Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten
16. Mai 2020
Dieses Protokoll veranschaulicht 1) die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Musculus gastrocnemius der Maus sowie 2) die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen unter Verwendung einer differentiellen Ultrazentrifugationsmethode in Kombination mit Saccharosedichtegradienten gefolgt von Western-Blot-Analysen.
Der Vorteil der Verwendung der differentiellen Zentrifugation für dieses Protokoll besteht darin, dass sie leicht bis zu Litern skalierbar ist und daher ideal für die Isolierung von Exosomen aus primären Fibroblasten ist. Aufgereinigte Exosomen können aus verschiedenen Zelltypen und Geweben gewonnen werden, die aus verschiedenen Krankheitsmodellen isoliert wurden. Die Exosomen können als diagnostische Biomarker verwendet werden.
Diantha van de Vlekkert, Wissenschaftlerin vom Labor d'Azzo, wird dieses Verfahren demonstrieren. Wiegen Sie zunächst die Muskeln der Maus und übertragen Sie sie dann auf eine 10-Zentimeter-Schale. Arbeiten Sie unter einer Biosicherheitshaube und hacken Sie die Muskeln mit Skalpellen, um eine feine Paste herzustellen. Füllen Sie die fein gehackte Muskelpaste in eine 50-Milliliter-Tube und fügen Sie eine Verdauungslösung mit dem 3,5-fachen Volumen pro Milligramm Gewebe hinzu.
45 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um eine vollständige Dissoziation zu erreichen, mischen Sie die Suspension alle 10 Minuten gründlich mit einer 5-Milliliter-Pipette. Um die Aufschlusslösung zu inaktivieren, geben Sie 20 Milliliter DMEM Complete in die Zellsuspension.
Pipettieren Sie durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb aus Nylon, das auf einem 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist, und waschen Sie das Zellsieb dann mit weiteren 5 Millilitern DMEM Complete. Die Zellsuspension bei 300 g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in 10 Millilitern DMEM Complete.
Säen Sie die Zellen in eine 10 Zentimeter große Schale und stellen Sie die Schale dann bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 3 % Sauerstoff in den Inkubator. Die Fibroblastenkulturen der Skelettmuskulatur müssen auf einem niedrigen Sauerstoffgehalt gehalten werden, um physiologische Lichtbedingungen zu gewährleisten. Der Sauerstoffgehalt in der Skelettmuskulatur beträgt etwa 2,5 %Nachdem die Zellen 100 % Konfluenz erreicht haben, kultivieren Sie sie einen weiteren Tag lang, spülen Sie sie dann mit PBS ab und fügen Sie einen Milliliter Trypsinisierungslösung hinzu.
Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang inkubiert haben, stoppen Sie die Trypsinisierung, indem Sie 10 Milliliter DMEM Complete hinzufügen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen dann 10 Minuten lang bei 300 g bei Raumtemperatur. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in 20 Millilitern DMEM und säen Sie die Zellen in eine 15 Zentimeter große Schale.
Sammeln Sie das konditionierte Medium aus den kultivierten Fibroblasten in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das konditionierte Medium bei 300 g für 10 Minuten, um die lebenden Zellen zu pelletieren. Den Überstand in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen und die toten Zellen pelletieren, indem das Röhrchen 10 Minuten lang bei 2.000 g zentrifugiert wird.
Übertragen Sie anschließend den Überstand in ein 38,5-Milliliter-Polypropylenröhrchen und zentrifugieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei 10.000 g, um Organellen, apoptotische Körper und Membranfragmente zu entfernen. Um die Exosomen zu pelletieren, geben Sie den Überstand in ein 38,5-Milliliter-Ultraclear-Röhrchen und zentrifugieren Sie es 1,5 Stunden lang bei 100.000 g. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, so dass etwa ein Milliliter konditioniertes Medium übrig bleibt.
Waschen Sie das Exosomen-Pellet und suspendieren Sie es in bis zu 30 Millilitern eiskaltem PBS. Zentrifugieren Sie die Exosomen erneut bei 100.000 g für 1,5 Stunden. Um die Reinigung abzuschließen, entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und achten Sie darauf, das exosomale Pellet nicht zu stören.
Die Exosom-Pellet-Stufe kann locker sein und sich leicht lösen. Daher sollte die Entfernung des PBS-Überstands sehr vorsichtig mit Hilfe einer 200-Mikroliter-Pipette erfolgen. Suspendieren Sie das Pellet in eiskaltem PBS mit 25 Mikrolitern pro 15-Zentimeter-Schale mit Fibroblasten.
Messen Sie abschließend die Proteinkonzentration mit dem BCA Protein Assay Kit und einem Mikroplatten-Reader bei 562 Nanometern. Dieses Protokoll ist eine hochgradig reproduzierbare und konsistente Methode zur Aufreinigung von Exosomen. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigt die relativ einheitlichen Größen dieser Exosomen.
Der Immunoblot von Exosomenlysaten zeigt ein kanonisches Muster der Proteinexpression und die Abwesenheit von LDH- und Calnexin-Proteinkontaminanten. Die Exosomen wurden durch einen Saccharosedichtegradienten getrennt, und einzelne Fraktionen wurden an einem Western Blot mit Antikörpern gegen Alix, CD9 und CD81 untersucht. Die Exosomen sedimentierten konsistent in den Fraktionen drei bis sechs.
Die isolierten und konzentrierten bioaktiven Exosomen können sowohl für elektronenmikroskopische und massenspektrometrische Analysen als auch für in-vitro- und in-vivo-Aufnahmeexperimente für funktionelle Studien verwendet werden. Dieses Protokoll eignet sich für die Isolierung von Exosomen aus Zellen mit geringer Sekretorie und kann angewendet werden, um die Beteiligung von Exosomen an menschlichen fibrotischen Erkrankungen zu untersuchen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur primärer Fibroblasten aus dem Gastroknemius-Muskel erwachsener Mäuse sowie die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen mittels einer differenziellen Ultrazentrifugation in Kombination mit Saccharose-Dichtegradienten, gefolgt von Western-Blot-Analysen. Die Möglichkeit, Exosomen aus primären Fibroblasten zu isolieren, macht diese Methode bedeutend für die Untersuchung ihres Potenzials als diagnostische Biomarker.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Exosomenforschung
- fibrotische Erkrankungen
Hintergrund
- Die Isolierung primärer Fibroblasten liefert Einblicke in zelluläre Mechanismen.
- Exosomen spielen eine entscheidende Rolle bei der Zellkommunikation und können als Biomarker für Krankheiten dienen.
- Die Methode ermöglicht die skalierbare Isolierung von Exosomen aus verschiedenen Geweben.
Verwendete Methoden
- Differentielle Ultrazentrifugation zur Exosomenreinigung
- Mäusemusculus gastrocnemius als biologisches System
- Western-Blot-Analysen zur Charakterisierung
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Fibroblasten.
- Beobachtung eines konsistenten Sedimentationsmusters von Exosomen in Saccharose-Gradienten.
- Nachweis des Fehlens von Proteinverunreinigungen in gereinigten Exosomen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von Exosomen, die zum Verständnis fibrotischer Erkrankungen beitragen könnte.
- Die Ergebnisse unterstreichen das therapeutische Potenzial von Exosomen in der Diagnostik.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung von Exosomen aus primären skelettmuskulären Fibroblasten ermöglicht die skalierbare Produktion extrazellulärer Vesikel für die Biomarker-Entdeckung und funktionelle Studien in Modellen fibrotischer Erkrankungen. Das Protokoll unterstützt eine reproduzierbare Aufreinigung mittels Differenzialzentrifugation und Saccharose-Dichtegradienten und erleichtert anschließende Anwendungen wie Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie. Dieser Ansatz verbessert die Target-Validierung, indem er eine konsistente Quelle bioaktiver Exosomen für die mechanistische Entlastung in präklinischer Forschung bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung des Inhalts fibroblasten-abgeleiteter Exosome, um parakrine Signalmechanismen bei der Gewebehomöostase und Fibrose zu klären.
- Operativer Wert: Bietet ein skalierbares Verfahren zur Isolierung von Exosomen aus primären Zellen und unterstützt eine konsistente Versorgung für die Analyse von Zielwegen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Reine Exosome liefern quantitative Protein- und Lipidprofile, die für die Standardisierung von Assays und die Entwicklung von Biomarker-Panels geeignet sind.
- Operativer Wert: Die Methode ermöglicht die Verarbeitung großer Volumina und damit das Hochdurchsatz-Screening von exosomenassoziiertem Frachtmaterial unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Exosome, isoliert aus krankheitsrelevanten Fibroblasten, unterstützen die translationale Biomarker-Abstimmung und die präklinische funktionelle Validierung.
- Operativer Wert: Die Anpassungsfähigkeit des Protokolls an verschiedene Gewebe und Flüssigkeiten ermöglicht eine kontinuierliche Untersuchung über verschiedene Modelle hinweg bei der Entschärfung von Zielrisiken.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der frühen Ziel-Biologie bis zur präklinischen Validierung ein, insbesondere für Studien, die die Kommunikation von Stromazellen und die durch extrazelluläre Vesikel vermittelte Signalübertragung betreffen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Rolle von Fibroblasten-Exosomen bei der Fibroseprogression und der interzellulären Signalübertragung.
- Screening: Ermöglicht die standardisierte Herstellung von Exosomenproben zur vergleichenden Analyse der Frachtzusammensetzung unter verschiedenen Bedingungen.
- Analytik: Erzeugt Proben, die für Western Blot, Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie geeignet sind, zur multi-omischen Charakterisierung.
- Translationale Forschung: Verbindet die Isolierung von Fibroblasten-Exosomen mit präklinischen Modellen fibrotischer Erkrankungen durch konsistente, skalierbare Vesikelproduktion.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Protokoll ist über verschiedene Zelltypen und Gewebe hinweg anpassbar und eignet sich somit als wiederverwendbare Plattform für Exosom-basierte Biomarkerprogramme.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem die Variabilität von Exosomenreinheit und -ausbeute verringert wird.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit durch standardisierte Zentrifugations- und Gradientenreinigungsschritte sicher.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem zuverlässige Biomarker-Kandidaten aus mechanistisch relevanten Zellquellen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung exosomenbasierter diagnostischer oder therapeutischer Ansätze auf Grundlage konsistenter funktioneller Daten.
Durchführungsaspekte
- Benötigt Fachkenntnisse in der Kultur primärer Zellen, der Ultrazentrifugation und der Western-Blot-Technik.
- Hängt von der Verfügbarkeit von Ultrazentrifugationsgeräten und der Fähigkeit zur Herstellung von Saccharose-Gradienten ab.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen den Arbeitsgruppen, um eine konsistente Ausbeute und Reinheit von Exosomen sicherzustellen.
- Die Anpassung an humanes Gewebe oder Krankheitsmodelle kann eine Optimierung der Verdauungs- und Kulturbedingungen notwendig machen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die mögliche Mitisolation von Proteinaggregaten, falls die Gradientenschritte nicht sorgfältig durchgeführt werden.
