Name: Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von netzförmigen, aus humanen iPS-Zellen gewonnenen Herzmuskelgeweben für die Myokardreparatur. Diese Methode ermöglicht die Wiederherstellung der Herzfunktion im Rattenmodell.

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Diese Arbeit wurde durch das Kosair Charities Pediatric Heart Research Program an der University of Louisville und das Organoid Project am RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research finanziell unterstützt. HiPSCs, die in unseren veröffentlichten Protokollen verwendet werden, wurden vom Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan bereitgestellt.

1. Pflege von HiPSCs und kardiovaskuläre Differenzierung
<ol><li>Erweitern und pflegen Sie hiPSCs auf dünnschichtigen Kellermembranmatrix (Wachstumsfaktor reduziert, 1:60 Verdünnung) in konditionierten Medium aus Maus embryonalen Fibroblasten (MEF-CM) mit humanen Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (hbFGF)4extrahiert. HINWEIS: Wir haben eine hiPSCs (4-Faktor (Okt3/4, Sox2, Klf4 und c-Myc) Linie verwendet: 201B6). Fügen Sie hbFGF bei der entsprechenden Konzentration für jede Zelllinie hinzu. Laminin-511 Fragment kann auch für die Beschichtung von Kulturschale anstelle von Kellermembran Matrix verwendet werden. Kommerziell erhältliches Medium, das für die feederfreie Kultur von hiPSCs entwickelt wurde, kann als Ersatz für MEF-CM verwendet werden.</li>
	<li>Verwenden Sie Versene (0,48 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung), um Zellen zu lösen und zu dissoziieren, wenn die Zellkonfluenz 90-u2012100% erreicht. HINWEIS: Es können auch andere handelsübliche Produkte zur Zelldissoziation verwendet werden.</li>
	<li>Plattenzellen mit einer Dichte von 10.000 Zellen/mm2 auf matrixbeschichteten Zellkulturplatten in MEF-CM mit hbFGF und Kultur für zwei bis drei Tage.</li>
	<li>Wenn die Kultur vollständig konfluent wird, decken Sie die Zellen für einen Tag mit Matrix (1:60 Verdünnung mit MEF-CM) ab.</li>
	<li>Ersetzen Sie den MEF-CM durch RPMI 1640 + B27 medium. 100 ng/ml Activin A und 100 ng/ml Wnt3A für einen Tag in das Medium geben. HINWEIS: Dies ist Tag 0 der Differenzierung. Um die kanonische Wnt-Signalisierung zu regulieren, können anstelle von Wnt3A auch GSK3-Inhibitoren verwendet werden.</li>
	<li>Ändern Sie am ersten Tag der Differenzierung das Medium auf das neue RPMI 1640 + B27 mit 10 ng/ml BMP4 und 10 ng/ml hbFGF. Kulturzellen für zwei (MC-Protokoll) oder vier (CM+EC-Protokoll) Tage ohne mittlere Veränderung5. HINWEIS: Das CM+EC-Protokoll ist so optimiert, dass gleichzeitig Kardiomyozyten (CMs) und vaskuläre Endothelzellen (ECs) induzieren. Das MC-Protokoll ist optimiert, um bevorzugt gefäßbildende Zellen (MCs) zu induzieren.</li>
	<li>CM+EC-Protokoll zur Induktion von CMs und ECs (Abbildung 1A).<ol>
<li>Ersetzen Sie das Medium am 5. Tag der Differenzierung durch RPMI 1640 + B27, ergänzt durch 50 ng/ml VEGF165.</li>
		<li>Ändern Sie das Kulturmedium alle 48 h bis zum Tag 13-201215 der Differenzierung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MC-Protokoll zur Induktion von gefäßbildenden Wandzellen (Abbildung 1B)<ol>
<li>Ersetzen Sie das Medium an Tag 3 der Differenzierung durch RPMI1640 + 10% fetales Rinderserum (FBS).</li>
		<li>Ändern Sie das Kulturmedium alle 48 h bis zum Tag 13-201215 der Differenzierung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Zellernte- und Abstammungsanalyse am Differenzierungstag 13-u201215
<ol><li>Waschen Sie die Zellen mit Ca2+ und Mg2+ freier Phosphat-gepufferter Saline (PBS).</li>
	<li>Fügen Sie eine Zelldissoziationslösung (mit Proteasen, Kollagenen und DNAsen) in die Zellkulturschale ein, um die Platte zu bedecken. Inkubieren Sie die Platte für 5 min bei 37 °C.</li>
	<li>Sammeln und dissoziieren Sie die Zellen mit Kulturmedium mit einer Pipette nach der Inkubation.</li>
	<li>Weisen Sie 1 x 106 Zellen für die Linienanalyse mit Durchflusszytometrie zu. Um abgestorbene Zellen zu beseitigen, färben Sie die Zellen mit fixierbarem Lebensfähigkeitsfarbstoff.</li>
	<li>Färben Sie die Zellen mit Membranoberflächenmarkern in PBS mit 5% FBS. Verwenden Sie die folgenden Verdünnungen von Antikörpern in fluoreszenzaktivierten Zellsortierungspuffer (FACS): Anti-PDGFR (1:100), Anti-VE-Cadherin (1:100), Anti-TRA-1-60 (1:20).</li>
	<li>Für intrazelluläre Proteine die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS resuspendieren und fixieren.</li>
	<li>Färben Sie die Zellen mit antikardialer Isoform von Troponin T (cTnT) in PBS mit 5% FBS und 0,75% Saponin, dann beschriften Sie den cTnT Antikörper mit 488 Maus IgG1 (Verdünnung 1:50).</li>
	<li>Setzen Sie die gebeizten Zellen in PBS mit 5% FBS wieder auf und legen Sie sie in FACS-Röhren mit Zellsieb.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zellzusammensetzung der gefärbten Zellen aus jedem Differenzierungsprotokoll mit Durchflusszytometrie, um die Erzeugung von Zellsuspensionen mit definierten Linienverteilungen zu erleichtern. HINWEIS: Bei dieser Durchführung dieses Verfahrens wird die verbleibende Zellsuspension für ECTs in einem 4 °C-Kühlschrank aufbewahrt.</li>
</ol>3. Herstellung von PDMS Gewebeform
<ol><li>Gießen Sie eine 0,5 mm dicke und über 30 mm x 30 mm Schicht Aus Polydimethylsiloxan (PDMS) durch Mischen des Prepolymers und der Vernetzungslösung im Verhältnis 10:1 und härten Sie dann bei 80 °C für 3 h aus.</li>
	<li>Schneiden Sie das PDMS-Blatt und verkleben Sie es mit Silikonkleber, um ein rechteckiges Tablett mit einer Höhe von 7 mm, einer Länge von 0,5 mm und 2,5 mm hohen rechteckigen Pfosten in gestaffelter Position herzustellen. Der horizontale Pfostenabstand zwischen zwei Pfostenlinien beträgt 2,5 mm (Abbildung 2B).</li>
	<li>Autoklavieren Sie das Fach bei 120 °C für 20 min.</li>
	<li>Beschichten Sie das Fach mit 1% Poloxamer 407 in PBS für 1 h. Spülen Sie den Poloxamer 407 und spülen Sie die Form mit PBS ausreichend vor Gebrauch.</li>
</ol>4. ECT-Bau
<ol><li>Kombinieren Sie nach der Zelllinienanalyse die Zellen aus CM+EC- und MC-Protokollen so, dass die endletzte Konzentration von MCs bei einer Gesamtzellenzahl von sechs Millionen Zellen pro Konstrukt510 bis 20 % beträgt.</li>
	<li>Suspend gemischte sechs Millionen Zellen in ECT-Kulturmedium (alpha Minimum essentielle Medium ergänzt mit 10% FBS, 50 M 2-Mercaptoethanol und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin).</li>
	<li>Vorbereitung der Matrixlösung<ol>
<li>Mischen Sie 133 l säurelösliche Rattenschwanzkollagen Typ I Lösung (2 mg/ml, pH 3) mit 17 l von 10x Minimum Essential Medium (MEM). Mischen Sie dann die Lösung mit 17 l Alkalipuffer (0,2 M NaHCO3, 0,2 m HEPES und 0,1 M NaOH). HINWEIS: Kollagen muss auf Eis (4 °C) gehalten werden. Überprüfen Sie die Pufferfarbe, und wenn das Medium nicht rosawird, wenn alle Lösungen gemischt werden, fügen Sie dem Medium zusätzlichen Alkalipuffer hinzu. Die Mischschritte müssen Kollagen I + 10x MEM mischen und dann Alkalipuffer hinzufügen. Ändern Sie diese Reihenfolge NICHT. Erzeugen Sie KEINE Blasen in der Mischung.</li>
		<li>Fügen Sie der neutralisierten Kollagenlösung 67 L Kellermembranmatrix hinzu. HINWEIS: Die Mischlösung muss auf Eis (4 °C) gehalten werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die vorbereitete Zellsuspension mit sechs Millionen Zellen bei 1.100 U/min (240 x g) für 5 min und setzen Sie die Zellen mit 167 l hochglukosedmEM + 20% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin (100x) wieder aus.</li>
	<li>Mischen Sie die Zellsuspension und die Matrixlösung. Das Gesamtvolumen der Zell-Matrix-Mischung für ein Konstrukt beträgt 400 l. HINWEIS: Die Zell-Matrix-Mischung sollte in diesem Schritt nicht-viskos und rosafarben sein. Halten Sie es auf Eis, da das Gel bei Raumtemperatur erstarrt. Die Endkonzentration von Kollagen Typ I beträgt 0,67 mg/ml.</li>
	<li>Gießen Sie die Zell-Matrix-Mischung gleichmäßig über die poloxamer 407 beschichtete PDMS-Gewebeform, die in eine Sechs-Well-Kulturplatte12gelegt wird. HINWEIS: Gießen Sie die Mischung sorgfältig, um Blasen zu vermeiden, um Füllfehler im gegossenen Gel zu vermeiden.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Zell-Matrix-Gemisch in einem Standard-CO2-Inkubator (37C, 5 %CO2) für 60 min.2</li>
	<li>Nachdem das Gewebe gebildet wurde, tränken Sie die Gewebeform mit 4 ml ECT-Kulturmedium. HINWEIS: Obwohl die Zelle/Matrix in 60 min vernetzt ist, ist das Konstrukt immer noch sehr zerbrechlich. Fügen Sie Das Medium vorsichtig hinzu, um eine Beschädigung zu vermeiden.</li>
	<li>Kultur das Gewebe für 14 Tage mit mittlerer Veränderung jeden Tag.</li>
	<li>Entfernen Sie vor der ECT-Implantation den ECT vorsichtig mit sterilisierten Feinzangen von den Ladepfosten. HINWEIS: Die endgültigen ECT-Abmessungen nach dem Entfernen aus der Form sind kleiner als die ursprüngliche Form. Eine 2,1 cm x 2,05 cm große Form erzeugt einen freigesetzten ECT von ca. 1,5 cm x 1,5 cm. Eine größere Form von 3,9 cm x 4,05 cm erzeugt einen ECT von ca. 3 cm x 3 cm. Unloaded ECT zeigt intrinsische spontane Schläge im warmen Kulturmedium. Obwohl zunächst eine Netzstruktur beibehalten wird, schrumpft und kondensiert ein entladener ECT im Laufe der Zeit. Es ist möglich, das Gewebe mit feinen Zangen weich zu halten und dann 7-0 Seidennaht zu verwenden, um den ECT am Epikardie zu befestigen.</li>
</ol>

<ol><li>Sanganalmath, S. K., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+heart+failure%3A+A+comprehensive+overview+of+experimental+and+clinical+studies%2C+current+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions.</a> Circulation Research. 113, 810-834 (2013).</li>
<li>Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-Analysis+of+Cell+Therapy+Trials+for+Patients+With+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure.</a> Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).</li>
<li>Menasché, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+for+severe+heart+failure+treatment%3A+first+clinical+case+report%3A+Figure+1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1.</a> European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-engineered+cardiac+tissue+sheets+with+cardiomyocytes+and+vascular+cells+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration.</a> Scientific Reports. 4, 6716(2014).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myocardial+regenerative+potential+of+three-dimensional+engineered+cardiac+tissues+composed+of+multiple+human+iPS+cell-derived+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages.</a> Scientific Reports. 6, 29933(2016).</li>
<li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).</li>
<li>Fujimoto, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+fetal+cardiac+graft+preserves+its+cardiomyocyte+proliferation+within+postinfarcted+myocardium+and+sustains+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function.</a> Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).</li>
<li>Lancaster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+treatment+for+heart+failure%3A+cell-based+therapy+with+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Vessel+Plus%22%5BJournal%5D)">Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue.</a> Vessel Plus. 2019, (2019).</li>
<li>Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+hydrogel+molding+to+control+the+3D+geometry+of+bioartificial+muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues.</a> Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+for+advanced+functional+maturation+of+human+ESC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes.</a> Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).</li>
<li>Christoforou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+differentiate+to+cardiomyocytes+and+form+biosynthetic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues.</a> PloS one. 8, 65963(2013).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Cell+Composition+and+Geometry+on+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Engineered+Cardiac+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue.</a> Scientific Reports. 7, 45641(2017).</li>
<li>Kowalski, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Cardiomyocyte+Alignment+from+Three-Dimensional+%283D%29+Confocal+Microscopy+of+Engineered+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue.</a> Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen oder wissenschaftlichen Konflikte offenzulegen.

Nach Abschluss unserer Untersuchung eines linearen Formats, hiPSC abgeleitet ECT5, passten wir das Protokoll an, um hiPSC-abgeleitete CMs, ECs und MCs zu mischen, um die In-vitro-Expansion von Gefäßzellen innerhalb von ECTs und die anschließende in vivo-Gefäßkopplung zwischen ECTs und Empfängermyokard zu erleichtern.
Um die Erzeugung größerer, implantierbarer Netz-ECT-Geometrien zu erleichtern, verwendeten wir dünne PDMS-Platten, um die 3D-Formen mit Ladepfosten zu entw...

Zahlreiche präklinische Studien und klinische Studien haben die Effizienz zellbasierter herzregenerativer Therapien bei versagenden Herzen1,2,3bestätigt. Unter verschiedenen Zelltypen sind humaninduzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs) vielversprechende Zellquellen aufgrund ihrer proliferativen Fähigkeit, des Potenzials, verschiedene kardiovaskuläre Linien4,,5, und Allogenität zu erzeugen. Darüber hinaus haben Gewebe-Engineering-Technologien es möglich gemacht, Millionen von Zellen auf ein geschädigtes Herz zu übertragen5,6,7,8.
Zuvor berichteten wir über die Erzeugung dreidimensionaler (3D) linearer Herzgewebe (ECTs) aus hiPSC-abgeleiteten kardiovaskulären Linien mit einem kommerziell erhältlichen Kultursystem für biokünstliche 3D-Gewebe5,7. Wir fanden heraus, dass die Koexistenz von vaskulären Endothelzellen und Wandzellen mit Kardiomyozyten innerhalb des ECT die strukturelle und elektrophysiologische Gewebereifung erleichterte. Darüber hinaus haben wir das therapeutische Potenzial implantierter HiPSC-ECTs in einem immuntoleranten Myokardinfarktmodell der Ratte validiert, um die Herzfunktion zu verbessern, Myokard zu regenerieren und die Angiogenese zu verbessern5. Die nach diesem Verfahren konstruierten linearen ECTs waren jedoch 1 mm x 10 mm Zylinder und daher nicht für die Implantation in präklinischen Studien mit größeren Tieren oder der klinischen Anwendung geeignet.
Basierend auf der erfolgreichen Verwendung von Gewebeformen zur Erzeugung poröser, konstruierter Gewebebildung mit Ratenskelettmyoblasten und Kardiomyozyten9, humanen ESC-abgeleiteten Kardiomyozyten10 und Maus-iPSCs11, haben wir ein Protokoll entwickelt, um skalierbares, von HiPSC abgeleitetes größeres implantierbares Gewebe mit Polydimethylsiloxan (PDMS)-Formen zu erzeugen. Wir haben eine Reihe von Formgeometrien ausgewertet, um die effektivsten Werkzeugeigenschaften zu bestimmen. Mesh-förmige ECTs mit mehreren Bündeln und Knoten wiesen hervorragende Eigenschaften in Zelllebensfähigkeit, Gewebefunktion und Skalierbarkeit im Vergleich zu einfachen Oder linearen Formaten auf, denen Poren oder Knoten fehlten. Wir implantierten die netzförmige ECT in ein Myokardinfarktmodell der Ratte und bestätigten ihre therapeutische Wirkung ähnlich den implantierten zylindrischen ECTs12. Hier beschreiben wir das Protokoll zur Erzeugung eines hiPSC-abgeleiteten netzförmigen ECT.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschalen 100x20 mm Style</td><td>Falcon/ Thomas scientific</td><td>9380C51</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell-Platten für Zellkultur 6well 50/CS</td><td>Falcon / Thomas scientific</td><td>6902A01</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit</td><td>Dow Corning</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM-105</td><td></td></tr><tr><td>BMP4, rekombinant (10&micro; g)</td><td>Forschung und Entwicklung D</td><td>RSD-314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen, Typ-I-Lösung aus Rattenschwanz</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Human VEGF (165) IS, Premium-Qualität</td><td>Miltenyi</td><td>130-109-385</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0,2 & Mikro; m filtriert (10%ige Lösung in Wasser)</td><td>Molekulare Sonden</td><td>P-6866</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante humane bFGF</td><td>WAKO</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Human/Maus/Ratte ActivinA (50&micro; g)</td><td>Forschung und Entwicklung D</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>rh Wnt-3a (10&Mikro; g)</td><td>Forschung und Entwicklung D</td><td>5036-WN</td><td></td></tr><tr><td>Versene Lösung</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kulturmedium und Nahrungsergänzungsmittel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11430</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptro Ethanol</td><td>SIGMA</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung minus Insulin</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>A1895601</tr><tr><td>DMEM,</td><td>Gibco</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum mit hohem Glukosegehalt (500ml)</td><td>Jedes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fötale Kälberserum (500ml)</td><td>Jedes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Jedes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (5000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11900024</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometrie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60, FITC, Klon: TRA-1-60, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>560380</td><td></td></tr><tr><td>anti-Troponin T, kardiale Isoform Ab-1, Klon: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision</td><td>Fisher</td><td>MS-295-P0</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Clean Lösung</td><td>BD</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSFlow Swrap Fluid</td><td>BD</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSRinse Solution</td><td>BD</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube with Cell Strainer Cap (500 Stück)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (500ml)</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, für 405 nm Anregung</td><td>Molekulare Sonden</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Klon: 28D4, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>558821</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47306-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Klon: 55-7H1, BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 488 Maus IgG1 Markierungskit</td><td>für molekulare Sonden</td><td>Z25002</td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung von mesh-shaped engineered cardiac tissues derived from human ips cells for in vivo myokard repair

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Erzeugung skalierbarer, netzförmiger Herzgewebe (ECTs), die aus kardiovaskulären Zellen bestehen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) gewonnen werden und auf das Ziel der klinischen Anwendung hin entwickelt werden. HiPSC-abgeleitete Kardiomyozyten, Endothelzellen und vaskuläre Wandzellen werden mit Gelmatrix vermischt und dann in eine Polydimethylsiloxan (PDMS) Gewebeform mit rechteckigen inneren versetzten Pfosten gegossen. Am Kulturtag reifen 14 ECTs zu einer 1,5 cm x 1,5 cm Maschenöffnung mit Myofiberbündeln mit 0,5 mm Durchmesser. Cardiomyozyten richten sich an der Langachse jedes Bündels aus und schlagen spontan synchron. Dieser Ansatz kann auf einen größeren (3,0 cm x 3,0 cm) Mesh-ECT skaliert werden, wobei die Konstruktreifung und -funktion erhalten bleibt. So können netzförmige ECTs, die aus hiPSC-abgeleiteten Herzzellen erzeugt werden, für Kardialregenerationsparadigmen möglich sein.

Abbildung 1A,B zeigt die Schaltpläne des CM+EC- und MC-Protokolls. Nach der Induktion von CMs und ECs aus cm+EC-Protokoll und MCs aus dem MC-Protokoll werden die Zellen gemischt und passen die endgültigen MC-Konzentrationen an 10 bis 20 % der Gesamtzellen an. Die 2 cm breite Gewebeform wird nach der Konstruktionszeichnung aus 0,5 mm dickem PDMS-Blatt gefertigt(Abbildung 2A,B). Sechs Millionen CM+EC+MC-Zellen werden mit Kollagen ...

Das vorliegende Protokoll erzeugt netzförmige stämmige Herzgewebe, das kardiovaskuläre Zellen enthält, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, um die Untersuchung der Zellimplantationstherapie für Herzkrankheiten zu ermöglichen.

Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Dieses Protokoll beschreibt eine edle und einfache Methode zur Herstellung von netzförmigen, aus menschlichen induzierten Körperteilen und von Stammzellen abgeleiteten Herzzellen hergestellten Herzgeweben. Die Flexibilität der Gewebegeometrie und die Skalierbarkeit der konservierten Gewebefunktion sind die Hauptvorteile dieser Technik. Die implantierten Netzform-ECTs können eine Herzstruktur und Funktion in einem Myokardinfarktmodell der Ratte wiederherstellen.Bestätigung seiner Machbarkeit für den Einsatz in der kardialen regenerativen Therapie. Diese Techniken erfordern reproduzierbare menschliche STAMMzellverarbeitung und die Gewebekultur-Fähigkeiten für konsistente Ergebnisse. Beginnen Sie mit dem Schneiden eines ausgehärteten PDMS-Blechs auf die entsprechende Größe, damit das Blech mit Silikonkleber verklebt werden kann, um eine 21 mal 20,5 Millimeter rechteckige Schale mit sieben Millimeter nlänge mundgerechtem und 2,5 Millimeter hohen rechteckigen Pfosten in gestaffelten Positionen herzustellen.Der horizontale Abstand zwischen zwei Pfostenlinien sollte 2,5 Millimeter betragen. Autoclavieren Sie das Fach bei 120 Grad Celsius für 20 Minuten, bevor Sie die Form mit 1%Poloxamer 407 in PBS für eine Stunde beschichten. Dann die Form gründlich mit PBS abspülen und die Form in einen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte legen.Für die Linienanalyse kombinieren Sie die Zellen aus den Kardiomyozyten plus endotheliale und vaskuläre Wandzellenprotokolle. Damit die endliche Konzentration von Wandzellen 10 bis 20% bei einer Gesamtzellzahl von sechs mal 10 zu den sechs Zellen pro Konstrukt beträgt. Mischen Sie 133 Mikroliter Säure löslich Ratte Schwanz Kollagen Typ eine Lösung und 17 Mikroliter Alkali Puffer zu 17 Mikroliter von 10X Minimum Essential Medium auf Eis.Dann 67 Mikroliter Basement Membrane Matrix in die Kollagenlösung geben. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen und setzen Sie das Pellet in 167 Mikroliter n.V. des minimalen Essential Mediums von High Glucose Dulbecco wieder aus, das mit fetalem Rinderserum und Antibiotika ergänzt wird. Mischen Sie die Zellen auf der Matrixlösung auf Eis.Dann gießen Sie vorsichtig 400 Mikroliter der Zellmatrixsuspension auf die Poloxamer 407 beschichtete PDMS-Gewebeform. Inkubieren Sie das Zellmatrixgemisch in einem Standard-Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 60 Minuten. Wenn sich das Gewebe gebildet hat, tränken Sie die Form vorsichtig mit vier Milliliterect-Kulturmedium und geben Sie die Platte für 14 Tage an den Zellkultur-Inkubator zurück.Vor der ECT-Implantation sterilisierten Sie Feinzangen, um den ECT vorsichtig von den Ladepfosten zu entfernen. Gewebeformen können mit verschiedenen Mustern, Pfostenlängen und Pfostenabständen hergestellt werden, um verschiedene endgültige ECT-Geometrien zu erzeugen. Für diese Analyse wurde eine Form mit sieben Millimeter langen Pfosten mit 2,5 Millimeter breiten Intervallen verwendet.Poloxamer 407 verhindert die Haftung der Zellen an der Form und ermöglicht die Bildung einer charakteristischen Netzstruktur nach schneller Gelverdichtung in 14 Tagen. Die Struktur wird auch nach dem Freiwerden des ECT aus der Form erhalten. Das gefertigte Gewebekonstrukt ist etwa 1,5 Zentimeter breit und 0,5 Millimeter dick.Und die Breite jedes Bündels im Netz beträgt im Durchschnitt etwa 0,5 Millimeter. Es ist möglich, ein 3 Zentimeter großes Netz ECT mit 24 Millionen Zellen aus einer viermal größeren Form mit dem gleichen gestaffelten Post-Design zu erzeugen. Diese größere Netz-ECT kann auch leicht aus der Form entfernt werden und erzeugt einen lokalen Kraftakt, der dem kleineren Netz-ECT entspricht.Es ist wichtig, die Zellmatrixmischung gleichmäßig in die Gewebeform zu gießen, ohne Blasen zu erzeugen, um Gefühlsfehler im endlichen Gel zu verhindern. Funktionale Charakterisierung des Auftragnehmers. und vierte Frequenzbeziehungen können mit eingebauten Systemen durchgeführt werden.Unser oberstes Ziel ist die Umsetzung von ECT-Paradigmen in klinische Therapien, die große präklinische Studien von Tieren nutzen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Matrix-Gel aus dezellularisierte Gewebe und Injektion in...

Herstellung von biologisch abgeleiteten Injizierbare Materialien für Myocardial Tissue Engineering

Die Erzeugung von ausgerichteten Myokardgewebe ist eine wesentliche Voraussetzung für die Anpassung der jüngsten Fortschritte in der Stammzellbiologie, um klinisch nützliche Zwecke. Hier beschreiben wir einen Mikrokontaktdruck Ansatz für die präzise Steuerung der Zelle Form und Funktion. Mit hoch gereinigte Populationen von embryonalen Stammzellen abgeleitete kardiale Vorläuferzellen, wir erzeugen dann anisotropen funktionale Herzmuskelgewebe.

Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken

Dieses Manuskript beschreibt die Erstellung von definiertem manipuliertem Herzgewebe unter Verwendung von Oberflächenmarker-Expression und Zellsortierung. Die definierten Gewebe können dann in einem Multigewebe-Bioreaktor verwendet werden, um Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu untersuchen, um ein funktionsfähiges, aber dennoch kontrolliertes Modellsystem des menschlichen Herzens bereitzustellen.

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Wir präsentieren drei neue und effizientere Protokolle für den menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kardiomyozyten, Endothelzellen differenzieren und glatten Muskelzellen und eine Fördermethode, die das Einwachsen von transplantierten Zellen verbessert durch Zellinjektion mit Patch-vermittelten Cytokin-Lieferung zu kombinieren.

Pluripotente Stammzellen Herzzellen für Myocardial Repair Abgeleitet

Dieses Protokoll beschreibt eine net Schimmel basierende Methode um dreidimensionale Gerüst-freie kardialen Gewebe mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten zu erstellen.

Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Induktion der linken Herzkammer Cryoinjury gefolgt von der Implantation eines Herzmuskels Patches, Menschliche iPS-Zellen Herzzellen in einem Meerschweinchen-Modell abgeleitet.

Implantation von HiPSC abgeleitete Herzmuskel Patches nach Myokard-Schädigung in einem Meerschweinchen-Modell

Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende Methodik zur Erzeugung von 3D-selbstorganisierten kardialen Mikrogewebe-Arrays, die aus vordifferenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen bestehen. Diese benutzerfreundliche und zellarme Technik zur Erzeugung kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und frühe Stadien der Arzneimittelentwicklung implementiert werden.

Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung eines dreidimensionalen (3D) mikrofluidischen Modells von hoch ausgerichtetem menschlichem Herzgewebe zu erklären und zu demonstrieren, das aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten besteht, die mit Herzfibroblasten (CFs) in einem biomimetischen, kollagenbasierten Hydrogel in Kokulturiert sind, für Anwendungen in der Kardgewebeentwicklung, im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

Hier wird eine Reihe von Protokollen für die Erzeugung und Kryokonservierung von kardialen Sphäroiden (CSs) aus humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten vorgestellt, die in einem multidimensionalen Hochdurchsatzformat kultiviert wurden. Dieses dreidimensionale Modell fungiert als robuste Plattform für die Modellierung von Krankheiten, Hochdurchsatz-Screenings und behält seine Funktionalität nach der Kryokonservierung bei.

Generierung, Hochdurchsatz-Screening und Biobanking von human-induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Herzsphäroiden

Die Steuerung von Herzzellen und -gewebe mit Licht ermöglicht eine berührungslose Stimulation, wodurch der natürliche Zustand und die Funktion der Zellen erhalten bleiben, was sie zu einem wertvollen Ansatz sowohl für die Grundlagenforschung als auch für therapeutische Anwendungen macht.

Ein kardiales mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Ca2+ -Ausbreitung durch nicht-genetische optische Stimulation

Es wird eine reproduzierbare Methode zur Erzeugung von 3D-Myokardgeweben vorgestellt, bei der MEW-Gerüste (Melt Electrospinning Writing), Polycaprolacton (PCL)-Gerüste und Fibrin-Hydrogele mit hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und Fibroblasten kombiniert werden. Diese Technik bietet eine präzise Kontrolle über die Gerüstarchitektur und kann in präklinischen Arzneimitteltests und bei der Modellierung von Herzerkrankungen eingesetzt werden.

3D-Generierung von humanem Myokardgewebe mittels Schmelzelektrospinnen, Schreiben von Polycaprolacton-Gerüsten und hiPSC-abgeleiteten Herzzellen

Lernen Sie die Herstellung von netzförmigen, aus humanen iPS-Zellen gewonnenen Herzmuskelgeweben für die Myokardreparatur. Diese Methode ermöglicht die Wiederherstellung der Herzfunktion im Rattenmodell.

Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair

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