Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

Hallo, ich bin Chris Glembotski. Ich bin Professor für Medizin am University of Arizona College of Medicine in Phoenix. Und ich bin der Direktor des Translational Cardiovascular Center, das sich ebenfalls hier in Phoenix befindet.

Ich möchte Ihnen heute zwei Personen vorstellen, die unsere neue Technik demonstrieren werden: Dr. Erik Blackwood, mein Senior Postdoctoral Fellow und Faculty in Training, und Senior Research Associate Miss Alina Bilal. Die derzeitigen Protokolle zur Isolierung von kardialen Myozyten begrenzen die Menge und Lebensfähigkeit der Zellen in Kultur, was zu einer experimentellen Sackgasse führt, um unser Verständnis der Herzphysiologie und Pathophysiologie zu verbessern. Dieses Protokoll zielt nicht nur darauf ab, den Prozess der Isolierung adulter muriner Herzzellen zu beschleunigen, sondern auch die Zellausbeute und Lebensfähigkeit von atrialen und ventrikulären Herzzellen gleichzeitig aus einem einzigen Mausherz zu erhöhen.

Diese Technik hat tiefgreifende Auswirkungen auf die therapeutische Entdeckung und darauf, dass Krankheiten wie Vorhofflimmern auf zelltypspezifischer Ebene besser charakterisiert werden können, was die Identifizierung therapeutischer Ziele ermöglicht. Wir empfehlen, dass Personen ohne vorherige mikrochirurgische Erfahrung die Schritte der aufsteigenden Aortenexplantation und -kanülierung ausgiebig üben, bevor sie das vollständige Isolationsprotokoll versuchen. Beginnen Sie damit, mit einer Schere einen Hautschnitt in der Mittellinie zu machen, um die Brust einer narkotisierten 10 Wochen alten C57 Black 6J-Maus schnell vom Mittelbauch bis zum Kiefer zu öffnen.

Betreten Sie das Peritoneum und befreien Sie das Zwerchfell durch stumpfe Dissektion. Schneiden Sie den Brustkorb mit Schnitten entlang der Brustwand an der lateralen Seite beider Seiten ab und schneiden Sie die faserigen Verbindungen zwischen Herz und Brustwand ab. Nachdem Sie den Brustkorb vollständig entfernt haben, heben Sie das Herz mit einer kleinen Pinzette und einer Schere sanft an der Spitze an, wodurch der hintere Aspekt des Herzens freigelegt wird.

Um das Herz zu explantieren, präparieren Sie unmittelbar unterhalb der Arterie innominatus an der aufsteigenden Aorta und legen Sie das Herz sofort in eiskaltes Herzperfusionsmedium. Präparieren Sie schnell das verbleibende Gewebe, um die aufsteigende Aorta freizulegen, und verwenden Sie eine Mikrodisparierzange und eine Schere, um den Bereich um die Aorta herum von überschüssigem Gewebe zu befreien. Positionieren Sie die gereinigte Aorta mit einer Pinzette mit feiner Spitze zwei Millimeter auf einer Perfusionskanüle und sichern Sie die Kanüle mit einer 5-0 Seidennaht.

Spülen Sie das kanülierte Herz vier Minuten lang mit Herzperfusionsmedium bei einer Flussrate von drei Millilitern pro Minute, bevor Sie für 15 bis 17,5 Minuten auf Verdauungspuffer umstellen. In den letzten Minuten der Perfusion sammeln Sie acht Milliliter des Verdauungspufferflusses und übertragen das Herz aus der Kanüle in eine 60-Millimeter-Kulturschale aus Kunststoff, entfernen Sie dann das überschüssige Gewebe und tauchen Sie das Herz in 2,5 Milliliter des Verdauungspuffers. Für die Isolierung von Vorhofzellen präparieren Sie die Vorhöfe vom Herzen weg und legen Sie die Vorhöfe in eine 30-Millimeter-Kulturschale aus Kunststoff, die 750 Mikroliter Verdauungspuffer enthält.

Hacken und toupieren Sie die Vorhöfe mit einer chirurgischen Schere mit feiner Spitze, bevor Sie das Gewebe mit einer feinen Pinzette weiter präparieren, ohne die Muskelfasern zu bewegen oder auseinanderzuziehen. Mischen und dissoziieren Sie das Gewebe mit einer sterilen Transferpipettenspitze 15 Minuten lang vorsichtig weiter. Beobachten Sie alle fünf Minuten die Dissoziation der atrialen Myozyten unter dem 10-fachen Objektiv eines Hellfeldmikroskops.

Wenn das Gewebe weiter verdaut wird, fahren Sie mit dem vorsichtigen Mischen und Dissoziieren des Gewebes mit einer sterilen Transferpipettenspitze mit kleinerer Porengröße fort, bevor Sie die Zellsuspension in ein steriles Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Spülen Sie die 30-Millimeter-Platte mit 750 Mikrolitern 37 Grad Celsius Myozytenstopppuffer eins und kombinieren Sie den Puffer mit der Zellsuspension. Lassen Sie die Vorhofmyozyten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur durch Schwerkraft und leichtes Rühren sedimentieren.

Wenn sich ein sichtbares Pellet gebildet hat, zentrifugieren Sie die Zellsuspension und überführen Sie den nicht-myozytenhaltigen Überstand in ein konisches 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen, ohne das Vorhofmyozyten-Pellet zu stören. Zentrifugieren Sie die Nicht-Myozytenfraktion und resuspendieren Sie das Nicht-Myozyten-Pellet in 10 Millilitern DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum. Nach der Zählung werden die Nicht-Myozytenzellen für die nachgelagerte Analyse auf die geeignete experimentelle Dichte gebracht, dann das isolierte Vorhofmyozyten-Pellet in der geeigneten experimentellen Konzentration resuspendiert, um es auf lamininbeschichtete Kulturplatten zu säen.

Für die ventrikuläre Zellisolierung zerkleinern Sie das ventrikuläre Herzgewebe, wie gerade für die Vorhofgewebeprobe gezeigt, und übertragen Sie die resultierende Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen, das 2,5 Milliliter 37 Grad Celsius Myozytenstopppuffer eins enthält. Spülen Sie die Dissektionsplatte mit 2,5 Millilitern 37 Grad Celsius Myozytenstopppuffer eins und kombinieren Sie die Wäsche mit der Zellsuspension. Mischen und dissoziieren Sie das Gewebe mit einer sterilen Transferpipette vier Minuten lang vorsichtig.

Am Ende der Inkubation verwenden Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot der Zellen, um das Vorhandensein von stäbchenförmigen Myozyten zu überprüfen. Geben Sie die Zellsuspension durch einen sterilen 100-Mikroliter-Nylonfilter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen und verwenden Sie zwei Milliliter des zuvor gesammelten Aufschlusspuffers, um alle verbleibenden Zellen aus dem sterilen Nylonfilter zu waschen. Lassen Sie die ventrikulären Myozyten sechs Minuten lang unter leichtem Rühren durch die Schwerkraft sedimentieren, bis sich am Boden des Röhrchens ein sichtbares Kügelchen bildet.

Mit einer sterilen Pipettenspitze wird der Nicht-Myozyten-haltige Überstand in ein konisches 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen überführt, ohne das ventrikuläre Myozytenpellet zu stören, und die Nicht-Myozytenfraktion zentrifugiert. Resuspendieren Sie das Nicht-Myozyten-Pellet in 10 Millilitern DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum zur Zählung, und plattieren Sie die Zellen in der entsprechenden Konzentration für ihre nachgelagerte Analyse, dann resuspendieren Sie die isolierten ventrikulären Myozyten in zwei Millilitern Myozyten-Stopppuffer zwei für die Zählung. Um eine schrittweise Paradigma-Wiedereinführung von Kalzium einzurichten, fügen Sie 50 Mikroliter 10 millimolare Calciumchlorid in die ventrikuläre Myozytenzellsuspension unter gründlichem Mischen für eine vierminütige Inkubation bei Raumtemperatur ein.

Am Ende der Inkubation fügen Sie den Zellen weitere 50 Mikroliter 10 millimolares Calciumchlorid hinzu und mischen Sie sie für eine weitere vierminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Behandeln Sie die Zellen anschließend mit einer vierminütigen Inkubation mit 100 Mikrolitern 10 millimolarem Calciumchlorid und einer vierminütigen Inkubation mit 80 Mikrolitern 10 millimolarem Calciumchlorid. Nach der letzten Inkubation werden die mit Kalzium behandelten ventrikulären Myozyten in einem geeigneten Volumen des ventrikulären Myozyten-Plattierungsmediums entsprechend ihrer geplanten nachgeschalteten Analyse resuspendiert und die Zellen auf lamininbeschichteten Kulturplatten ausgesät.

Nach einer Stunde ersetzen Sie den Überstand durch ein ventrikuläres Myozytenerhaltungsmedium, das mit 25 Mikromolaren Blebbistatin ergänzt wird. Troponin T ist ein Marker für kardiale Myozyten und wird sowohl in atrialen als auch in ventrikulären kardialen Myozytenkulturen robust exprimiert. Im Gegensatz dazu werden das atriale natriuretische Peptid und die myosin-Leichtkette zwei in atrialen bzw. ventrikulären kardialen Myozytenkulturen robust und spezifisch exprimiert.

Fibroblastenmarker werden ausschließlich in Nicht-Myozytenkulturen exprimiert, die sowohl aus Vorhof- als auch aus Ventrikelkammern isoliert wurden. Die Immunfärbung von atrialen und ventrikulären Myozyten adulter Mausen für den T-Tubulus-Marker Dihydropyridin und den Ryanodinrezeptor zeigt intakte T-Tubuli während der Isolierung und Langzeitkultur. Das sarkomerische Streifenmuster kann verwendet werden, um die Reinheit und Lebensfähigkeit isolierter kardialer Myozyten in Verbindung mit der stäbchenförmigen Morphologie und der Kernfärbung mit TO-PRO-3 zu beurteilen.

Erwartungsgemäß sind ventrikuläre Herzmyozyten groß und weisen eine durchschnittliche Länge von etwa 150 Mikrometern auf, während atriale Herzmyozyten durchschnittlich etwa 75 Mikrometer schwer sind. Darüber hinaus zeigen atriale kardiale Myozyten bei der Immunfärbeanalyse eine robuste Expression des atrialen natriuretischen Peptids in einem Färbemuster, das für die Lokalisation zum endoplasmatischen Retikulum und zum sekretorischen Granulat charakteristisch ist. Während atriale Myozyten unter basalen Bedingungen atriales natriuretisches Peptid sezernieren, nimmt die Sekretion als Reaktion auf Sekretagogen zu.

Darüber hinaus sezernieren atriale Herzmyozyten atriales natriuretisches Peptid und die Co-Sekretion verarbeitet nur einen Teil des Hormons von seinem Vorläuferzustand zum Produktpeptid. Zu den häufigsten vermeidbaren Fehlern gehört, dass das Tier vor der Tötung nicht ruhig gehalten wird, dass die Luftblasen nicht aus dem Perfusionssystem evakuiert werden und dass der Chirurg selbst nicht ruhig bleibt. Im Anschluss an dieses Verfahren kann jedes gängige experimentelle Verfahren durchgeführt werden, einschließlich der Bestimmung elektrophysiologischer und Kalziumhandhabungsparameter, Immunzytochemie, hypertropher Reaktions- und Signalstudien sowie simulierter Ischämie-Reperfusionsstudien.