Synthese von Aptamer-PEI-g-PEG Modifizierte Gold-Nanopartikel, die mit Doxorubicin für die gezielte Arzneimittelabgabe geladen werden

Aufgrund der Arzneimittelresistenz und Toxizität ist der Einsatz von Doxorubicin in der Klinik begrenzt. Dieses Protokoll stellt einen abbaubaren Träger zur Verfügung, um die Freisetzung dieses Therapeutikums aufzubewahren. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass der synthetisierte Träger verwendet werden kann, um das Medikament direkt an Krebszellen abzugeben, wodurch der Zelltod nur in den Krebszellen induziert wird.

Für die CT-PEG-Synthese geben Sie zunächst 1,46 Gramm Bernsteinsäureanhydrid und 209 Milligramm 4-Dimethylaminopyridin in einen 100-Milliliter-Rundkolben. Geben Sie anschließend 15 Milliliter wasserfreies Tetrahydrofuran in den Kolben und setzen Sie einen Glasstopfen in den Kolben ein, bevor die Reaktion 30 Minuten lang bei null Grad Celsius inkubiert wird. Während der Inkubation werden 4,208 g PEG, 1,8 Milliliter Triethylamin und 15 Milliliter wasserfreies Tetrahydrofuran in einen neuen Kolben gegeben und der Kolben mit einem Glasstopfen verschlossen.

Am Ende der Inkubation wird die zweite Lösung mit einer Spritze unter Stickstoffatmosphäre langsam in den ersten Kolben überführt. Rühren Sie die neue Lösung zwei Stunden lang bei null Grad Celsius um, bevor Sie die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur fortsetzen. Am nächsten Morgen wird mit einem Rotationsverdampfer bei 40 Grad Celsius und 0,1 Megapascal die Reaktionslösung konzentriert und das Tetrahydrofuran-Lösungsmittel entfernt.

Nach einer Stunde löst man die Reaktionslösung in 15 Millilitern von 1,325 Gramm Dichlormethan bei Raumtemperatur auf, bevor man 15 Milliliter kalten Diethylether hinzufügt, um das PEG-Diacid-Fällungsprodukt zu erhalten. Anschließend entfernen Sie das Lösungsmittel über Filterpapier und trocknen den Niederschlag 48 Stunden lang unter Vakuum bei Raumtemperatur. Für die PEI-g-PEG-Copolymersynthese werden 305,47 Milligramm des CT-PEG-Niederschlags und fünf Milliliter DMSO in einen neuen Kolben gegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur gerührt, bis sich das CT-PEG vollständig aufgelöst hat.

Als nächstes lösen Sie 49,46 Milligramm EDC in fünf Millilitern DMSO auf und geben Sie die Lösung in den Kolben. Die Reaktion wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor 29,69 Milligramm N-Hydroxysuccinimid und fünf Milliliter DMSO aufgelöst und die resultierende Lösung in den Kolben gegeben wird. Rühren Sie die Reaktion drei Stunden lang bei Raumtemperatur weiter.

Gegen Ende der Inkubation werden 28,6 Mikroliter PEI in 10 Milliliter DMSO aufgelöst und die Lösung tropfenweise in den Kolben gegeben. Rühren Sie die Reaktion mindestens drei Tage lang bei Raumtemperatur um. Am Ende der Inkubation wird die umgesetzte Lösung in einen Dialysebeutel mit einem Grenzwert von 1000 Molekulargewicht überführt und der Beutel in ein Ein-Liter-Becherglas gegeben, das 500 Milliliter Reinstwasser als Dialysat enthält.

Am Ende der Dialyse wird die Lösung in einen Dialysebeutel mit einem Grenzwert von 10.000 Molekulargewicht umgefüllt und der Beutel in ein Ein-Liter-Becherglas mit 500 Millilitern Reinstwasser als Dialysat gegeben. Am Ende der zweiten Dialyse wird die Lösung mit einem Rotationsverdampfer bei 40 Grad Celsius und 0,1 Megapascal konzentriert und die Probe gefriergetrocknet, um das PEI-g-PEG-Pulver zu erhalten. Für die Beschichtung von Goldnanopartikeln mit dem Produkt PEI-g-PEG lösen wir fünf Milligramm des aufbereiteten PEI-g-PEG in fünf Millilitern Reinstwasser in einem neuen Kolben und setzen den Kolben mit einem Glasstopfen ein.

100 Milliliter 0,3 millimolare Aurachloridlösung werden in den Kolben gegeben und die Lösung drei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Farben sollten sofort von hellgelb zu dunkelgelb wechseln. Am Ende der Inkubation wird ein Milliliter eines Milligramms je Milliliter Natriumborhydridlösung in den Kolben gegeben.

Die Farbe sollte sofort von dunkelgelb zu goldgelb wechseln und die Lösung weitere drei Stunden bei Raumtemperatur rühren. Anschließend dialysieren Sie das Reaktionsprodukt mit einem Dialysebeutel mit einem Molekulargewicht von 1000 für drei Tage, wie zur Gewinnung der PEI-g-PEG-beschichteten Goldnanopartikellösung demonstriert. Zur Transplantation von Doxorubicin auf die PEI-g-PEG-beschichteten Goldnanopartikel.

Ein Milliliter Doxorubicinlösung mit 2,2 Milligramm pro Milliliter und 20 Milliliter der mit PEI-g-PEG beschichteten Goldnanopartikellösung werden in einen neuen Kolben gegeben und der Kolben mit einem Glasstopfen versehen. Als nächstes lösen Sie 0,727 Milligramm EDC in einem Milliliter Reinstwasser auf und geben Sie die EDC-Lösung in den Kolben. 0,437 mg N-Hydroxysuccinimid werden in einem Milliliter Reinstwasser aufgelöst und die N-Hydroxysuccinimid-Lösung für eine einstündige Inkubation unter Rühren bei Raumtemperatur in den Kolben gegeben.

Am Ende der Inkubation dialysieren Sie das Reaktionsprodukt drei Tage lang in einem Dialysebeutel mit einem Cutoff-Gehalt von 1000 Molekulargewichten, wie zur Gewinnung der Doxorubicin g-PEI-g-PEG-beschichteten Goldnanopartikellösung demonstriert wird. Zur Transplantation des AS1411 Aptamers auf den DOX-g-PEI-g-PEG. 20 Milliliter der Doxorubicin DOX-g-PEI-g-g-PEG-beschichteten Goldnanopartikellösung werden zu einer optischen Dichtekonzentration von AS1411 mit einer optischen Dichte von etwa vier gegeben.

28,76 mg EDC werden in einem Milliliter Reinstwasser aufgelöst und die EDC-Lösung in den Kolben gegeben. 17,27 mg N-Hydroxysuccinimid werden in einem Milliliter Reinstwasser aufgelöst und die N-Hydroxysuccinimid-Lösung für eine einstündige Inkubation unter Rühren bei Raumtemperatur in den Kolben gegeben. Anschließend dialysiert man das Reaktionsprodukt drei Tage lang in einem Dialysebeutel mit einem Cutoff-Molekulargewicht von 1000, wie zur Gewinnung von AS1411-g-Doxorubicin-g-PEI-g-PEG-beschichteten Goldnanopartikeln gezeigt wurde.

Die Protonen-NMR-Spektroskopie kann verwendet werden, um die erfolgreiche Synthese von CT-PEG-Polymeren und PIE-g-PEG-Copolymeren zu bestätigen. Die Ultraviolettspektroskopie kann durchgeführt werden, um die erfolgreiche Funktionalisierung und allmähliche Beladung von präparierten Copolymeren auf Goldnanopartikeln zu bestimmen. Mit Hilfe der Röntgenphotoelektronenspektroskopie kann die chemische Bindung von Copolymeren an Goldnanopartikeln untersucht werden.

Zur Bestimmung der Größenverteilung der präparierten Nanopartikel kann eine dynamische Lichtstreuung durchgeführt werden. In dieser Analyse zeigte die Transmissionselektronenmikroskopie nicht-geclusterte Nanopartikel mit einer einheitlichen Morphologie. Die Zellviabilitätsanalyse ergab eine Abnahme der A549-Zellzahl im Laufe der Zeit und als Reaktion auf steigende Konzentrationen von Nanopartikeln.

Im Vergleich zur Gruppe der freien Doxorubicine nahmen die Zellzahlen zu, was jedoch auf eine verminderte Toxizität hinweist. Darüber hinaus zeigt die Analyse des Doxorubicin-Freisetzungsprofils, dass die anhaltende Freisetzung von Doxorubicin aus funktionalisierten Nanopartikeln zu einer Abnahme der A549-Zellen führte. Die Vorbereitung des PEI-g-PEG-Copolymers und die Transplantationsschritte AS1411 sind wichtig für den Erfolg der Durchführung des Verfahrens.

Der gleiche Wirkstoffträger kann durch die Transplantation von AS1411 vor der Transplantation von Arzneimitteln erreicht werden, aber die Effizienz der Wirkstoffbeladung wird verringert.