Herstellung von Zero Mode Waveguides für die hochkonzentrierte Einzelmolekülmikroskopie
12. Mai 2020
Hier wird eine Nanosphärenlithographiemethode zur parallelen Herstellung von Nullmoduswellenleitern beschrieben, bei denen es sich um Arrays von Nanoaperturen in einem metallbeschichteten Glasmikroskopie-Coverlip für die Einzelmolekülbildgebung bei nano- bis mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren handelt. Die Methode nutzt die Kolloidalkristall-Selbstorganisation, um eine Hohlleiterschablone zu erstellen.
Das hier vorgestellte Nanosphären-Lithographie-Protokoll zur Herstellung von Nullmoden-Wellenleitern ist eine zugängliche, kostengünstige Methode, die keine speziellen Fertigungswerkzeuge oder -einrichtungen erfordert. Diese Methode wird für die Einzelmolekül-Biophysik nützlich sein und es mehr Forschern ermöglichen, Einzelmolekül-Experimente bei biologisch relevanten Konzentrationen von Fluoreszenzreagenzien durchzuführen. Um eine saubere Oberfläche für die Verdunstungsabscheidung kolloidaler Partikel zu schaffen, legen Sie optische Deckgläser aus Borosilikatglas in die gerillten Einsätze eines Coplin-Glasfärbebehälters.
Füllen Sie das Färbeglas mit genügend Aceton, um die Deckgläser abzudecken und das Glas abzudecken. Beschallen Sie das Glas 10 Minuten lang bei 40 Grad Celsius. Gießen Sie das Aceton aus und spülen Sie die Deckgläser dreimal mit destilliertem Wasser aus.
Füllen Sie das Glas nach Wiederholung der Beschallung und des Acetons mit so viel Kaliumhydroxid, dass die Deckgläser bedeckt sind. Beschallen Sie das Glas erneut zugedeckt für 20 Minuten bei 40 Grad Celsius. Spülen Sie die Deckgläser sechsmal mit destilliertem Wasser ab und beschallen Sie sie dann 10 Minuten lang bei 40 Grad Celsius in Ethanol
.Nachdem Sie die Deckgläser dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen haben, nehmen Sie jedes Deckglas vorsichtig mit einer Pinzette am Rand auf. Trocknen Sie jedes Deckglas mit Stickstoffgas und legen Sie jedes saubere, trockene Deckglas und seine eigene Petrischale auf. Zentrifugieren Sie 50 Mikroliter nicht funktionalisierte Polystyrolkügelchen mit einem Mikrometer.
Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie so wenig Wasser wie möglich übrig. Suspendieren Sie die Kügelchen in 50 Mikrolitern Lösungsmittel und mischen Sie sie dann gründlich durch Pipettieren. Um eine Feuchtigkeitskammer für die Abscheidung einzurichten, ordnen Sie sechs Petrischalen in einer Reihe an.
Legen Sie ein Deckglas in jede Petrischale und lassen Sie die Deckel leicht angelehnt, wobei die Deckgläser so positioniert sind, dass sie der Umgebung ausgesetzt sind. Zentrieren Sie ein Hygrometer und einen kleinen elektrischen Ventilator hinter den Petrischalen und erfassen Sie dann die relative Luftfeuchtigkeit im Labor. Füllen Sie ein 200-Milliliter-Becherglas mit 150 bis 200 Millilitern Wasser bei etwa 75 Grad Celsius und stellen Sie das Becherglas hinter den Ventilator.
Schalten Sie den Lüfter ein und decken Sie dann die Petrischale, den Lüfter, den Becher und das Hygrometer mit einem umgedrehten, durchsichtigen Plastikbehälter ab. Wenn die relative Luftfeuchtigkeit 70 bis 75 % erreicht, heben Sie den Vorratsbehälter aus Kunststoff leicht an und schließen Sie schnell die Deckel der Petrischale, um eine Überbenetzung der Deckgläser zu verhindern. Wenn die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer 85 % erreicht, pipettieren Sie fünf Mikroliter der Perlensuspension auf die Mitte jedes Deckglases.
Decken Sie jede Petrischale sofort nach der Ablagerung ab und halten Sie zwischen den Aussagen alles abgedeckt im Vorratsbehälter. Die Raupenabscheidungen sollten so schnell wie möglich abgeschlossen werden, um den Feuchtigkeitsverlust zu minimieren. Wenn die Ablagerungen zu trocken oder nass sind, ist die Kammerfeuchte die wichtigste Variable, die es zu optimieren gilt.
Wenn alle sechs Abscheidungen abgeschlossen sind, notieren Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer und lassen Sie die Kügelchentröpfchen fünf Minuten lang verteilen und trocknen. Um eine gleichmäßige Temperaturoberfläche für das Glühen der Polystyrolperlen zu erhalten, legen Sie eine flache, gefräste Aluminiumplatte auf eine Standard-Keramik-Heizplatte und stellen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 107 Grad Celsius ein, die Glasübergangstemperatur von Polystyrol. Legen Sie ein Deckglas mit der Perlenschablone auf die heiße Aluminiumplatte.
Nachdem Sie es 20 Sekunden lang geglüht haben, entfernen Sie das Deckglas von der Aluminiumplatte und legen Sie es sofort zum Abkühlen auf eine Aluminiumoberfläche mit Raumtemperatur. Durch thermische Verdunstungsabscheidung scheiden Sie 300 Nanometer Kupfer mit einer Geschwindigkeit von zwei Ångström pro Sekunde über Deckgläser ab, die die Raupenschablonen enthalten. Dadurch werden Pfosten in den Zwischenräumen zwischen den Perlen erzeugt.
Um das überschüssige Kupfer von den Perlen zu entfernen, drücken Sie vorsichtig ein Stück Klebeband auf die Oberfläche und ziehen Sie dann das Klebeband langsam ab. Lösen Sie die Styroporkügelchen auf, indem Sie die Deckgläser in Toleun legen und über Nacht stehen lassen. Gehen Sie vorsichtig mit den Deckgläsern um und spülen Sie sie einmal mit Chloroform und zweimal mit Ethanol aus.
Trocknen Sie die Schablonen mit Stickstoff. Legen Sie sie 30 Minuten lang in einen Sauerstoff-Plasmareiniger, um Polymerreste und Verunreinigungen zu entfernen. Durch thermische Verdunstungsabscheidung scheiden Sie drei Nanometer einer Titan-Adhäsionsschicht mit einem Angström pro Sekunde ab und scheiden dann 100 bis 150 Nanometer Aluminium mit vier Angström pro Sekunde um und auf den Kupferpfosten ab.
Stellen Sie sicher, dass sich die Proben während der Abscheidung nicht drehen, wie dies bei einigen Abscheidungseinheiten automatisch der Fall ist. Um die Kupferpfosten aufzulösen, weichen Sie die Deckgläser zwei Stunden lang in Kupferätzmittel ein. Nachdem Sie die Deckgläser in destilliertem Wasser gespült haben, trocknen Sie sie mit Stickstoff und polieren Sie die Oberfläche vorsichtig mit Linsenpapier, um alle Pfosten freizulegen, die noch mit einer Verkleidung bedeckt sind.
Weichen Sie die Deckgläser weitere zwei Stunden in Kupferätzmittel ein, spülen Sie sie dann erneut mit destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie mit Stickstoff. Nach der Oberflächenpassivierung können Nullmoden-Wellenleiter-Deckgläser mit Quarzobjektträgern unter Verwendung von doppelseitigem Klebeband kombiniert werden, um mikrofluidische Durchflusskammern für die Einzelmolekülbildgebung herzustellen. Der Erfolg der kolloidalen Template-Selbstorganisation hängt entscheidend von der relativen Luftfeuchtigkeit ab.
In einer wohlgeformten Schablone ist der Bereich der Perlen kreisförmig mit Rändern, die durch einen undurchsichtigen, mehrschichtigen Ring definiert werden. Bei gut geformten Schablonen sollten die meisten Schablonen hexagonal dicht gepackte Perlen enthalten. Es wird einige Defekte zwischen den Körnern geben, die durch Verklemmen während der Verdunstungssedimentation entstehen.
Nach der Kupferabscheidung und Auflösung der Polystyrolkügelchen sollten die Kupferpfosten einen Durchmesser von unter 150 Nanometern haben. Für eine Kupferabscheidungstiefe von 300 Nanometern sind die Pfosten etwa 250 Nanometer hoch. Nach der Abscheidung der Aluminiumummantelung und der anschließenden Auflösung der Kupferpfosten sollten Wellenleiter durch Rasterkraftmikroskopie sichtbar sein und einen Abstand von etwa 550 Nanometern haben.
Durch das Glühen der Polystyrol-Schablonen für 20 Sekunden wurden Aluminium-Wellenleiter mit einem Durchmesser von 118 Nanometern erzeugt, die klein genug sind, um die Ausbreitung von sichtbarem Licht zu unterbinden. Ein typisches Feld von ZMWs für die Bildgebung umfasst 3.000 Wellenleiter in einem Sichtfeld von 40 x 80 Mikrometern. Die Einzelmolekül-FRET wurde durchgeführt, um die ZMW-Funktionalität zu testen.
Einzelmolekül-FRET-Spuren waren bei allen getesteten Konzentrationen von Cy5-Fluorphor in der Umgebung nachweisbar. Im Vergleich dazu wären einzelne Moleküle nur in TERF-Beleuchtung mit pikomolären bis niedrigen nanomolaren Konzentrationen nachweisbar. Nach der Herstellung von Nullmoden-Wellenleitern können die Bauelemente mit Polymeren passiviert werden, um unspezifische Wechselwirkungen während der Einzelmolekülbildgebung zu reduzieren.
Die Glasböden der Nulltakt-Wellenleiter können auch leicht geätzt werden, um die Emission einzelner Moleküle zu verbessern. Insgesamt wird diese neue Methode zur Herstellung von Nullmoden-Wellenleitern es den Forschern ermöglichen, dynamische biochemische Prozesse wie Transkription oder Translation bei Konzentrationen und Raten zu untersuchen, die näher an denen in der Zelle liegen.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Nanosphären-Lithographie-Methode für die parallele Herstellung von Null-Modus-Wellenleitern, die Einzelmolekül-Bildgebung bei niedrigen Fluoreszenzfarbstoffkonzentrationen ermöglicht. Die Methode nutzt die Selbstorganisation von Kolloidkristallen, um eine Wellenleiter-Vorlage auf einem Glasdeckglas zu erstellen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biophysik
- Nanotechnologie
- Einzelmolekül-Bildgebung
Hintergrund
- Null-Modus-Wellenleiter sind wesentlich für die Untersuchung einzelner Moleküle.
- Herkömmliche Herstellungsmethoden können kostspielig sein und erfordern spezialisierte Werkzeuge.
- Diese Methode zielt darauf ab, den Prozess zu vereinfachen.
- Die Kolloid-Selbstorganisation ist eine vielversprechende Technik zur Herstellung von Nanostrukturen.
Zweck der Studie
- Eine zugängliche Methode zur Herstellung von Null-Modus-Wellenleitern vorzustellen.
- Mehr Forschern die Durchführung von Einzelmolekül-Experimenten zu ermöglichen.
- Studien bei biologisch relevanten Konzentrationen von fluoreszierenden Reagenzien zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Verwendung von optischen Borosilikat-Glasdeckgläsern.
- Sonifizierun in Aceton zur Oberflächenreinigung.
- Verdampfende Abscheidung von kolloidalen Partikeln.
- Erstellung einer Wellenleiter-Vorlage für die Bildgebung.
Hauptergebnisse
- Die Methode ist kostengünstig und erfordert keine spezialisierten Werkzeuge.
- Sie produziert effektive Wellenleiter für die Einzelmolekül-Bildgebung.
- Forscher können Bildgebung bei Nano- bis Mikromolar-Konzentrationen erreichen.
- Das Protokoll ist unkompliziert und reproduzierbar.
Schlussfolgerungen
- Diese Nanosphären-Lithographie-Methode demokratisiert den Zugang zu Einzelmolekül-Bildgebungstechniken.
- Sie eröffnet neue Möglichkeiten für die Forschung in der Einzelmolekül-Biophysik.
- Zukünftige Studien können diese Methode für verschiedene Anwendungen in der Biologie nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method enables single molecule imaging at micromolar fluorophore concentrations, overcoming a key limitation in biochemical assays where background fluorescence restricts usable concentrations to pico- to nanomolar ranges. By facilitating the study of molecular processes at cellular-relevant concentrations and rates, it supports more physiologically relevant target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The accessibility of this low-cost fabrication approach expands the utility of zero mode waveguides beyond specialized core facilities to broader biopharma R&D laboratories.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses and pathway clarification by allowing single molecule observation at concentrations that reflect physiological ligand levels.
- Operational Value: Reduces reliance on expensive nanofabrication equipment, making single molecule enzymology accessible to more discovery teams.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking through direct visualization of single molecule interactions under near-native conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a platform for preparing validated biological systems that enable reliable compound evaluation at higher, more relevant fluorophore concentrations.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through parallel fabrication of thousands of zero mode waveguides using common lab equipment.
- Scalability: Supports platform reuse and scalability for downstream screening workflows by generating uniform waveguide arrays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates the study of dynamic biochemical processes such as transcription or translation at concentrations and rates closer to those in the cell, improving relevance to disease models.
- Mechanistic De-risking: Enables observation of single molecule FRET signals at micromolar concentrations, which are unattainable with traditional total internal reflection fluorescence (TERF) illumination.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports data-driven decisions by providing quantitative, single molecule readouts that clarify mechanism and reduce ambiguity in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification, enabling biophysical characterization that informs compound selection and optimization prior to preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by allowing direct observation of single molecule behavior in complex environments.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible nanostructures with quantitative outputs that enable comparison of ligand binding or enzymatic activity across conditions.
- Analytics: Provides single molecule fluorescence and FRET readouts that offer high-resolution kinetic and mechanistic insights beyond ensemble averages.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical relevance by enabling studies at near-physiological concentrations and molecular crowding conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable fabrication capability that can be shared across departments, reducing dependency on external nanofabrication services.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct single molecule visualization.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and throughput via parallel fabrication using accessible equipment like thermal evaporators and hot plates.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency and enables better go/no-go decisions by generating reliable biophysical data earlier in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic clarity that reduces late-stage attrition due to unexpected biological behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in colloidal self-assembly, thermal evaporation, and surface cleaning protocols.
- Depends on access to a thermal evaporator, hot plate, sonicator, and basic chemistry lab equipment for metal deposition and etching.
- Necessitates standardization of humidity-controlled bead deposition to ensure consistent waveguide template formation.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different substrate materials or waveguide metals (e.g., aluminum vs. gold).
- Includes practical limitations such as sensitivity to relative humidity during bead self-assembly and the need for careful handling to avoid template defects.
