden in Situ in menschlichen Zellen sowie deren Quantifizierung in Vitro . Die Methode eignet sich gut für jeden Zelltyp und eignet sich besonders zur quantitativen chemischen Analyse in einzelnen Zellen nach in-vitro- Metall-Oxid-Nanopartikel-Exposition.

In Situ Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Zelle von Metall-Oxid-Nanopartikel mit nuklearen Mikrosonde Analyse

Dieses Manuskript beschreibt die effiziente, nicht-virale Abgabe von miR-Zellen durch einen PEI / MNP-Vektor und ihre Magnetisierung an Endothelzellen. Somit kann zusätzlich zu genetischer Veränderung, ermöglicht dieser Ansatz für die magnetische Zellführung und MRI Nachweisbarkeit. Die Technik kann verwendet werden, um die Eigenschaften von therapeutischen Zellprodukten zu verbessern.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

Diese Arbeit beschreibt Protokolle für die Herstellung von magnetischen Nanopartikeln, seine Beschichtung mit SiO2, gefolgt von seiner Aminfunktionalisierung mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) und seiner Konjugation mit Deferoxamin unter Verwendung eines Succinylmoiety als Linker. Eine tiefe strukturelle Charakterisierungsbeschreibung und ein Aufnahmebakterientest mit Y. enterocolitica für alle Zwischen-Nanopartikel und das endliche Konjugat werden ebenfalls ausführlich beschrieben.

Synthese funktionalisierter magnetischer Nanopartikel, deren Konjugation mit dem Siderophor Feroxamin und deren Bewertung für den Bakteriennachweis

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Biofunktionalisierung von magnetischen Nanomaterialien mit Antikörpern für spezifisches Zell-Targeting zur Verfügung. Zum Beispiel verwenden wir Eisen-Nanodrähte, um Krebszellen anzugreifen.

Biofunktionalisierung magnetischer Nanomaterialien

Die folgende Studie evaluiert das toxikologische Profil eines ausgewählten metallorganischen Gerüsts unter Verwendung der elektrischen Zellsubstrat-Impedanzmessung (ECIS), einer Echtzeit-Hochdurchsatz-Screening-Technik.

Elektrische Zell-Substrat-Sensorik zur Echtzeit-Bewertung von toxikologischen Profilen metallorganischer Gerüstverbindungen

Erfahren Sie die Magnetometriesynthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für biomedizinische Anwendungen mit humanen Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die präzise Quantifizierung zellulärer Biotransformationen.

Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der zellulären Inkorporation und des anschließenden biologischen Abbaus chemisch synthetisierter Eisenoxid-Nanopartikel (Video) | JoVE Journal

Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der zellulären Inkorporation und des anschließenden biologischen Abbaus chemisch synthetisierter Eisenoxid-Nanopartikel

Weitere Videos entdecken