Primärklärung der CHO geernteten Zellkulturflüssigkeit mittels eines akustischen Separators
14. Mai 2020
Hier wird ein Protokoll zur Primärklärung der CHO-Zellkultur mittels eines akustischen Separators vorgestellt. Dieses Protokoll kann für die primäre Klärung von Schüttelkolbenkulturen oder Bioreaktorernten verwendet werden und hat die potenzielle Anwendung für die kontinuierliche Klärung des Zellentlüftungsmaterials während des Perfusionsbioreaktorbetriebs.
Unser Protokoll zeigt, wie ein akustischer Wellenseparator im Labormaßstab für die primäre Trennung von CHO-Zellen aus geernteter Kulturflüssigkeit verwendet wird, die einen monoklonalen Modellantikörper enthält. Die akustische Wellenabscheidung bietet einige Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Primärklärungsmethoden wie Zentrifugation und Filtration, wie z. B. einen geringen Platzbedarf, ein geringes Kontaminationsrisiko und ein geringeres Risiko von Filterverschmutzungen. Da die akustische Wellentrennung einen kontinuierlichen Fluss von zellfreiem Material für nachfolgende Filtrations- und Chromatographieprozesse ermöglicht, besteht ein Potenzial für ihre Anwendung in der kontinuierlichen Bioprozesstechnik.
Um den Schallwellenabscheider vorzubereiten, schließen Sie die Trübungskabel an die entsprechenden Anschlüsse an und schließen Sie die BNC-Kabel für die Kammerleistung an die Rückseite des Schallwellenabscheidersystems an. Setzen Sie die Trübungssonden in das Trübungsmessgerät und das Thermometergehäuse ein und ziehen Sie die Schrauben fest. Verbinden Sie den Zulaufschlauch über die Förderpumpe mit dem Eingang der Zulauftrübung.
Verbinden Sie den Y-Schlauch vom Ausgang der Zufuhrtrübungsöffnung mit der Einlassöffnung der akustophoretischen Kammer. Verbinden Sie den Schlauch der Stufe 1 von der Abfallöffnung der akustophoretischen Kammer über die Pumpe der Stufe 1 mit einem Zellsammelgefäß und verbinden Sie den Schlauch von der Permeatöffnung der akustophoretischen Kammer mit dem Eingang der Trübungsöffnung von Sonde 1. Verbinden Sie dann den Entnahmeschlauch aus der Trübungsöffnung von Sonde 1 mit einem Produktauffangbehälter.
Um das System mit geernteter Zellkulturflüssigkeit zu grundieren, schalten Sie den akustischen Wellenseparator ein und öffnen Sie das zugehörige Softwareprogramm. Klicken Sie im Bereich "Messwerte" auf "Test starten", um die Datenaufzeichnung zu starten. Und verbinden Sie das Ende des Zuführschlauchs mit dem gerührten Gefäß für die geerntete Zellkulturflüssigkeit.
Um die Förderpumpe zu starten, geben Sie die Pumprate ein und drücken Sie die Eingabetaste. Vergewissern Sie sich, dass der Pumpenrichtungspfeil korrekt ausgerichtet ist, um sicherzustellen, dass die Zellflüssigkeit aus dem Gefäß in die akustophoretische Kammer gepumpt wird, und klicken Sie zum Starten auf das Dreiecksymbol. Überwachen Sie die Fütterungstrübungsmessungen im Percent Reduction Panel während der Befüllung der akustophoretischen Kammer.
Wenn die geerntete Zellkulturflüssigkeit ausreichend innerhalb des Zellflüssigkeitsgefäßes gemischt wird, sind die Trübungswerte während der Beladung der Kammer konstant. Sobald sich die Flüssigkeit über dem Piezo-Wandler an der Rückseite der akustophoretischen Kammer befindet, klicken Sie auf Ausschalten, um die Pumpe zu stoppen. Verbinden Sie das andere Ende des BNC-Stromkabels mit der akustophoretischen Kammer.
Sobald die akustophoretische Kammer gefüllt und eingeschaltet ist, ändern Sie die Förderpumpenrate auf die gewünschte Betriebsrate. Um die Piezoleistung der Stufe 1 einzuschalten, schieben Sie die Leiste im Leistungsmodul auf 10 Watt und klicken Sie auf Einschalten.Sobald sich die Zellen am Boden der akustophoretischen Kammer abzusetzen beginnen, starten Sie die Pumpe der Stufe 1 mit einer geeigneten Rate, die auf der Zelldichte und der Förderpumpenrate basiert, während Sie die Schallwellentrennkammern genau beobachten und die Pumpraten nach Bedarf anpassen. Um die gepackte Zellmasse zu berechnen, tarieren Sie eine Waage mit einem leeren 15-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie das Röhrchen mit Aufgabematerial.
Nachdem das Gesamtgewicht des Röhrchens mit Zuschub erfasst wurde, zentrifugieren Sie das Röhrchen und dekotieren Sie den Überstand in einen neuen Behälter. Messen Sie das Gewicht des Rohrs mit dem Zellpellet. Überwachen Sie dann das Trübungsprofil der Trübung des Stadiums 1, während der Überlauf aus der akustophoretischen Kammer in die Trübungssonde 1 eintritt.
Wenn der Lauf beendet ist, stoppen Sie die Zulaufpumpen und die Pumpe der Stufe 1 und schalten Sie die Kammer aus. Trennen Sie das BNC-Netzkabel und sammeln Sie das Produkterntematerial für die nachgelagerte Analyse. Um die restliche Flüssigkeit aus der akustophoretischen Kammer abzulassen, legen Sie den Abfallschlauch in ein leeres Gefäß.
Trennen Sie den Schlauch von den Einlass- und Permeatanschlüssen der akustophoretischen Kammer und lösen Sie den Abfallschlauch vom Pumpenkopf. Wenn die Kammer leer ist, schließen Sie den Schlauch wieder an, setzen Sie den Abfallschlauch wieder in den Pumpenkopf ein und spülen Sie mit einer Förder- und Pumprate von Stufe 1 von 60 Millilitern pro Minute 15 bis 20 Minuten lang deionisiertes Wasser vom Ende des Zulaufschlauchs. Pumpen Sie am Ende der Wasserspülung 15 bis 20 Minuten lang 70 % Isopropylalkohol durch den Schlauch und die Kammer, gefolgt von einer weiteren 15- bis 20-minütigen Spülung mit deionisiertem Wasser.
In dieser repräsentativen Analyse blieben die Trübungsmessungen der Speisetrübungssonde beim Eintritt der geernteten Zellflüssigkeit in die Schallwellenabscheiderkammer konstant, etwa 1000 bis 1100 NTU. Und die Messungen der Trübungssonde von Sonde 1 blieben bei etwa 40 bis 50 NTU. Das Halten der geernteten Zellflüssigkeit über längere Zeiträume in der Kammer führt zu einem Temperaturanstieg, wie in diesem Beispiel eines Temperaturunterschieds von mehr als sechs Grad Celsius der geernteten Zellflüssigkeit vor dem Eintritt in die akustophoretische Kammer und nach der akustischen Trennung.
Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Durchführung von Ernten mit hoher Zelldichte ist die Sättigung der Trübungssonden, da die Trübungsmessungen für die Trübungssonde über 4600 NTU gesättigt werden, was wahrscheinlich zu einer Unterschätzung bei der Berechnung der Zellentfernungseffizienz führt. Darüber hinaus sinkt die Effizienz der Zellentfernung signifikant von etwa 100 % auf 57 %, da die Förderpumpenrate erhöht wird, wobei eine langsamere Förderpumpenrate in der Regel direkt mit einer besseren Zellklärung korreliert. Da sich die Hersteller von biotechnologischen Produkten in Richtung kontinuierlicher Fertigung bewegen, kann der Einsatz der Schallwellentechnologie zusätzliche Anwendungen für die kontinuierliche Bioprozessierung und den Betrieb von Profusion-Bioreaktoren bieten.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung eines akustischen Wellenseparators zur primären Klärung von CHO-Zellkulturen. Es verdeutlicht die Vorteile dieser Methode im Vergleich zu herkömmlichen Techniken, einschließlich ihres Potenzials für kontinuierliche Bioprozessierung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellkultur
- Bioprozessierung
- Trenntechnologien
Hintergrund
- CHO-Zellen werden häufig in der biopharmazeutischen Produktion eingesetzt.
- Herkömmliche Klärmethoden können ineffizient sein und bergen Kontaminationsrisiken.
- Die akustische Wellentrennung bietet eine kompakte und effektive Alternative.
- Diese Methode ermöglicht einen kontinuierlichen Durchfluss und verbessert die nachgeschaltete Verarbeitung.
Zweck der Studie
- Aufbau und Funktionsweise eines akustischen Wellenseparators demonstrieren.
- Die Effizienz der Zellseparation aus Kulturflüssigkeit bewerten.
- Das Potenzial einer kontinuierlichen Klärung in der biotechnologischen Verarbeitung untersuchen.
Verwendete Methoden
- Einrichten des akustischen Wellenseparators mit Trübungsmess- und Stromanschlüssen.
- Überwachung der Trübungswerte während des Trennprozesses.
- Anpassen der Pumpgeschwindigkeiten basierend auf Zelldichte- und Trübungsmessungen.
- Spülen und Reinigen des Systems nach dem Betrieb.
Hauptergebnisse
- Konsistente Trübungsmessungen weisen auf eine wirksame Trennung hin.
- Temperaturerhöhungen treten während längerer Verarbeitungsdauer auf.
- Die Effizienz der Zellenentfernung variiert je nach Zulaufpumpgeschwindigkeit.
- Das Potenzial für den Einsatz in der kontinuierlichen Bioprozessierung wird hervorgehoben.
Schlussfolgerungen
- Die akustische Wellentrennung ist eine geeignete Alternative zu herkömmlichen Methoden.
- Sie bietet Vorteile hinsichtlich Effizienz und Kontaminationsrisiko.
- Weitere Untersuchungen zu ihrer Anwendung in der kontinuierlichen Herstellung sind erforderlich.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die primäre Klärung stellt eine kritische Engstelle in der Bioproduktion dar, bei der herkömmliche Methoden wie Zentrifugation und Filtration Kontaminationsrisiken mit sich bringen, große Platzanforderungen haben und die kontinuierliche Verarbeitung behindern. Die akustische Wellentrennung bietet eine kompakte, kontaminationsarme Alternative, die einen kontinuierlichen Durchfluss geklärter Flüssigkeit ermöglicht und somit die Integration in kontinuierliche biotechnologische Verfahren unterstützt. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagbarkeit in frühen Reinigungsschritten, indem er eine reproduzierbare Zellentfernung gewährleistet und gleichzeitig die betriebliche Komplexität sowie das Risiko der Filterverunreinigung verringert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht eine schnelle Klärung von CHO-Harvests zur downstream-Analyse therapeutischer Proteine wie monoklonaler IgG1.
- Operationaler Wert: Verringert die manuelle Arbeitszeit und das Kontaminationsrisiko im Vergleich zur Zentrifugation und unterstützt eine schnellere Probenauswertung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt ein konsistentes zellfreies Überstandmedium mit geringer Trübung (40–50 NTU), das sich für die zuverlässige Detektion von Analyten in der Assay-Entwicklung eignet.
- Operationeller Wert: Verringert die Filterverunreinigung und -verstopfung, verbessert die Assay-Reproduzierbarkeit und reduziert den Reagenzienverbrauch.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die skalierbare Klärung von Kulturflüssigkeiten zur Erzeugung präklinischen Materials, ohne die Produktintegrität zu beeinträchtigen.
- Operationaler Wert: Erleichtert den Übergang von der Chargen- zur kontinuierlichen Verarbeitung und unterstützt damit die Ziele der Plattformtechnologieentwicklung in der Biologika-Entwicklung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die akustische Wellentrennung ist in die frühe Reinigungsstufe integriert, die nach der Ernte und vor der Tiefenfiltration oder Chromatographie erfolgt, und ermöglicht eine nahtlose Einbindung in kontinuierliche Produktionslinien.
- Entdeckungsbioanalytik: Klärt komplexe Kulturflüssigkeiten, um eine genaue Quantifizierung und Charakterisierung sekretierter Produkte zu ermöglichen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, niedrig-turbulente Ergebnisse, die für eine konsistente Testleistung über verschiedene Screening-Kampagnen hinweg entscheidend sind.
- Analytik: Bietet quantifizierbare Maße zur Trübungsreduktion, die mit der Effizienz der Zellentfernung und der Prozesskonsistenz korrelieren.
- Translationale Forschung: Erhält die Produktausbeute und -integrität und unterstützt die kontinuierliche Bereitstellung von Material für präklinische Toxizitäts- und Wirksamkeitsstudien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt einen modularen, skalierbaren Verfahrensschritt dar, der an verschiedene Zelllinien und Produkttypen in Mehrproduktanlagen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Vorhersagesicherheit hinsichtlich der Klärungseffizienz durch Echtzeit-Turbiditätsüberwachung und eine konsistente Produktgewinnung.
- Operativer Wert: Reduziert den Platzbedarf, eliminiert Zentrifugationsgefahren und minimiert die Filterverunreinigung, wodurch die Betriebskosten gesenkt werden.
- Strategischer Wert: Ermöglicht kontinuierliche Verfahrensschritte, verringert die Variabilität zwischen Chargen und beschleunigt den Technologietransfer.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikobasierte Entscheidungsfindung, indem zuverlässige und skalierbare Klärung bereitgestellt wird, die frühe Aufreinigungsschritte entrisikot.
Durchführungsaspekte
- Erfordert technisches Fachwissen in Fluiddynamik sowie beim Aufbau und der Kalibrierung akustophoretischer Systeme.
- Benötigt die Integration von Trübungsmessung, peristaltischen Pumpen und Temperaturregelungssystemen.
- Erfordert die Standardisierung von Durchflussraten und Leistungseinstellungen über Schichten und Bediener hinweg, um reproduzierbare Leistung zu gewährleisten.
- Muss die Sättigung der Trübungssonde bei hohen Zelldichten (>4600 NTU) berücksichtigen, die die Abscheideeffizienz unterschätzen kann.
- Die Leistung ist durchflussratenabhängig; zu hohe Zulaufgeschwindigkeiten verringern die Zellabscheideeffizienz, weshalb eine Optimierung entsprechend der Erntedichte erforderlich ist.
