Ein Luft-Flüssig-Interface-Bronchial-Epithelmodell für realistische, wiederholte Inhalationsexposition gegenüber Luftpartikeln für Toxizitätstests
13. Mai 2020
Beschrieben wird die Zellkultur und Expositionsmethode eines In-vitro-Bronchialmodells für eine realistische, wiederholte Inhalationsexposition gegenüber Partikeln für Toxizitätstests.
Dieses Protokoll beschreibt, wie menschliche Bronchialepithelzellen über die Luft kultiviert und exponiert werden. Dies ist ein realistischeres Modell für die Untersuchung der Exposition der Lunge gegenüber inhalierten Partikeln. Die Lungenzellen werden mit diesen Methoden so präpariert, dass sie der realen Umgebung in der Lunge ähneln. Die Zellen produzieren Schleim, bilden eine dichte Barriere und bleiben mehrere Wochen lang lebensfähig. Diese Methode kann verwendet werden, um die toxischen Wirkungen von Partikeln in der Luft zu untersuchen. Es kann auch verwendet werden, um Infektionskrankheiten der Atemwege und Medikamente zu untersuchen, die durch Inhalation eingenommen werden. Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal ausprobieren, denken Sie daran, dass die Erstellung eines agilen Protokolls das Wissen von Spezialisten erfordert. Es erfordert auch spezielle Geräte für die Messung. Beginnen Sie mit der Verdünnung der Zellen in vorgewärmtem Zellkulturmedium (CCM) auf eine Konzentration von 500.000 Zellen pro Milliliter für 6-Well-Einsätze. Und 250.000 Zellen pro Milliliter für 12-Well-Einsätze. Legen Sie eine Zellkulturplatte mit Einsätzen unter aseptischen Bedingungen auf und füllen Sie die basale laterale Seite mit vorgewärmtem CCM.Nachdem Sie die Zellsuspension gemischt haben, pipettieren Sie sie auf die Membran im Zellkultureinsatz. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Kultivieren Sie die Zellen sieben Tage lang unter getauchten Bedingungen, damit sie die Konfluenz erreichen können, und wechseln Sie den CCM alle zwei bis drei Tage. Um den transepithelialen elektrischen Widerstand zu messen, verwenden Sie ein geladenes epitheliales Voltohmmeter, das durch einen Essstäbchen-Elektrodensatz ergänzt wird. Reinigen Sie die Elektroden mit 70% Ethanol. Legen Sie die längere Elektrode in das externe Nährmedium, bis sie den Boden der Schale berührt. Und die kürzere Elektrode im Medium, ohne die Membran zu berühren. Beginnen Sie mit dem Sammeln von Messungen auf dem leeren Einsatz ohne Zellen. Warten Sie, bis sich die Messung stabilisiert hat, und notieren Sie den Widerstand in Ohm. Bei dieser Messung handelt es sich um den Widerstand der Einlegemembran ohne Zellen oder Rohlingswiderstand. Wiederholen Sie die Messung für jede Einlage, subtrahieren Sie den Rohlingswiderstand, um den wahren Widerstand zu erhalten, und multiplizieren Sie ihn mit der Oberfläche der Einlage. Entfernen Sie das Medium von der apikalen Seite der Einsätze und geben Sie vorgewärmtes CCM auf die basolaterale Seite der Vertiefung. Das Medium sollte die Membran von unten berühren, aber nicht auf die Oberseite des Einsatzes auslaufen. Kultivieren Sie die Zellen an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für sieben Tage. Wechsel des basolateralen Mediums alle zwei bis drei Tage. Kurz vor der Partikelexposition ist eine 1%ige Nanopartikelsuspension herzustellen. Befeuchten Sie die NPs mit 96% Ethanol. Reines Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1 %NP hinzufügen.Das Fläschchen in ein Becherglas auf Eis stellen. Beschallen Sie die Suspension 16 Minuten lang, rühren Sie die Flasche mit der Dispersion um, schließen Sie dann die Flasche über einen kleinen Schlauch an eine Peristaltikpumpe an und stellen Sie den Durchfluss auf 25 Milliliter pro Stunde ein. Schalten Sie einen Tag vor der Belichtung die automatische Belichtungsstation oder AES ein und lassen Sie den Schrank eine Temperatur von 37 °C erreichen.
Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die Entwicklung eines in-vitro-Bronchialmodells, um wiederholte Inhalationsexpositionen gegenüber luftgetragenen Partikeln für toxikologische Untersuchungen zu simulieren. Die kultivierten humanen bronchialen Epithelzellen weisen eine lange Lebensfähigkeit und realistische Schleimproduktion auf, wodurch das Modell für toxikologische Studien und die Forschung zu Infektionskrankheiten geeignet ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Toxikologie
- Respirationsbiologie
- In-vitro-Modelle
Hintergrund
- Die Notwendigkeit realistischer Lungenexpositionsmodelle
- Die Bedeutung der Untersuchung inhalierten Partikel
- Anwendungen in der Arzneimitteldelivery und der Infektionsforschung
Verwendete Methoden
- Zellkultivierungstechniken für humane bronchiale Epithelzellen
- Kulturbedingungen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche
- Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands
Hauptergebnisse
- Die Zellen bilden eine dichte Barriere und produzieren Schleim
- Die Vitalität bleibt unter kontrollierten Bedingungen mehrere Wochen lang erhalten
- Die Methode wurde für die Anwendung in toxikologischen Bewertungen validiert
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Modell bildet die Lungenexposition gegenüber inhalierten Partikeln effektiv nach
- Bedeutende Auswirkungen für Toxizitätstests und Atemforschung
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Realistische in-vitro-Bronchialepithelmodelle sind entscheidend für die prädiktive Toxizitätsprüfung bei Inhalation und die Forschung zur Atemwegs-abhängigen Arzneimittelfreisetzung. Das Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen-(ALI-)System mit Calu-3-Zellen ermöglicht wiederholte Untersuchungen mit niedrigen Dosen, die menschliche Atemwegsbedingungen genau nachahmen und somit ein höheres Maß an Übertragbarkeit bei der Beurteilung von Wirkstoffen in frühen Entwicklungsstadien unterstützen. Dieser Ansatz trägt dem Bedarf nach physiologisch relevanten und reproduzierbaren Modellen in der Atemwegs-Biopharmazie Rechnung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die mechanistische Entschärfung von Wirkungen inhaliierter Verbindungen auf das Atemwegsepithel.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung, indem tight junctions und Schleimproduktion über längere Zeiträume aufrechterhalten werden.
- Erleichtert eine vorhersagekräftige Einschätzung von Atemtoxizität und Sicherheitsbewertungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes, reproduzierbares System zur quantitativen Messung der Integrität der epithelialen Barriere.
- Ermöglicht die Standardisierung von Assays für wiederholte Expositionen mit niederkonzentrierten Partikeln.
- Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung der Wirkung luftgetragener Verbindungen unter kontinuierlichen Flussbedingungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Anwendung translationsrelevanter Atemwegsmodelle für biomarkerbasierte Untersuchungen im Kontext von Erkrankungen.
- Stellt eine lückenlose Übertragung von in-vitro-Entdeckungen bis hin zu präklinischen Inhalationstoxikologiestudien sicher.
- Verringert das Risiko einer Ausscheidung in späteren Entwicklungsphasen durch die Modellierung realistischer Expositionsszenarien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses ALI-Bronchialmodell lässt sich in die Übergangsphase von der Entdeckung bis zur präklinischen Forschung für Atemwegsmedikamente und Inhalationstoxikologie integrieren.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Funktion der Atemwegsbarriere und Partikeltoxizität.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte für den transepithelialen Widerstand und die Zellviabilität.
- Analytik: Ermöglicht die kontinuierliche Überwachung der Expositionskonzentration und der applizierten Dosis.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit präklinischen Inhalationsstudien unter Verwendung krankheitsrelevanter Endpunkte.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine standardisierte Plattform, die für unterschiedliche Studien zu luftgetragenen Partikeln und Arzneimitteln anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Prüfung auf Atemtoxizität.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit wiederholter Expositionsprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Fortführung oder Abbruch von Projekten und die Kapitalnutzungseffizienz bei der Entwicklung von Atemwegs-Wirkstoffportfolios.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung inhalierter Wirkstoffe und Formulierungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur von Zellen an der Luft-Flüssig-Grenzfläche und in der Messung epithelialer Barrierefunktionen.
- Benötigt spezielle Messgeräte für die kontinuierliche Exposition unter Flussbedingungen und die Überwachung des Widerstands.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg für Expositionsprotokolle und Datenanalyse voraus.
- Anpassbar an verschiedene Typen und Konzentrationen luftgetragener Partikel, innerhalb der Grenzen des Modells.
- Hängt von der Aufrechterhaltung der Zellviabilität und der Integrität der Tight Junctions über längere Kultivierungszeiträume ab.
