Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten
May 16th, 2020
Dieses Protokoll veranschaulicht 1) die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Musculus gastrocnemius der Maus sowie 2) die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen unter Verwendung einer differentiellen Ultrazentrifugationsmethode in Kombination mit Saccharosedichtegradienten gefolgt von Western-Blot-Analysen.
Der Vorteil der Verwendung der differentiellen Zentrifugation für dieses Protokoll besteht darin, dass sie leicht bis zu Litern skalierbar ist und daher ideal für die Isolierung von Exosomen aus primären Fibroblasten ist. Aufgereinigte Exosomen können aus verschiedenen Zelltypen und Geweben gewonnen werden, die aus verschiedenen Krankheitsmodellen isoliert wurden. Die Exosomen können als diagnostische Biomarker verwendet werden.
Diantha van de Vlekkert, Wissenschaftlerin vom Labor d'Azzo, wird dieses Verfahren demonstrieren. Wiegen Sie zunächst die Muskeln der Maus und übertragen Sie sie dann auf eine 10-Zentimeter-Schale. Arbeiten Sie unter einer Biosicherheitshaube und hacken Sie die Muskeln mit Skalpellen, um eine feine Paste herzustellen. Füllen Sie die fein gehackte Muskelpaste in eine 50-Milliliter-Tube und fügen Sie eine Verdauungslösung mit dem 3,5-fachen Volumen pro Milligramm Gewebe hinzu.
45 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um eine vollständige Dissoziation zu erreichen, mischen Sie die Suspension alle 10 Minuten gründlich mit einer 5-Milliliter-Pipette. Um die Aufschlusslösung zu inaktivieren, geben Sie 20 Milliliter DMEM Complete in die Zellsuspension.
Pipettieren Sie durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb aus Nylon, das auf einem 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist, und waschen Sie das Zellsieb dann mit weiteren 5 Millilitern DMEM Complete. Die Zellsuspension bei 300 g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in 10 Millilitern DMEM Complete.
Säen Sie die Zellen in eine 10 Zentimeter große Schale und stellen Sie die Schale dann bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 3 % Sauerstoff in den Inkubator. Die Fibroblastenkulturen der Skelettmuskulatur müssen auf einem niedrigen Sauerstoffgehalt gehalten werden, um physiologische Lichtbedingungen zu gewährleisten. Der Sauerstoffgehalt in der Skelettmuskulatur beträgt etwa 2,5 %Nachdem die Zellen 100 % Konfluenz erreicht haben, kultivieren Sie sie einen weiteren Tag lang, spülen Sie sie dann mit PBS ab und fügen Sie einen Milliliter Trypsinisierungslösung hinzu.
Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang inkubiert haben, stoppen Sie die Trypsinisierung, indem Sie 10 Milliliter DMEM Complete hinzufügen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen dann 10 Minuten lang bei 300 g bei Raumtemperatur. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in 20 Millilitern DMEM und säen Sie die Zellen in eine 15 Zentimeter große Schale.
Sammeln Sie das konditionierte Medium aus den kultivierten Fibroblasten in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das konditionierte Medium bei 300 g für 10 Minuten, um die lebenden Zellen zu pelletieren. Den Überstand in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen und die toten Zellen pelletieren, indem das Röhrchen 10 Minuten lang bei 2.000 g zentrifugiert wird.
Übertragen Sie anschließend den Überstand in ein 38,5-Milliliter-Polypropylenröhrchen und zentrifugieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei 10.000 g, um Organellen, apoptotische Körper und Membranfragmente zu entfernen. Um die Exosomen zu pelletieren, geben Sie den Überstand in ein 38,5-Milliliter-Ultraclear-Röhrchen und zentrifugieren Sie es 1,5 Stunden lang bei 100.000 g. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, so dass etwa ein Milliliter konditioniertes Medium übrig bleibt.
Waschen Sie das Exosomen-Pellet und suspendieren Sie es in bis zu 30 Millilitern eiskaltem PBS. Zentrifugieren Sie die Exosomen erneut bei 100.000 g für 1,5 Stunden. Um die Reinigung abzuschließen, entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und achten Sie darauf, das exosomale Pellet nicht zu stören.
Die Exosom-Pellet-Stufe kann locker sein und sich leicht lösen. Daher sollte die Entfernung des PBS-Überstands sehr vorsichtig mit Hilfe einer 200-Mikroliter-Pipette erfolgen. Suspendieren Sie das Pellet in eiskaltem PBS mit 25 Mikrolitern pro 15-Zentimeter-Schale mit Fibroblasten.
Messen Sie abschließend die Proteinkonzentration mit dem BCA Protein Assay Kit und einem Mikroplatten-Reader bei 562 Nanometern. Dieses Protokoll ist eine hochgradig reproduzierbare und konsistente Methode zur Aufreinigung von Exosomen. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigt die relativ einheitlichen Größen dieser Exosomen.
Der Immunoblot von Exosomenlysaten zeigt ein kanonisches Muster der Proteinexpression und die Abwesenheit von LDH- und Calnexin-Proteinkontaminanten. Die Exosomen wurden durch einen Saccharosedichtegradienten getrennt, und einzelne Fraktionen wurden an einem Western Blot mit Antikörpern gegen Alix, CD9 und CD81 untersucht. Die Exosomen sedimentierten konsistent in den Fraktionen drei bis sechs.
Die isolierten und konzentrierten bioaktiven Exosomen können sowohl für elektronenmikroskopische und massenspektrometrische Analysen als auch für in-vitro- und in-vivo-Aufnahmeexperimente für funktionelle Studien verwendet werden. Dieses Protokoll eignet sich für die Isolierung von Exosomen aus Zellen mit geringer Sekretorie und kann angewendet werden, um die Beteiligung von Exosomen an menschlichen fibrotischen Erkrankungen zu untersuchen.
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Übersicht
Dieses Protokoll veranschaulicht die Isolierung und Kultur von primären Fibroblasten aus dem Gastrocnemius-Muskel erwachsener Mäuse und die Reinigung und Charakterisierung von Exosomen mittels einer Differential-Ultrazentrifugationsmethode in Kombination mit Saccharose-Dichtegradienten, gefolgt von Western-Blot-Analysen. Die Fähigkeit, Exosomen aus primären Fibroblasten zu isolieren, macht diese Methode bedeutsam für die Untersuchung ihres Potenzials als diagnostische Biomarker.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Exosomenforschung
- Fibrotische Erkrankungen
Hintergrund
- Die Isolierung von primären Fibroblasten liefert Einblicke in zelluläre Mechanismen.
- Exosomen spielen eine kritische Rolle in der Zellkommunikation und können als Krankheitsbiomarker dienen.
- Die Technik ermöglicht eine skalierbare Exosomentisolierung aus verschiedenen Geweben.
Verwendete Methoden
- Differential-Ultrazentrifugation zur Exosomentreinigung
- Gastrocnemius-Muskel der Maus als biologisches System
- Western-Blot-Analysen zur Charakterisierung
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Fibroblasten.
- Beobachtung eines konsistenten Sedimentationsmusters von Exosomen durch Saccharosegradienten.
- Nachweis der Abwesenheit von Proteinkontaminanten in gereinigten Exosomen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie etabliert eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von Exosomen, die zum Verständnis fibrotischer Erkrankungen beitragen kann.
- Die Ergebnisse unterstreichen das potenzielle therapeutische Anwendungspotenzial von Exosomen in der Diagnostik.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolating exosomes from primary skeletal muscle fibroblasts enables scalable production of extracellular vesicles for biomarker discovery and functional studies in fibrotic disease models. The protocol supports reproducible purification using differential centrifugation and sucrose density gradients, facilitating downstream applications such as mass spectrometry and electron microscopy. This approach enhances target validation by providing a consistent source of bioactive exosomes for mechanistic de-risking in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fibroblast-derived exosome content to clarify paracrine signaling mechanisms in tissue homeostasis and fibrosis.
- Operational Value: Provides a scalable method to isolate exosomes from primary cells, supporting consistent supply for target pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Purified exosomes yield quantitative protein and lipid profiles suitable for assay standardization and biomarker panel development.
- Operational Value: The method allows for large-volume processing, enabling high-throughput screening of exosome-associated cargo across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Exosomes isolated from disease-relevant fibroblasts support translational biomarker alignment and preclinical functional validation.
- Operational Value: The protocol’s adaptability to various tissues and fluids facilitates cross-model continuity in target de-risking studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from early target biology to preclinical validation, particularly for studies involving stromal cell communication and extracellular vesicle-mediated signaling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on fibroblast exosome roles in fibrosis progression and intercellular signaling.
- Screening: Enables standardized preparation of exosome samples for comparative analysis of cargo composition under varying conditions.
- Analytics: Generates western blot, electron microscopy, and mass spectrometry-ready samples for multi-omic characterization.
- Translational Research: Connects fibroblast exosome isolation to preclinical models of fibrotic disease through consistent, scalable vesicle production.
- Enterprise Reuse: The protocol is adaptable across cell types and tissues, positioning it as a reusable platform for exosome-based biomarker programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability in exosome purity and yield.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized centrifugation and gradient purification steps.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing reliable biomarker candidates from mechanistically relevant cell sources.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of exosome-driven diagnostic or therapeutic avenues based on consistent functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, ultracentrifugation, and western blot techniques.
- Dependent on access to ultracentrifugation equipment and sucrose gradient preparation capabilities.
- Necessitates standardization across teams for consistent exosome yield and purity assessment.
- Adaptation to human or diseased tissue models may require optimization of digestion and culture conditions.
- Practical limitations include potential co-isolation of protein aggregates if gradient steps are not carefully executed.
