Name: Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Erfahren Sie, wie Massenspektrometrie die Ubiquitylierung von EYFP-markiertem CENP-A identifiziert. Diese Methode nutzt Immunpräzipitation und Protein-A-Perlen, um essenzielle Ubiquitylierungsstellen wie Lysin 306 aufzudecken.

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Wir danken Chao-Jun Li vom Model Animal Research Center der Universität Nanjing für die Analyse der Massenspektrometrie. Wir danken Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa und aktuellen Forschern am Model Animal Research Center, der Nanjing University und dem Greehey Children es Cancer Research Institute für ihre hilfreiche Diskussion, experimentelle Beratung und Reagenzien. Wir danken Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago und Dawn S. Chandler für ihre großzügigen Reagenziengeschenke. Y.N. wurde vom Jiangsu Province ''Double-First-Class'' Construction Fund, Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu Province 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Province "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) und National Natural Science Foundation in China (31970665) unterstützt. Diese Studie wurde teilweise durch das NGI-Stipendium R21 CA205659 unterstützt.

<ol><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li>
<li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li>
<li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li>
<li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment%2C+Maintenance%2C+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li>
<li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+CENP-A%3A+marks+of+distinction%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li>
<li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li>
<li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).</li>
<li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratrico+peptide+repeat+interactions%3A+to+TPR+or+not+to+TPR%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li>
<li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li>
<li>Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Hier beschrieben wir Methoden der Massenspektrometrie-Analyse, um die Ubiquitylierung von EYFP-CENP-A K124R Mutant zu identifizieren, was darauf hindeutet, dass das EYFP-Tagging eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin im CENP-A K124R Mutant protein8induziert. In unseren Ergebnissen haben wir erfolgreich die Ubiquitylierung auf Lysin 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R identifiziert, was Lysin 56 (K56) in CENP-A durch Massenspektrometrieanalyse entspricht. Die hier beschriebene Massenspektrometrie...

In den meisten Eukaryoten müssen Spindelmikrotubuli an einer einzigen Region jedes Chromosoms, die als Zentromer bezeichnet wird, befestigt werden. Der Kinetochor ist ein Komplex von Proteinen, die sich am Zentromer befinden. Die Untersuchung des Timings der Bewegungen von Zentromer und Kinetochorei und der Struktur von Kinetochoren und Zentromeren ist wichtig für das Verständnis der Chromosomeninstabilität (CIN) und der Krebsprogression. Die wichtigsten Fragen sind, wie die chromosomale Lage und Funktion eines Zentrimers (d.h. die Zentromeridentität) bestimmt wird und wie sie an der genauen Chromosomensegregation beteiligt sind. Bei den meisten Arten definiert das Vorhandensein eines speziellen Nukleosoms, das ein spezifisches Histon-ähnliches Protein namens CENP-A enthält, die Zentromeridentität. Daher wird vorgeschlagen, dass CENP-A der Nicht-DNA-Indikator (epigenetische Markierung) der Zentrimeridentität ist. Es ist wichtig, den Mechanismus zu klären, wie CENP-A die Zentromeridentität beim Menschen definiert.
Das Holliday Junction Recognition Protein (HJURP) ist der CENP-A-spezifische Chaperon, der CENP-A in zentromere Nukleosomen1,2,3ablagert. Wir haben bereits berichtet, dass die CUL4A-RBX1-COPS8 E3 Ligase für die CENP-A-Ubiquitylierung auf Lysin 124 (K124) und Zentromerlokalisierung4erforderlich ist. Außerdem zeigten unsere Ergebnisse, dass die Zentromerrekrutierung von neu synthetisiertem CENP-A bereits bestehende, ubiquitylierte CENP-A5erfordert. So wurde ein Modell zur Verfügung gestellt, das darauf hindeutet, dass die CENP-A-Ubiquitylierung durch Dimerisierung zwischen Zellteilungen vererbt wird.
Im Gegensatz zu unseren Erkenntnissen und denen von Yu et al. wurden kürzlich negative Ergebnisse in Bezug auf das CENP-A und seine zentromere Lokalisierung veröffentlicht6. Der Artikel behauptete, dass CENP-A-Modifikationen an Lysin 124 (K124) für die Etablierung, Wartung und Langzeitfunktion menschlicher Zentromere entbehrlich sind, basierend auf ihren negativen Ergebnissen, die zeigen, dass die Mutation von K124R weder die CENP-A-Zentromer-Lokalisierungnoch dieZelllebensfähigkeit beeinflusst eklaten. In ihren Ergebnissen und Schlussfolgerungen gibt es jedoch genügend Raum für Debatten, und wir haben bereits in ihrer vorherigen Veröffentlichung7beschrieben, welches Problem es geben könnte. Es sollte darauf geachtet werden, dass sie Proteine mit CENP-A verschmolzen, die viel größere Molekulargewichte haben als die Größe des endogenen CENP-A: Z.B. verschmolzen sie 30 kDa verbessertes gelbes Fluoreszenzprotein (EYFP) zu 16 kDa CENP-A und analysierte EYFP-CENP-A K124R-Fusionsprotein in ihrem RPE-1 CENP-A-/F-Knockout-System.-/F Es wird nicht erwartet, dass K124-Ubiquitin direkt an HJURP auf der Grundlage struktureller Vorhersagen4bindet, jedoch wird die Zugabe von Mono-Ubiquitin einen Einfluss auf die Proteinkonformation von CENP-A haben. Das Protein der CENP-A-Konformation kann durch das Vorhandensein eines großen Fusionsproteins verändert werden, und diese Konformationsänderung kann die strukturellen Veränderungen verschleiern, die durch den Verlust der Ubiquitylierung verursacht werden. Wir schlagen vor, dass die Fusion von großformatigem Protein eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin als K124 in EYFP-CENP-A K124R Mutant induziert und diese Ubiquitylierung an einem anderen Standort den ursprünglichen K124R-Einzelmutanten-Phänotyp hemmt/maskiert. Beweise dafür, dass Ubiquitylierung bei unterschiedlichem Lysin im CENP-A K124R-Mutantenprotein mit einem großen Tag-Protein (EYFP) auftritt, wurde in unserer vorherigen Publikation8berichtet. Es wurde festgestellt, dass EYFP-Tagging eine Ubiquitination einer anderen Lysin-Site von EYFP-CENP-A K124R induziert und dass EYFP-CENP-A K124R Mutant an HJURP bindet. Infolgedessen hemmt/maskiert diese Ubiquitylierung an einem anderen Standort den ursprünglichen K124R-Einzelmutanten-Phänotyp, und sowohl EYFP-CENP-A WT als auch K124R-Mutationzeigten zeigten zentrominische Lokalisation (wir verwendeten und verglichen pBabe-EYFP-CENP-A WT und K124R Mutant, zusammen mit pBabe-EYFP-Steuerung). Die Ergebnisse zeigten, dass mit Flaggen markierte oder nicht markierte CENP-A K124R-Mutationen tödlich sind, aber durch eine Monoubiquitin-Fusion gerettet werden können, was darauf hindeutet, dass Die CENP-A-Ubiquitylierung für die Zelllebensfähigkeit unerlässlich ist.
In den letzten Jahren haben viele Studien verschiedene Assays entwickelt, um posttranslationale Modifikationen (PTMs) von CENP-A-Proteinen und anderen Zentromer-Kinetochor-Proteinen sowohl in vivo als auch in vitro9,10,11zu identifizieren. Analog zu den PTMs von Histonproteinen, die ein wichtiger Mechanismus zur Regulierung der Funktion von Chromatin sind, sind PTMs von zentromerem Chromatin-Komponenten auch an einem wesentlichen Mechanismus zur Regulierung der Gesamtstruktur und Funktion von Zentromeren beteiligt. Die meisten CENP-A PTM-Standorte sind spezifisch für CENP-A-haltige Nukleosomen, obwohl einige von ihnen in Histon H3 konserviert werden, was darauf hindeutet, dass eine Modifikation dieser Rückstände zur zentrominspezifischen Funktion beiträgt. PTMs von CENP-A einschließlich Phosphorylierung, Acetylierung, Methylierung und Ubiquitylierung wurden zuvor9berichtet, was darauf hindeutet, dass CENP-A einer Vielzahl von PTMs und ihren kombinatorischen Arrays auf seiner Amino-Terminus- und C-Terminus-Histon-Domäne unterworfen ist. Die Bedeutung von CENP-A Modifikationen in mehreren Funktionen wurde von vielen Gruppen, einschließlich unserer, deutlich. Diese Funktionen umfassen CENP-A-Ablagerungen an Zentromeren, Proteinstabilität und Rekrutierung des CCAN (konstitutives Zentromer-assoziiertes Netzwerk)9. Allerdings werden begrenzte Studien und Ergebnisse von CENP-A PTMs vorgeformt, wenn Vergleiche mit einem kanonischen Histon enden, die ihre Funktion direkt oder indirekt regulieren. Technische Berichte, die sich auf die Methodik zur Identifizierung dieser CENP-A-PTMs konzentrieren, sind ebenfalls begrenzt.
Da CENP-A-Ubiquitylierung für die CENP-A-Abscheidung am Zentromer12erforderlich ist, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung5vererbt wird und für die Zelllebensfähigkeit8unverzichtbar ist, wäre die Methode zur Identifizierung der CENP-A-Ubiquitylierung in Zukunft unerlässlich, um die funktionelle Aktivität, Positionierung und Struktur des Zentromers zu untersuchen. Daher beschreiben wir hier die Massenspektrometrieanalyse, um die Ubiquitylierung von EYFP-CENP-A K124R Mutant zu identifizieren, was darauf hindeutet, dass das EYFP-Tagging eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin im CENP-A K124R Mutant protein8induziert. Protokolle anderer Kontrolltests und -analysen (Immunfluoreszenzanalyse, Kolonie-Auswuchs-Assay und In-vivo-Ubiquitylierungstest) werden ebenfalls vorgestellt, um die Ergebnisse der großen Massenspektrometrie-Analyse richtig zu diskutieren.

<table><tbody><tr><td>Equpiments/Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Protein-Röhrchen mit geringer Bindung</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td>Für die massenspektrometrische Analyse</td></tr><tr><td>10-cm-Zellkulturschale</td><td>BIOFIL/JET, China</td><td>700224</td><td>10-cm-Gewebekulturschale (Yohei Lab, PN63)</td></tr><tr><td>6-Well-Zellkultur-Cluster</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6-Well-Kultur Platte</td></tr><tr><td>CentriVap</td><td>LABCONCO-Benchtop</td><td></td> <td>Vakuumkonzentrator für Vakuum trockene Peptide für die Massenspektrometrie</td></tr><tr><td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &mu; m</td><td>Eksigent Technologies</td><td>805-00120</td><td>Säule für die Flüssigkeitschromatographie (RPLC) für die Massenspektrometrie-Analyse</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x Öl-Tauchlinse</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X Öl-Tauchlinse</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x Öl-Tauchlinse</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X Öl-Tauchlinse</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td><td>EMD Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>Leica DM IRE2 motorisiertes Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica-motorisiertes</td><td></td> <td>Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Leica EL6000 kompakte Lichtquelle</td><td>Leica</td><td></td><td>Externe Lichtquelle für Fluoreszenzanregung</td></tr><tr><td>Micro Deckglas (22 mm x 22 mm)</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>Deckglas (22 mm x 22 mm)</td></tr><tr><td>Modell V16-2 Polyacrylamid-Gelelektrophoresegerät</td><td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td><td>31071010</td><td>Gelelektrophoresegerät I zur Anwendung größerer SDS-PAGE Gel</td></tr><tr><td>nanoLC.2D</td><td>Eksigent</td><td></td> <td>Technologies-Flüssigkeitschromatographiesystem für die massenspektrometrische Analyse</td></tr><tr><td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Fisher NP0335BOX</td><td></td><td>Die kommerziell erhältlichen 4%-12% Bis-Tris Proteingele für die massenspektrometrische Analyse</td></tr><tr><td>Olympus FLUOVIEW FV3000 konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td></td> Olympus-Konfokales <td>Laser-Scanning-Mikroskop (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ Downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 Degitale CCD-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B CCD-Kamera</td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Binding Site</td><td>AD100.1</td><td>Für eine wasserabweisende Barriere bei Immunfluoreszenzfärbungen</td></tr><tr><td>GEWEBE KULTURSCHALEN 10CM</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td>10 cm Gewebekulturschale</td></tr><tr><td>Vertikale Elektrophorese für den Gellauf (große Größe)</td><td>Junyi, China</td><td>JY-SCZ6+</td><td>Gelelektrophoresegerät II zum Auftragen von größerem SDS-PAGE-Gel (Yohei lab, PE23)</td></tr><tr><td>VWR Mikro-Objektträger, mattiert</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Mikro-Objektträger</td></tr><tr><td><stark>Primäre Antikörper</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CENP-A-Antikörper</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Monoklonaler Maus-Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-CENP-B-Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Monoklonaler Maus-Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>ABCAM</td><td>ab37168</td><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Invitrogen</td><td>PA1987</td><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-GFP-Antikörper</td><td>ANTI #76 (hausgemachter Antikörper)</td><td></td><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper</td></tr><tr><td>anti-HA (3F10)</td><td>Roche</td><td>11815016001</td><td>Ratte monoklonaler Antikörper</td></tr><tr><td>anti-HJURP</td><td>Proteintech Group</td><td>15283&ndash; 1-AP</td><td>Kaninchen polyklonaler Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitin</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-317A-1</td><td>Kaninchen Polyklonale Antikörper</td></tr><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Kommerzielles Proteinassay-Reagenz I zur Messung der Proteinkonzentration (kompatibel mit 0,1% SDS)</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Ultraschallgerät</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics Ultraschallgerät Mikrospitzenstufe, massiv, Gewinde 9,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33995-325</td><td>Disruptorhorn für die Beschallung</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics Ultraschallgerät Microtip Tapered 6,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33996-185</td><td>Microtip für die Beschallung</td></tr><tr><td>Puffer A1</td><td>-</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5 % Nonidet P-40; 0,5 % Desoxycholat; 0,5 % SDS; 1 mM EDTA; vollständiges EDTA-freies Proteaseinhibitor-Reagenz</td></tr><tr><td>Vollständiger EDTA-freier Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Roche</td><td>11-873-580-001</td><td>Vollständiges EDTA-freies Proteaseinhibitor-Reagenz für Puffer A1</td></tr><tr><td>Coomassie brilliant blue R-250</td><td>BBI Life Sciences</td><td>CAS 6104-59-2</td><td>Coomassie-blaue Lösung für die massenspektrometrische Analyse</td></tr><tr><td>Kristallviolett-Lösung (2,3 % Kristallviolett, 0,1 % Ammoniumoxylat, 20 % Ethanol)</td><td>SigmaI-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td>Für die Koloniefärbung</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Für die Kernfärbung</td></tr><tr><td>DMEM: F12 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>DMEM: F12 Medium</td></tr><tr><td>Fetal Rinderserum, zertifiziert, Hitze inaktiviert, aus den USA</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (fötales Rinderserum)</td></tr><tr><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt (Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Transfektionsreagenz I für die chemische Transfektion</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000, P3000 Lösung</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Transfektionsreagenz II für die chemische Transfektion</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>Fixierung fettfreies</td></tr><tr><td>Milchpulver (zugelassener Ersatz für Nelkenpulver)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (Bestellnummer 190915; Los # 90629)</td><td>Fettfreie Magermilch</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>Reduziertes Serummedium</td></tr><tr><td>p-Phenylendiamin</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Zum Einbetten</td></tr><tr><td>von Medium Penicillin, Streptomycin; Flüssigkeit</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penicillin-Streptomycin</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin SOLUTION</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poly-L-Lysin, 0,1 % w/v, in Wasser</td></tr><tr><td>Polyethylenimin [PEI]; 1,0 mg/ml</td><td>Polysciences</td><td>23966 2</td><td>Transfektionsreagenz III für die chemische Transfektion</td></tr><tr><td>Protein A-Sepharose CL-4B-Kügelchen</td><td>GE Healthcare/Amersham</td><td>17-0963-03</td><td>Protein A-Sepharose-CL-4B-Kügelchen für In-vivo-Ubiquitylierungsassays mit pQCXIP-EYFP-CENP-A</td></tr><tr><td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21059</td><td>Western Blot Stripping Buffer I</td></tr><tr><td>Trypsin Promega</td><td></td><td>V5111</td> <td>SequenzierqualitätFür die massenspektrometrische Analyse</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Substrat mit maximaler Empfindlichkeit</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Ultra-sensitives Substrat mit verbesserter Chemilumineszenz (ECL)</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled</td><td>Water Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Steriles Wasser in Gewebekulturqualität</td></tr><tr><td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6,85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td><td>-</td><td>-</td><td>Western Blot Stripping Buffer II</td></tr><<tr><td>strong>Sekundärantikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life</td><td>Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper)</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition FV31S-SW software</td><td>Olympus-Sofware</td><td></td> <td>C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ Downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>Analyse FV31S-DT Software</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ Downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>cellSens Dimension Software Ver. 1. 18</td><td></td> <td>Olympus-Sofware</td> <td>C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td></tr><tr><td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td><td>LI-COR Biosciences-Software</td><td></td> <td>D</td></tr><tr><td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>Chemilumineszenz-Imager für den Immunoblot-Nachweis</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Infrarot-Bildgebungssystem</td><td>LI-COR</td> Biosciences-Infrarot-Bildgebungssystem <td></td><td>für den Immunoblot-Nachweis</td></tr><tr><td>OpenCFU-Sicherheitsware</td><td>-</td><td></td><td>-Für die Koloniezählung (http://opencfu.sourceforge.net/)</td></tr><tr><td>Openlab Version 5.5.2. Wissenschaftliche Bildgebungssoftware</td><td>Improvision/PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>A</td></tr><tr><td>ProteinPilot Software Version 4.5</td><td>AB SCIEX-Software</td><td></td> <td>F für massenspektrometrische Analysen</td></tr><tr><td>Quantity One 1-D Analysesoftware</td><td>Bio-Rad-Software</td><td></td> <td>E</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600+ System</td><td>AB SCIEX-Massenspektrometrie-Gerät</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity Version 6.3 3D-Bildanalysesoftware (Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B1</td></tr><tr><td>Volocity Version 6.3 3D-Bildanalysesoftware (Volocity Quantification)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B2</td></tr></tbody></table>

massenspektrometrieanalyse zur identifizierung der ubiquitylierung von eifp-a mit eyfp-tags (eyfp-cenp-a)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Die Untersuchung der Struktur und Dynamik von Kinetochoren und Zentromern ist wichtig für das Verständnis der chromosomalen Instabilität (CIN) und der Krebsprogression. Wie die chromosomale Lage und Funktion eines Zentrimeros (d.h. die Zentromeridentität) bestimmt werden und an einer genauen Chromosomensegregation beteiligt sind, ist eine grundlegende Frage. CENP-A wird als Nicht-DNA-Indikator (epigenetische Simerung) der Zentromeridentität vorgeschlagen, und CENP-A-Ubiquitylierung ist für die CENP-A-Abscheidung am Zentromer erforderlich, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung vererbt und für die Zelllebensfähigkeit unverzichtbar ist.
Hier beschreiben wir die Massenspektrometrie-Analyse, um die Ubiquitylierung von EYFP-CENP-A K124R Mutant zu identifizieren, was darauf hindeutet, dass die Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin aufgrund der EYFP-Tagging im CENP-A K124R mutierten Protein induziert wird. Lysin 306 (K306) Ubiquitylierung in EYFP-CENP-A K124R wurde erfolgreich identifiziert, was Lysin 56 (K56) in CENP-A durch Massenspektrometrieanalyse entspricht. Ein Vorbehalt wird bei der Verwendung von GFP/EYFP oder der Kennzeichnung von hochmolekularem Protein als Werkzeug zur Analyse der Funktion eines Proteins diskutiert. Aktuelle technische Grenzwerte werden auch für den Nachweis von ubiquitylierten Bändern, die Identifizierung von standortspezifischer Ubiquitylierung(n) und die Visualisierung der Ubiquitylierung in lebenden Zellen oder einer bestimmten Einzelzelle während des gesamten Zellzyklus diskutiert.
Die hier vorgestellte Methode der Massenspektrometrieanalyse kann auf humanes CENP-A-Protein mit verschiedenen Tags und anderen Zentromer-Kinetochor-Proteinen angewendet werden. Diese kombinatorischen Methoden, die aus mehreren Assays/Analysen bestehen, könnten Forschern empfohlen werden, die daran interessiert sind, funktionelle Rollen der Ubiquitylierung zu identifizieren.

EYFP-CENP-A K124 Mutant zeigt Ubiquitylierung, Wechselwirkung mit HJURP, und keine Defekte in der Zentromerlokalisierung weder Zelltod. Hier wurde das von Fachinetti et al. (2017)6 gemeldete System neu konstituiert: In diploiden menschlichen (RPE-1) Zellen, die ein gestörtes und ein ''floxed'' CENP-A Allel (CENP-A-/F) tragen, wurde EYFP-CENP-A aus dem pBabe-EYFP Retrovirusvektor exprimiert. In diesem System könnte die Expression des endogenen CENP-A au...

CENP-A-Ubiquitylierung ist eine wichtige Voraussetzung für die CENP-A-Ablagerung am Zentromer, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung vererbt und für die Zelllebensfähigkeit unverzichtbar ist. Hier beschreiben wir die Analyse der Massenspektrometrie, um die Ubiquitylierung des MIT EYFP markierten CENP-A-Proteins (EYFP-CENP-A) zu identifizieren.

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Diese Methode ermöglicht es, die Ubiquitylierung von EYFP-markiertem CENP-A-Protein zu identifizieren. Es kann auch auf menschliches CENP-A-Protein mit verschiedenen Tests und anderen Proteinen angewendet werden. Der Hauptvorteil besteht darin, dass es zur Identifizierung von EYFP CENP-A K124R allgegenwärtigen Standorten mit entscheidender biologischer Bedeutung verwendet werden kann.Es könnte erweitert werden, um die post-translationalen Modifikationen einer breiten Palette von funktionellen Proteinen zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Herstellung von Protein A Perlen mit Anti-GFP-Antikörper gebunden. Waschen Sie 25 Mikroliter Protein A Perlen pro Immunpräzipitationsreaktion mit Puffer A1 mindestens dreimal, um das Ethanol zu entfernen.Dann erstellen Sie eine 50%perlen Lösung mit Puffer A1. Fügen Sie zwei Mikroliter Anti-GFP-Antikörper zu den Perlen hinzu. Fügen Sie dann Puffer A1 bis das 20-fache des Netto-Perlenvolumens hinzu. Führen Sie die End-to-End-Rotation bei vier Grad Celsius für vier bis 18 Stunden durch.Die optimale Dauer der Rotation muss empirisch anhand der Wirksamkeit der Immunpräzipitation bestimmt werden. Zentrifugieren Sie nach der Rotation die Perlen eine Minute lang mit 100 mal g und entfernen Sie den ungebundenen Überstand. Fügen Sie Puffer A1 hinzu, um eine 50%ige Lösung von Perlen zu machen und verwenden Sie 25 Mikroliter dieser Lösung für jede Immunpräzipitationsreaktion.Um die Immunpräzipitation durchzuführen, Lysezellen in Puffer A1 durch Beschallung und Einfrieren/Tauen. Messen Sie die Proteinkonzentrationen und normalisieren Sie die Proteinmengen zwischen den verschiedenen IP-Proben. Entfernen Sie dann 5 % der Probe aus jedem Rohr, das auf der SDS-Seite ausgeführt werden soll.Mischen Sie den Rest des Lysats mit 25 Mikroliterprotein A Perlen, die an Anti-GFP-Antikörper gebunden sind, und führen Sie eine End-to-End-Rotation bei vier Grad Celsius für vier bis 18 Stunden durch. Nach der Lysierung von Zellen in Puffer A und der Durchführung von Immunpräzipitation, wie zuvor beschrieben, halten Sie 10% der gesamten Immunpräzipitantien, um die EYFP CENP-A-Ubiquitylierung zu bestätigen und die Position des ubiquitylierten EYFP CENP-A genau zu bestimmen. Verwenden Sie die anderen 90 % für die Massenspektrometrieanalyse.Führen Sie die Massenspektrometrieprobe in einem handelsüblichen 4-12%Bis-Tris-Proteingel aus. Führen Sie dann Coomassie blaue Färbung und Verbrauch die 50-70 Kilodalton Gel Region für Massenspektrometrie-Analyse. Jede Gelscheibe in kleine Stücke schneiden und in eine 0,5 Milliliter-Protein-Bindungsröhre geben.Waschen Sie die Gelstücke mit 100 Mikroliter 50%Acetonitril in 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat. Wirbel sie für 10-15 Minuten. Dann drehen Sie sie nach unten und entsorgen Sie den Überstand.Nach der letzten Wäsche die Gelstücke 30 Minuten lang mit einem Tischvakuumkonzentrator trocknen. 10 Mikroliter 10 Nanogramm pro Mikroliter Sequenzierung sezieren und die Gelstücke fünf Minuten rehydrieren lassen. Dann fügen Sie 25 Millimolar Ammonium bicarbonat, gerade genug, um die Gelstücke zu bedecken und verdauen sie bei 37 Grad Celsius über Nacht.Am nächsten Tag den verdauten Überstand in ein sauberes 0,65 Milliliter Silikonrohr geben und 50% Acetonitril und 5%Ameisensäurelösung hinzufügen. Wirbeln Sie die Probe für 10 Minuten. Dann drehen Sie es nach unten und übertragen Sie den Überstand in ein Extraktionsrohr.Konzentrieren Sie die Probe wieder auf zwei Mikroliter. Dann fügen Sie acht Mikroliter 3%Acetonitril und 2%Ameisensäurelösung hinzu. Wirbeln Sie es für 15 Minuten und drehen Sie es bei 16.000 mal g für 30 Minuten.Führen Sie die MS-Datenerfassung mit LC-MS/MS mithilfe eines Flüssigchromatographiesystems in Verbindung mit einem Massenspektrometriegerät durch. Injizieren Sie acht Mikroliter der Probe in eine Flüssigchromatographiesäule der Umkehrphase und trennen Sie die Peptide mit einem Gradienten von 2-80% des Lösungsmittels B in 60 Minuten nach Manuskriptanweisungen. Sammeln Sie Massenspektrometriedaten mithilfe des datenabhängigen Erfassungsmodus.Öffnen Sie die kommerzielle Software, um Massenspektrometriedaten auf dem Desktop zu analysieren. Um eine neue Suche zu starten, klicken Sie auf die LC-Schaltfläche im oberen Menü. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Hinzufügen, um die ursprünglichen MS-Rohdatendateien hochzuladen.Wählen Sie die menschliche Protein-ID in der Paragon-Methode als Datenbanksuchmethode aus und durchsuchen Sie die ursprünglichen MS-Rohdatendateien mit der UniProt homo sapiens-Datenbank. Wählen Sie Trypsin als Verdauungsenzym und legen Sie den Rest der Parameter entsprechend den Manuskriptrichtungen fest. Geben Sie den Dateinamen der Ergebnisse ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern als rechts im Menü.Wählen Sie dann einen Ordner zum Speichern der Suchergebnisse aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern. Klicken Sie auf die Prozessschaltfläche, um die Suche zu starten. Nach Dem Ende der Suche werden Daten mit dem eingegebenen Suchnamen automatisch im ausgewählten Ordner gespeichert.Um MS/MS-Spektren eines bestimmten Peptids zu erhalten, öffnen Sie die Suchergebnisse in Software F.Dann klicken Sie auf das Protein in der Proteinliste im oberen Menü und klicken Sie auf das Peptid im mittleren Menü. Die MS/MS dieses Peptids werden unten im Menü angezeigt. Um die MS/MS-Spektren zu exportieren und zu speichern, kopieren Sie die Spektren und fügen Sie sie in ein geeignetes Dateiformat ein.Genkonstrukte des EYFP CENP-A Wildtyps oder K124R-Mutanten, das den Verlust des endogenen CENP-A rettet, wurden bei der retroviralen Integration stabil ausgedrückt. Die Expression der endogenen CENP-A wurde sieben Tage nach der Induktion der Cre-Rekombination nicht nachgewiesen. Sowohl eyFP CENP-A Wildtyp und K124R Proteinexpression wurde gefunden, um auf einem ähnlichen Niveau wie das ursprüngliche endogene CENP-A Protein zu sein.Sowohl EYFP CENP-A Wildtyp als auch K124R-Mutanten zeigten sieben Tage nach der Störung der verbleibenden Expression des endogenen CENP-A eine Zentromerlokalisierung. Der EYFP CENP-A Wildtyp und der K124R Mutant zeigten Ubiquitylierung und Interaktion mit HJURP im Gegensatz zu gekennzeichneten markierten oder nicht markierten CENP-A-Wild-Typen und dem K124R-Mutanten. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch die Durchführung des Kolonie-Auswuchs-Assays 14 Tage nach der Störung des verbleibenden endogenen CENP-A-Alleels bewertet.Sowohl EYFP CENP-A Wildtyp und K124R Mutanten zeigten eine ähnliche Anzahl von geretteten Kolonien 14 Tage nach der Störung der verbleibenden endogenen CENP-A Allel. Die IP-Massenspektrometrie zeigte die Ubiquitylierung bei Lysin 306 in EYFP CENP-A K124R in CENP-A minus F-Zellen. Insgesamt deuteten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Fusion von großformatigem Protein eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin als K124R in CENP-A induziert, was den ursprünglichen K124R-Einzelmutanten-Phänotyp hemmt.Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, verwenden Sie die handelsüblichen 4%12%Bis-Tris Proteingele, um die Massenspektrometrieproben auszuführen. Fügen Sie den Gelstücken ausreichend Trypsin hinzu und rehydrieren Sie sie, bis alle Enzyme absorbiert sind. Eine niedermolekulare Tagging- oder Sondierungstechnik ist tatsächlich erforderlich, um die Ubiquitylierung zu visualisieren und die räumliche zeitliche Protein-Ubiquitylierung auf der und der gesamten Organismusebene zu untersuchen.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine neuartige Methode, die quantitative Analyse von FRET (Förster Resonance Energy Transfer)-Signale für das Studium Enzymkinetik beschrieben.

Quantitative FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse für SENP1 Protease Kinetics Bestimmung

Diese Handschrift beschreibt den Nachweis von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Kinetochor-Proteinen, Ndc10 und Ndc80, in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Hier berichten wir über Protokolle zum Nachweis endogener und exogener Zentromer-Kinetochor-Proteine in menschlichen Zellen und quantifizieren diese Proteinspiegel an Zentromeren-Kinetochoren durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung durch Verwendung von Fixierung (Paraformaldehyd-, Aceton- oder Methanol-Fixierung).

Immunofluoreszenz-Analyse von endogener und exogener Zentromer-Proteine ​​kinetochore

Untersuchung mehrere, können endogene post-translationalen Modifikationen für ein Zielprotein extrem schwierig sein. Hier beschriebene Techniken nutzen eine optimierte Lyse Puffer und Filter System entwickelt mit spezifischen PTM-targeting, Affinität Matrizen, die Acetylierung, Ubiquitination, Sumoylierung 2/3 und Tyrosin Phosphorylierung Änderungen für ein Ziel zu erkennen Protein mit einem einzigen, gestrafften System.

Nutzung eines umfassenden Immunopräzipitation Bereicherung System um eine endogene Post-translationale Modifikation Profil für Zielproteine zu identifizieren

Cyclin-abhängige Kinase 1 (Cdk1) wird in der G2-Phase des Zellzyklus aktiviert und reguliert viele zelluläre Signalwege. Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine in-vitro- Kinase Assay mit Cdk1, wodurch die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites für zellulare Ziele von diesem wichtigen Kinase.

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für einen Ubiquitylierungsassay eines spezifischen Substrats und einer E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzellen. HEK293T-Zelllinien wurden zur Proteinüberexpression verwendet, das polyubiquitylierte Substrat wurde durch Immunpräzipitation von Zelllysaten gereinigt und in SDS-PAGE aufgelöst. Immunoblotting wurde verwendet, um diese posttranslationale Modifikation zu visualisieren.

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung und Identifizierung krankheitsspezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen aus nativen Zellen und Geweben mit Hilfe chemischer Sonden und Massenspektrometrie ermöglicht. Die resultierenden Interaktionsdatensätze werden über eine spezielle webbasierte Plattform analysiert, um dynamische Netzwerkdysfunktionen und Veränderungen des Signalwegs im Zusammenhang mit Krankheiten aufzudecken.

Kartierung dysfunktionaler Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Krankheiten

Erfahren Sie, wie Massenspektrometrie die Ubiquitylierung von EYFP-markiertem CENP-A identifiziert. Diese Methode nutzt Immunpräzipitation und Protein-A-Perlen, um essenzielle Ubiquitylierungsstellen wie Lysin 306 aufzudecken.

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

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