Name: In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Lernen Sie die In-vivo-Selektion funktionalisierter Nanopartikel zur gezielten Bekämpfung menschlicher Krebszellen in Zebrafischen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung und Auswahl optimaler Partikel für klinische Anwendungen.

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Die Autoren danken Frau Kaylee Smith, Frau Lauren Kwok und Herrn Alexander Floru für das Korrekturlesen des Manuskripts. H.F. unterstützt die NIH (CA134743 und CA215059), die American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) und die St. Baldrick es Foundation. F.J.F.L. bestätigt ein Stipendium des Boston University Innovation Center-BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer (XTNC). I.S erkennt NSF-Unterstützung (Grant CBET 1605405) und NIH R41AI142890 an.

Alle tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Boston University School of Medicine gemäß dem Protokoll PROTO201800543 genehmigt.
1. Erzeugung von Casper Zebrafisch-Embryonen
<ol><li>Wählen Sie erwachsene Casper-Fische, die mindestens 3 Monate alt sind, um eine natürliche Zucht zu erzeugen, um transparente Casper-Zebrafisch-Embryonen zu erzeugen. Casper</li>
	<li>Füllen Sie am Abend zweikammerige Paarungsbecken mit Fischwasser, trennen Sie die oberen Becken mit Trennwänden, legen Sie einen männlichen Fisch in eine Seite der Kammer und ein oder zwei weibliche Fische in die andere Seite der Kammer und lassen Sie die Fische über Nacht durch Trennwände getrennt.</li>
	<li>Ziehen Sie die Trennwände am nächsten Morgen um 8:00 Uhr heraus, wenn die Lichter an sind. Fügen Sie künstliche Anreicherungsanlagen hinzu und neigen Sie die obere Kammer leicht, um eine flache Wasserfläche zu schaffen. Lassen Sie den Fisch für 3-4 h züchten.</li>
	<li>Heben Sie die oberen Kammern der Paarungstanks an, in denen sich die Fische befinden, und bringen Sie sie in ihre ursprünglichen Tanks zurück.</li>
	<li>Sammeln Sie Eier in den unteren Kammern, indem Sie das Wasser durch ein Netz gießen. Eier in eine sterile Petrischale mit einer Dichte von nicht mehr als 200 Eiern pro Schale übertragen. Entfernen Sie alle toten oder unbefruchteten Eier und füllen Sie die Schale 2/3 voll mit frischem Fischwasser. HINWEIS: Befruchtete und gesunde Eier sollten durchscheinend und rund sein. Alle Eier, die trüb, weiß oder entstellt sind, sollten entfernt werden. Fischwasser wird aus Fischtanks in der Fischanlage gewonnen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Embryonen im Inkubator bei 28,5 °C über Nacht.</li>
	<li>Bleichen Sie die Embryonen am nächsten Morgen mit dem Standardprotokoll, wie in The Zebrafish Book16beschrieben, und legen Sie die Embryonen zurück in den Brutkasten (optionaler Schritt).</li>
	<li>Nehmen Sie die 24 hpf Embryonen am Nachmittag aus dem Brutkasten und dechorionate die Embryonen mit Pronase.<ol>
<li>Entfernen Sie so viel Fischwasser wie möglich aus den Embryonen in der Petrischale und fügen Sie ein paar Tropfen der Pronaselösung (1 mg/ml in Fischwasser) in die Schale. Die Petrischale sanft wirbeln. Sobald die Krähen Anzeichen von Zerfall zeigen, pipette die Embryonen ein paar Mal auf und ab, um die Krähen zu brechen, um die Embryonen freizusetzen.</li>
		<li>Fügen Sie frisches Fischwasser sofort in die Petrischale, um den Prozess zu beenden, sobald ein Großteil der Embryonen aus den Kränzen sind. Spülen Sie die Embryonen 3x mehr mit Fischwasser, um die schwimmenden Krähen zu entfernen. Bringen Sie die Embryonen in den Inkubator zurück.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung menschlicher Krebszellen zur Transplantation
<ol><li>Stellen Sie die Inkubatortemperatur auf genau 35,5 °C ein. Überwachen Sie den Inkubator, um eine konsistente und stabile Temperatur mit einem Thermometer im Inneren des Inkubators zu gewährleisten.</li>
	<li>Autoklav 1 L Fischwasser in einer Glasflasche. Machen Sie eine 3% Agarose-Lösung, indem Sie 3 g Elektrophorese-Grade-Agarose zu 100 ml autoklaviertem Fischwasser und Mikrowaving hinzufügen, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.<ol>
<li>Gießen Sie heiße Agarose-Lösung in eine Petrischale, bis sie 3/4 voll ist. Legen Sie die Mikrospritzform auf die Agarose. Stellen Sie sicher, dass die Form nicht in Kontakt mit dem Boden der Petrischale ist und sich keine Blasen darunter bilden.</li>
		<li>Lassen Sie die Lösung erstarren und entfernen Sie vorsichtig die Form von der Platte. Füllen Sie die Platte mit autoklaviertem Fischwasser und lagern Sie die Platte bei 4 °C. Die Agaroseplatte und das Fischwasser im 35,5 °C-Inkubator vorderwärmen, bevor heLa-Zellen geerntet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ziehen Sie 1,0 mm O.D. x 0,78 mm Borosilikatglaskapillaren auf einen Pipettenzieher mit den folgenden Einstellungen: Druck bei 500, Hitze bei 560, Zug bei 100, Geschwindigkeit bei 100 und Zeit/Verzögerung bei 200. Bewahren Sie Nadeln auf dem Putte in einer großen Petrischale auf, die mit einem Ethanoltuch abgewischt wurde. VORSICHT: Gezogene Nadeln sind sehr scharf und zerbrechlich. Seien Sie vorsichtig bei der Handhabung.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Stammlösung aus Tricainmetsulfonat (MS222, 4 mg/ml) vor, indem Sie MS222 in autoklaviertes Fischwasser auflösen. Wirbel lange vor Gebrauch. Ms222-Stammlösung 1:100 in Fischwasser verdünnen (d. h. 200 l MS222-Stammlösung zu 20 ml Fischwasser zu einer Endkonzentration von 40 g/ml hinzufügen) um Embryonen für die folgenden Verfahren zu anästhesieren.</li>
	<li>Culture hLabel HeLa Zellen durch die Transducing sie mit PLenti6.2_miRFP670 Lentivirus mit dem Protokoll beschrieben17. Ernte RFP+ HeLa Zellen 30 min-1 h vor der Transplantation. HINWEIS: Menschliche HeLa-Zellen wurden in einem Gewebekultur-Inkubator bis zu 70% Konfluenz in vollständigem Wachstumsmedium (DMEM-Medium mit 10% FBS) bei 37 °C kultiviert, ergänzt mit 5%CO2.<ol>
<li>Entfernen Sie das HeLa-Zellmedium durch Aspiration in einer Gewebekulturhaube. Spülen Sie die Zellschicht kurz mit sterilem PBS ab, um alle Spuren des Serums zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 3,0 ml sterile Trypsin-EDTA-Lösung in einen T-75-Kolben und legen Sie die Zellen wieder in den 37 °C Gewebekultur-Inkubator für 3-5 min, um die enzymatische Verdauung zu erleichtern. Beobachten Sie den Kolben unter dem Mikroskop, bis 80 % der Zellen suspendiert werden.</li>
		<li>Fügen Sie 6-8 ml komplettes Wachstumsmedium in den Kolben. Sammeln Sie die Zellen in einem 15 ml sterilen Rohr durch sanfte Pipettierung. Zentrifuge bei 135 x g für 5 min.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie HeLa-Zellen in 3 ml vollständigem Wachstumsmedium wieder aus. Wiederholen Sie den obigen Waschschritt 2x. Setzen Sie die Zellen in 1 ml vollständigem Wachstumsmedium aus und zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit einem Hämozytometer.</li>
		<li>Drehen Sie die Zellen wieder nach unten, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/ml wieder aus. Halten Sie die Zellen warm, indem Sie die Röhre in einer Hand halten, wenn Sie zur Fischanlage transportieren. HINWEIS: Halten Sie die Zellen immer warm, indem Sie die Zellen vor oder während der Injektion der Embryonen im 35,5 °C-Inkubator lagern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Transplantation menschlicher Krebszellen
<ol><li>Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Ethanolhandtüchern vor der Transplantation (z.B. Schere, Pinzette, Kunststoffpipetten, Rasierklingen).</li>
	<li>Richten Sie Embryonen innerhalb der Rillen der Agaroseplatte mit einer Kunststoffpipette aus. Legen Sie Embryonen auf der Seite mit dem vorderen nach vorne gerichteten. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Fischwasser die Embryonen bedeckt. Legen Sie einige Embryonen beiseite, um Krebszellen nicht zu injizieren und als Kontrolle zu verwenden.</li>
	<li>Schalten Sie die Luftquelle und den Mikroinjektor ein. Nehmen Sie HeLa-Zellen aus dem Inkubator und pipette die Zellen 20-30x mit einer P200-Spitze nach oben und unten. Mit einer Gel-Ladespitze mit Schnittende 3 l Zellgemisch sofort in eine Nadel geben. Setzen Sie die Spitze vorsichtig in Richtung des scharfen unteren Endes der Nadel ein. Bei Bedarf schütteln Sie die Nadel, um sicherzustellen, dass die Zellmischung die Nadel nach unten bewegt, um das scharfe Ende zu füllen.<ol>
<li>Setzen Sie die Nadel in den Nadelhalter ein. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze der Nadel vorsichtig aufzubrechen. Stellen Sie den Druck und die Dauer des Mikroinjektors ein, um alle Luftblasen innerhalb der Nadelspitze herauszuschieben. Reduzieren Sie die Druck- und Injektionsdauer, bis die Größe der Injektionströpfchen 1 nL beträgt.</li>
		<li>Legen Sie die Injektionsplatte unter das Mikroskop in eine geeignete Position, um die Dotterseite von Embryonen zur Nadel zu haben. Anästhesisieren Sie die Embryonen durch Zugabe von fünf Tropfen der verdünnten MS222-Lösung (40 g/ml).</li>
		<li>Positionieren Sie den Injektor und lassen Sie die Nadel die Perivitelinhöhle jedes Embryos berühren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injizieren Sie die Zellmischung in die Embryonen im vaskularisierten Bereich unter der Perivitellinehöhle, indem Sie das Fußpedal drücken.</li>
	<li>Verwenden Sie die nicht dominante Hand, um die Injektionsplatte zum nächsten Embryo zu bewegen. Verwenden Sie die dominante Hand, um den Injektor zu verlängern und zurückzuziehen, während Sie gleichzeitig das Fußpedal drücken, um die Injektion fortzusetzen. Pipette ein paar Tropfen steriles Fischwasser auf Embryonen, die injiziert wurden. Sobald die Injektion aller Embryonen auf dem Teller abgeschlossen ist, waschen Sie die Embryonen mit sterilem Fischwasser ab, legen Sie sie auf eine sterile Petrischale und bewegen Sie sie sofort in den 35,5 °C-Inkubator.</li>
	<li>Nach 3 h die injizierten Embryonen untersuchen und die Toten entfernen.</li>
	<li>Bringen Sie die lebenden Embryonen in den 35,5 °C-Inkubator zurück und inkubieren Sie sie für 20-24 h, damit sich die HeLa-Zellen von der Injektionsstelle auf andere Teile des Körpers ausbreiten können. HINWEIS: Embryonen werden in 35,5 °C Inkubator gehalten, um das Überleben und die Migration menschlicher Krebszellen zu ermöglichen, da die Zellen bei 28,5 °C nicht gut funktionieren, die Temperatur Fischembryonen werden normalerweise inkubiert.</li>
</ol>4. Injektion von Nanopartikeln oder Fahrzeug
<ol><li>Anästhetisieren Sie die transplantierten Embryonen am nächsten Morgen mit fünf Tropfen verdünnter MS222-Lösung. Nicht zu viel MS222 hinzufügen, weil dies die Embryonen töten wird. Unter einem fluoreszierenden Mikroskop nehmen Sie sorgfältig Embryonen mit Schwanzmetastasen von RFP+ HeLa-Zellen auf und legen sie in eine neue Petrischale mit sterilem Fischwasser.</li>
	<li>Stellen Sie die Injektionsnadeln wie zuvor in Abschnitt 2 beschrieben unter Verwendung der folgenden Einstellungen vor: Druck bei 500, Hitze bei 645, Ziehen bei 60, Geschwindigkeit bei 50 und Zeit/Verzögerung bei 100.</li>
	<li>Befolgen Sie die Verfahren in den Schritten 3.1-3.3, um Embryonen und Lastfahrzeuge (z. B. H2O) oder die Nanopartikellösung in die Nadel auszurichten.</li>
	<li>Injizieren Sie 0,5 nL von 1 mg/ml Nanopartikellösung hinter dem Auge und setzen Sie die Injektion wie in den Schritten 3.5-3.6 beschrieben fort (Abbildung 1B). Dieser Ort hinter den Augen ist mit Kapillaren angereichert, so dass die Nanopartikel in den Kreislauf gelangen können.</li>
	<li>Nach einem ähnlichen Verfahren injizieren Sie das Fahrzeug (z. B. H2O), mit dem die Nanopartikel in Embryonen mit transplantierten HeLa-Zellen und solchen ohne (d. h. Kontrollen) suspendiert wurden (Abbildung 1A, C).</li>
	<li>Inkubieren Sie alle injizierten Embryonen bei 35,5 °C.</li>
</ol>5. Bildgebung und Verfolgung von Nanopartikeln und Krebszellen
<ol><li>Untersuchen Sie injizierte Embryonen unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 0, 30, 60, 90, 120, 180 und 210 min Nachinjektion von Nanopartikeln, um deren Verteilung im Kreislauf und den Grad der Krebszellung zu überwachen. Die Ausrichtung von Krebszellen durch Nanopartikel kann bereits nach 30 min nach der Injektion beobachtet werden, abhängig von der Art des getesteten Nanopartikels.</li>
	<li>Pipette 2-3 Embryonen in eine Petrischale und immobilisieren sie durch Zugabe von fünf Tropfen verdünnte MS222-Lösung (40 g/ml). Sobald die Embryonen aufhören zu schwimmen, entfernen Sie den größten Teil des Wassers, damit die Embryonen auf ihren Seiten liegen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pipette mit einer dünnen, weichen Bürste, die an ihrem Ende befestigt ist, um die Embryonen so auszurichten, dass sie auf ihren Seiten liegen, wobei das Vorderrohr nach vorne gerichtet ist und nur ein Auge sichtbar ist.</li>
	<li>Stellen Sie die Embryonen in roten, blauen und hellen Feldkanälen mit geringer Vergrößerung (2x) vor, um den gesamten Embryo zu erfassen und bei höherer Vergrößerung (6,4x) zu wiederholen, um den Schwanzbereich zu erfassen. Fokussieren Sie den Embryo unter dem roten Kanal, um das Bluten von Nanopartikeln zu vermeiden. HINWEIS: Die Embryonen dürfen sich während der Bildgebung nicht bewegen. Jede Bewegung führt zu verschwommenen Bildern und der Unfähigkeit, Bilder von verschiedenen Kanälen zu überlappen.</li>
	<li>Fügen Sie den Embryonen unmittelbar nach der Bildgebung frisches Fischwasser hinzu und geben Sie es in den Brutkasten zurück. Wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.4, um die Embryonen zu verschiedenen Zeitpunkten abzubilden.</li>
</ol>

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</ol>

I.S. bekundet Interesse an NanoScience Solutions, LLC (Empfänger des STTR NIH R41AI142890 Stipendiums). Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Das hier beschriebene Protokoll nutzt den Zebrafisch als In-vivo-System, um die Fähigkeit von Nanopartikeln zu testen, metastasierende menschliche Krebszellen zu erkennen und zu zielen. Mehrere Faktoren können die erfolgreiche Durchführung der Experimente beeinflussen. Zunächst müssen Embryonen mit 48 hpf vollständig entwickelt werden. Das richtige Entwicklungsstadium der Embryonen ermöglicht es ihnen, die Transplantation menschlicher Krebszellen zu überstehen und zu überleben. Embryonen unter 48 hpf haben eine deutlich ...

Die Entwicklung von Nanopartikeln, die in der Lage sind, Krebszellen zu erkennen, gezielt zu zielen und zu zerstören, ist sowohl für Physiker als auch für biomedizinische Forscher von großem Interesse. Die Entstehung der Nanomedizin führte zur Entwicklung mehrerer Nanopartikel, z. B. solcher, die mit Zielliganden und/oder Chemotherapeutika1,2,3konjugiert wurden. Die zusätzlichen Eigenschaften von Nanopartikeln ermöglichen ihre Interaktion mit dem biologischen System, die Erfassung und Überwachung biologischer Ereignisse mit hoher Effizienz und Genauigkeit zusammen mit therapeutischen Anwendungen. Gold- und Eisenoxid-Nanopartikel werden hauptsächlich in DerComputertomographie bzw. Magnetresonanztomographie eingesetzt. Während die enzymatischen Aktivitäten von Gold- und Eisenoxid-Nanopartikeln den Nachweis von Krebszellen durch farbmetrische Assays ermöglichen, eignen sich fluoreszierende Nanopartikel gut für in vivo-Bildgebungsanwendungen4. Unter ihnen sind ultrahelle fluoreszierende Nanopartikel besonders vorteilhaft, da sie Krebs früh mit weniger Partikeln und reduzierter Toxizität erkennen können5.
Trotz dieser Vorteile müssen Nanopartikel mit in vivo Tiermodellen zur Auswahl geeigneter Nanomaterialien und zur Optimierung des Syntheseprozesses experimentiert werden. Darüber hinaus verlassen sich Nanopartikel, genau wie Medikamente, auf Tiermodelle für präklinische Tests, um ihre Wirksamkeit und Toxizität zu bestimmen. Das am weitesten verbreitete präklinische Modell ist die Maus, ein Säugetier, dessen Unterhalt relativ teuer ist. Für Krebsstudien werden in der Regel gentechnisch veränderte Mäuse oder xenografierte Mäuse in der Regel6,7verwendet. Die Dauer dieser Experimente erstreckt sich oft von Wochen bis Monaten. Insbesondere für Krebsmetastasenstudien werden Krebszellen direkt in das Kreislaufsystem der Mäuse an Orten wie Schwanzvenen und Milz8,,9,10injiziert. Diese Modelle stellen nur die Endstadien der Metastasierung dar, wenn Tumorzellen entfernte Organe extravasieren und besiedeln. Darüber hinaus ist es aufgrund von Sichtbarkeitsproblemen besonders schwierig, die Tumorzellmigration und das Nanopartikel-Targeting von Tumorzellen bei Mäusen zu überwachen.
Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich zu einem leistungsfähigen Wirbeltiersystem für die Krebsforschung aufgrund seiner hohen Fruchtbarkeit, niedrigen Kosten, schnelle Entwicklung, optische Transparenz und genetische Konservierung11,12. Ein weiterer Vorteil des Zebrafisches gegenüber dem Mausmodell ist die Befruchtung der Fischeier ex utero, wodurch die Embryonen während ihrer entwicklung überwacht werden können. Die embryonale Entwicklung ist bei Zebrafischen schnell, und innerhalb von 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) hat sich die Wirbeltierkörperebene bereits13gebildet. Bei 72 hpf werden die Eier aus dem Chorgezelt geschlüpft und gehen vom embryonalen zum Bratenstadium über. Die Transparenz des Zebrafisches, insbesondere des Casper-Stamms 14, bietet eine einzigartige Gelegenheit, die Migration von Krebszellen und deren Erkennung und Ausrichtung durch Nanopartikel bei einem lebenden Tier zu visualisieren. Schließlich entwickeln Zebrafische ihr angeborenes Immunsystem um 48 hpf, wobei das adaptive Immunsystem hinterherhinkt und erst nach 28 Tagen nach der Befruchtung15funktionsfähig wird. Diese Zeitlücke ist ideal für die Transplantation verschiedener Arten menschlicher Krebszellen in Zebrafischembryonen ohne Immunabstoßung.
Hier wird eine Methode beschrieben, die die Transparenz und schnelle Entwicklung von Zebrafischen nutzt, um die Erkennung und Ausrichtung menschlicher Krebszellen durch fluoreszierende Nanopartikel in vivo zu demonstrieren. In diesem Test wurden menschliche Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa-Zellen), die gentechnisch verändert wurden, um ein rotes fluoreszierendes Protein auszudrücken, in den vaskularisierten Bereich in der Perivitellinehöhle von 48-hpf-Embryonen injiziert. Nach 20-24 h hatten sich die HeLa-Zellen bereits über das Fischkreislaufsystem in den Embryonen ausgebreitet. Embryonen mit scheinbarer Metastasierung wurden mit 0,5 nL einer Nanopartikellösung direkt hinter dem Auge mikroinjiziert, wo sich das reichhaltige Kapillarbett befindet. Mit dieser Technik können die ultrahellen fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikel bis nach der Injektion von 20-30 min auf HeLa-Zellen abzielen. Aufgrund seiner Einfachheit und Wirksamkeit stellt der Zebrafisch ein robustes In-vivo-Modell dar, um eine Vielzahl von Nanopartikeln auf ihre Fähigkeit zu testen, bestimmte Krebszellen anzusprechen.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>KSE scientific</td><td>BMK-A1705</td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas</td><td>World Precision Instruments</td><td>1,0 mm AD x 0,78 mm</td><td></td></tr><tr><td>Computer und Monitor</td><td>ThinkCentre</td><td>X000335</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>verkauft von Fisher</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Fischbrutkasten</td><td>VWR</td><td>35960-056</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fishersci Marke</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Ständer</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Spitze</td><td>Eppendorf</td><td>E5242956003</td><td>verkauft von Fisher</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MMPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Needle Puller</td><td>Sutter instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Olympus MVX-10 Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>MVX-10</td><td></td></tr><tr><td>P200 Spitze</td><td>Fishersci Marke</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/corning-universal-fit-pipet-tips-bulk-packed-6/07200293?keyword=true" target="_blank">07-200-293</a></td><td></td></tr><tr><td>PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>verkauft von Fisher</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Corning</td><td>SB93102</td><td>verkauft von Fisher</td></tr><tr><td>Kunststoffpipette</td><td>Marke Fishersci Marke</td><td>50-998-100</td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.addgene.org/113726/" target="_blank">pLenti6.2_miRFP670</a></td><td>Addgene</td><td>13726</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatische Pico-Pumpe</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYSPV820</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche-Sigma-Fisher</td><td>50-100-3275</td><td>Roche Produkt hergestellt von Sigma - verkauft von Fisher</td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Fishersci Marke</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>SZ51 Dissektionsmikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Tricain-Methansulfonat</td><td>Western Chemicals</td><td>NC0872873</td><td>verkauft von Fisher</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td>verkauft von Fisher</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fishersci Marke</td><td>12-000-122</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo targeting von xenografierten menschlichen krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden kieselsäure-nanopartikeln in zebrafischen

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Die Entwicklung von Nanopartikeln, die Krebszellen erkennen, gezielt angreifen und zerstören können, ist auf dem Gebiet der Nanomedizin von großem Interesse. In vivo Tiermodelle sind erforderlich, um die Nanotechnologie mit ihrer biomedizinischen Anwendung zu überbrücken. Die Maus stellt das traditionelle Tiermodell für präklinische Tests dar; Mäuse sind jedoch relativ teuer zu halten und haben lange experimentelle Zyklen aufgrund der begrenzten Nachkommenschaft von jeder Mutter. Der Zebrafisch hat sich zu einem leistungsfähigen Modellsystem für die Entwicklungs- und Biomedizinische Forschung, einschließlich der Krebsforschung, entwickelt. Insbesondere aufgrund seiner optischen Transparenz und schnellen Entwicklung eignen sich Zebrafischembryonen gut für die Echtzeit-In-vivo-Überwachung des Verhaltens von Krebszellen und ihrer Wechselwirkungen mit ihrer Mikroumgebung. Diese Methode wurde entwickelt, um menschliche Krebszellen und funktionalisierte Nanopartikel sequenziell in transparente Casper-Zebrafisch-Embryonen einzuführen und die In-vivo-Erkennung und -Targeting der Krebszellen durch Nanopartikel in Echtzeit zu überwachen. Dieses optimierte Protokoll zeigt, dass fluoreszierend markierte Nanopartikel, die mit Folatgruppen funktionalisiert sind, metastasierende menschliche Gebärmutterhalsepithelkrebszellen, die mit einem anderen Fluorchrom gekennzeichnet sind, gezielt erkennen und zielen können. Der Erkennungs- und Targeting-Prozess kann bereits nach 30 min Nachinjektion der getesteten Nanopartikel erfolgen. Das ganze Experiment erfordert nur die Zucht von ein paar Paar enerwachsener Fische und dauert weniger als 4 Tage. Darüber hinaus fehlt Zebrafischembryonen ein funktionelles adaptives Immunsystem, das die Transplantation einer Vielzahl menschlicher Krebszellen ermöglicht. Daher ermöglicht der Nutzen des hier beschriebenen Protokolls die Erprobung von Nanopartikeln an verschiedenen Arten menschlicher Krebszellen, was die Auswahl optimaler Nanopartikel in jedem spezifischen Krebskontext für zukünftige Tests an Säugetieren und der Klinik erleichtert.

Der Protokollschema in Abbildung 1 veranschaulicht die allgemeinen Verfahren für diese Studie. Transparente Casper männliche und weibliche erwachsene Fische wurden gezüchtet, um Embryonen zu erzeugen (Abschnitt 1). RFP+ HeLa-Zellen wurden in den vaskularisierten Bereich unter der Perivitelinhöhle der Zebrafisch-Embryonen bei 48 hpf injiziert, wobei nicht injizierte Embryonen als Kontrollen durchgeführt wurden (Abschnitt 3). Bei Personen, die in der M...

Hier wird eine Methode beschrieben, mit der Zebrafischembryonen verwendet werden können, um die Fähigkeit funktionalisierter Nanopartikel zu untersuchen, menschliche Krebszellen in vivo anzugreifen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung und Auswahl optimaler Nanopartikel für zukünftige Tests bei Großen Tieren und in klinischen Studien.

In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Dieses Verfahren ermöglicht es Forschern, optimale Nanopartikel für Studien an großen Tieren und klinischen Studien zu evaluieren und auszuwählen. Diese einfache Methode hilft zu bestimmen, ob das Nanopartikel die menschlichen Krebszellen in vivo angreifen kann und wenn ja, wie effizient das Targeting ist. Die Verfahren werden Dr.Xiodan Qin, ein Postdoc, und Mr.Andrew Lam, ein Forschungstechniker aus unserem Labor, demonstrieren.Füllen Sie abends zwei Kammerpaarungstanks mit Fischwasser und trennen Sie die oberen Tanks mit Trennwänden. Legen Sie einen männlichen Zebrafisch in eine Seite der Kammer und ein oder zwei Weibchen Zebrafische in eine andere Seite der Kammer. Entfernen Sie die Trennwände um 8:00 Uhr am nächsten Morgen.Fügen Sie künstliche Anreicherungsanlagen hinzu und neigen Sie die obere Kammer leicht, um eine flache Wasserfläche zu schaffen. Lassen Sie die Zebrafische drei bis vier Stunden züchten und sammeln Sie die Eier aus der unteren Kammer, indem Sie das Wasser durch ein Netz gießen. Die Eier auf eine Petrischale mit nicht mehr als 200 Eiern pro Gericht geben.Entfernen Sie alle toten oder unbefruchteten Eier. Füllen Sie das Gericht zu zwei Dritteln voll mit frischem Fischwasser und legen Sie es in den Brutkasten. Nach 24 Stunden die Schale aus dem Brutkasten entfernen und so viel Wasser wie möglich aus der Schale entfernen.Fügen Sie ein paar Tropfen von einem Milligramm pro Milliliter Pronase Lösung und sanft wirbeln die Schale. Wenn die Krähen Anzeichen von Zerfall zeigen, pipette die Embryonen ein paar Mal auf und ab, um die Krähen zu brechen und die Embryonen freizusetzen. Sobald die meisten Embryonen aus den Kränzen sind, fügen Sie sofort frisches Fischwasser hinzu, um den Prozess zu beenden.Spülen Sie die Embryonen dreimal mit Fischwasser, um die schwimmenden Krähen zu entfernen, bringen Sie die Embryonen in den Brutkasten zurück. Machen Sie eine 3%Agarose-Lösung, indem Sie drei Gramm Elektrophorese-Grade-Agarose zu 100 Milliliter autoklaviertem Fischwasser hinzufügen. Mikrowelle die Agarose und Wasser, bis die Agarose vollständig gelöst ist.Um die Injektionsplatte zu erstellen, gießen Sie heiße Agarose-Lösung in eine Petrischale, bis sie drei Viertel voll ist und legen Sie die Mikro-Spritzguss-Form auf die Agarose. Nachdem die Agarose verfestigt hat, entfernen Sie die Form vorsichtig. Füllen Sie die resultierende Injektionsplatte mit autoklaviertem Fischwasser und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.Um die Injektionsnadeln herzustellen, ziehen Sie Borosilikatglaskapillaren einen Millimeter Außendurchmesser um 0,78 Millimeter auf einem Pipettenzieher. Bewahren Sie die Injektionsnadeln auf dem Putte in einer großen Petrischale auf, die mit einem Ethanoltuch abgewischt wurde. Vor der Ernte der HeLa-Zellen die Injektionsplatte und das Fischwasser im Brutkasten bei 35,5 Grad Celsius aufwärmen.30 Minuten bis eine Stunde vor der Transplantation die HeLa-Zellen ernten. Arbeiten in einer Gewebekultur Haube, entfernen Sie das Medium aus dem Kolben durch Aspiration. Spülen Sie die Zellen mit sterilem PBS, um alle Spuren des Mediums zu entfernen.Fügen Sie drei Milliliter steriles Trypsin EDTA in den Kolben und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten. Beobachten Sie den Kolben unter dem Mikroskop, um den Fortschritt der enzymatischen Verdauung zu überwachen. Wenn etwa 80% der Zellen suspendiert sind, fügen Sie sechs bis acht Milliliter Wachstumsmedium zum Kolben hinzu.Sammeln Sie die Zellen durch sanftePipettieren und übertragen Sie sie in ein 15 Milliliter steriles Rohr. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 135 mal G für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die HeLa-Zellen in drei Millilitern des vollständigen Wachstumsmediums wieder aus.Nachdem Sie die Waschschritte zweimal wiederholt haben, setzen Sie die Zellen in einem Milliliter vollgewichtigen Mediums wieder aus. Dann zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit einem Hämozytometer. Entfernen Sie nach dem erneuten Zentrifugieren der Zellen den Überstand.Setzen Sie die Zellen in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit einer Konzentration von fünf mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter aus. Halten Sie die Zellen warm, indem Sie die Röhre in einer Hand halten, wenn Sie zur Fischanlage transportieren. Mit einer Plastikpipette die Zebrafisch-Embryonen auf die Injektionsplatte legen.Legen Sie Embryonen auf ihre Seiten mit dem vorderen Nachvorne nach vorne ausgerichtet an den Rillen auf der Platte ausgerichtet. Schalten Sie die Luftquelle und den Mikroinjektor ein. Nachdem Sie die HeLa-Zellen aus dem Inkubator abgerufen haben, pipettedien die Zellen 20 bis 30 Mal mit einem P200.Mit einer Gel-Ladespitze mit Schnittende sofort drei Mikroliter der HeLa-Zellsuspension in eine der Injektionsnadeln laden. Setzen Sie die Nadel in den Nadelhalter ein und legen Sie die Injektionsplatte unter das Mikroskop. Injizieren Sie das Zellgemisch in den Embryo im vaskularisierten Bereich unter der Perivitellinehöhle, indem Sie das Fußpedal drücken.Dann Pipette ein paar Tropfen steriles Fischwasser auf den Embryo. Um den Injektionsprozess fortzusetzen, verwenden Sie die nicht-dominante Hand, um die Injektionsplatte zum nächsten Embryo zu bewegen, und verwenden Sie dann die dominante Hand, um den Injektor zu verlängern und zurückzuziehen, während Sie gleichzeitig das Fußpedal drücken. Die Injektion aller Embryonen auf dem Teller beenden und die Embryonen mit sterilem Fischwasser in eine sterile Petrischale waschen.Sofort bebrüten Sie das Gericht bei 35,5 Grad Celsius. Nach drei Stunden die injizierten Embryonen untersuchen und die Toten entfernen. Am nächsten Tag Injektionsnadeln für die Nanopartikel herstellen und auf Demtie in einer großen Petrischale aufbewahren.Unter einem Fluoreszenzmikroskop arbeiten, nehmen Sie Embryonen mit Schwanzmetastasen sorgfältig auf und legen Sie sie auf eine neue Injektionsplatte mit sterilem Fischwasser. Für jeden Zebrafisch mit einer Schwanzmetastasierung entweder Nanopartikellösung oder Wasser hinter dem Auge injizieren. Injizieren Sie auch Nanopartikellösung hinter den Augen des Zebrafisches in die Kontrollgruppe, die keine HeLa-Transplantationen erhalten hat und alle injizierten Embryonen bei 35,5 Grad Celsius inkubieren.Unmittelbar nach der Injektion und wieder in 30 bis 60 Minuten Intervallen zwei bis drei Embryonen auf eine Petrischale übertragen und durch Zugabe von fünf Tropfen verdünnter MS222-Lösung immobilisieren. Sobald die Embryonen aufhören zu schwimmen, entfernen Sie den größten Teil des Wassers, damit die Embryonen auf ihren Seiten liegen. Mit einer Pipette mit einem dünnen weichen Pinsel an seinem Ende befestigt, richten Sie die Embryonen so aus, dass sie mit dem vorderen nach vorne gerichteten und nur einem Auge sichtbar liegen.Erfassen Sie mit der 2x-Vergrößerung Bilder des gesamten Embryos auf roten, blauen und Brightfield-Kanälen. Um den Schwanzbereich zu erfassen, stellen Sie die Embryonen mit 6,4-facher Vergrößerung ab. Fokussieren Sie den Embryo unter dem roten Kanal, um das Bluten von Nanopartikeln zu vermeiden.Unmittelbar nach der Bildgebung frisches Fischwasser zu den Embryonen geben und in den Brutkasten zurückbringen. Injizierte und kontrollierende Zebrafisch-Embryonen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Die roten Punkte sind metastasierende menschliche Gebärmutterhalskrebszellen, während die blauen Punkte die Nanopartikel darstellen.In einer Kontrollgruppe waren Zebrafische, die mit Krebszellen, aber nicht mit Nanopartikeln injiziert wurden, fluoreszierende HeLa-Zellen im roten Kanal sichtbar und es wurden keine spezifischen Fluoreszenzsignale im blauen Kanal nachgewiesen. In der anderen Kontrollgruppe wurden Zebrafische mit Nanopartikeln injiziert, nicht jedoch mit Krebszellen. Blaue fluoreszierende Nanopartikel wurden im Kreislaufsystem verteilt.Eine bestimmte rote Blütenpracht war nicht zu sehen. Wenn Zebrafische mit Schwanzmetastasen mit Nanopartikeln injiziert wurden, zeigen überlagerte Bilder aus den roten und blauen Kanälen die Kolokalisierung von HeLa-Zellen und Nanopartikeln. Nach der Durchführung dieser Methode können wir die Tumorbelastung und das Überleben von Krebszellen, die Tiere mit und ohne Injektion von Nanopartikeln analysieren, um ihre Fähigkeit, Krebszellen abzutöten, anzupassen.Diese Technik kann die Auswahl des optimalen Nanopartikels erleichtern, das die Krebszelle in vivo gezielt erkennen kann, was zur Früherkennung von Krebs und Krebsmetastasen führt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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zPDX-Analyse der Invasivität: Untersuchung des invasiven Verhaltens von metastasierten Krebszellen in Zebrafischembryonen Xenotransplantaten

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Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

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In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen (Video) | JoVE Journal

In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen

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