Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair
9. Juni 2020
Das vorliegende Protokoll erzeugt netzförmige stämmige Herzgewebe, das kardiovaskuläre Zellen enthält, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, um die Untersuchung der Zellimplantationstherapie für Herzkrankheiten zu ermöglichen.
Dieses Protokoll beschreibt eine edle und einfache Methode zur Herstellung von netzförmigen, aus menschlichen induzierten Körperteilen und von Stammzellen abgeleiteten Herzzellen hergestellten Herzgeweben. Die Flexibilität der Gewebegeometrie und die Skalierbarkeit der konservierten Gewebefunktion sind die Hauptvorteile dieser Technik. Die implantierten Netzform-ECTs können eine Herzstruktur und Funktion in einem Myokardinfarktmodell der Ratte wiederherstellen.
Bestätigung seiner Machbarkeit für den Einsatz in der kardialen regenerativen Therapie. Diese Techniken erfordern reproduzierbare menschliche STAMMzellverarbeitung und die Gewebekultur-Fähigkeiten für konsistente Ergebnisse. Beginnen Sie mit dem Schneiden eines ausgehärteten PDMS-Blechs auf die entsprechende Größe, damit das Blech mit Silikonkleber verklebt werden kann, um eine 21 mal 20,5 Millimeter rechteckige Schale mit sieben Millimeter nlänge mundgerechtem und 2,5 Millimeter hohen rechteckigen Pfosten in gestaffelten Positionen herzustellen.
Der horizontale Abstand zwischen zwei Pfostenlinien sollte 2,5 Millimeter betragen. Autoclavieren Sie das Fach bei 120 Grad Celsius für 20 Minuten, bevor Sie die Form mit 1%Poloxamer 407 in PBS für eine Stunde beschichten. Dann die Form gründlich mit PBS abspülen und die Form in einen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte legen.
Für die Linienanalyse kombinieren Sie die Zellen aus den Kardiomyozyten plus endotheliale und vaskuläre Wandzellenprotokolle. Damit die endliche Konzentration von Wandzellen 10 bis 20% bei einer Gesamtzellzahl von sechs mal 10 zu den sechs Zellen pro Konstrukt beträgt. Mischen Sie 133 Mikroliter Säure löslich Ratte Schwanz Kollagen Typ eine Lösung und 17 Mikroliter Alkali Puffer zu 17 Mikroliter von 10X Minimum Essential Medium auf Eis.
Dann 67 Mikroliter Basement Membrane Matrix in die Kollagenlösung geben. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen und setzen Sie das Pellet in 167 Mikroliter n.V. des minimalen Essential Mediums von High Glucose Dulbecco wieder aus, das mit fetalem Rinderserum und Antibiotika ergänzt wird. Mischen Sie die Zellen auf der Matrixlösung auf Eis.
Dann gießen Sie vorsichtig 400 Mikroliter der Zellmatrixsuspension auf die Poloxamer 407 beschichtete PDMS-Gewebeform. Inkubieren Sie das Zellmatrixgemisch in einem Standard-Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 60 Minuten. Wenn sich das Gewebe gebildet hat, tränken Sie die Form vorsichtig mit vier Milliliterect-Kulturmedium und geben Sie die Platte für 14 Tage an den Zellkultur-Inkubator zurück.
Vor der ECT-Implantation sterilisierten Sie Feinzangen, um den ECT vorsichtig von den Ladepfosten zu entfernen. Gewebeformen können mit verschiedenen Mustern, Pfostenlängen und Pfostenabständen hergestellt werden, um verschiedene endgültige ECT-Geometrien zu erzeugen. Für diese Analyse wurde eine Form mit sieben Millimeter langen Pfosten mit 2,5 Millimeter breiten Intervallen verwendet.
Poloxamer 407 verhindert die Haftung der Zellen an der Form und ermöglicht die Bildung einer charakteristischen Netzstruktur nach schneller Gelverdichtung in 14 Tagen. Die Struktur wird auch nach dem Freiwerden des ECT aus der Form erhalten. Das gefertigte Gewebekonstrukt ist etwa 1,5 Zentimeter breit und 0,5 Millimeter dick.
Und die Breite jedes Bündels im Netz beträgt im Durchschnitt etwa 0,5 Millimeter. Es ist möglich, ein 3 Zentimeter großes Netz ECT mit 24 Millionen Zellen aus einer viermal größeren Form mit dem gleichen gestaffelten Post-Design zu erzeugen. Diese größere Netz-ECT kann auch leicht aus der Form entfernt werden und erzeugt einen lokalen Kraftakt, der dem kleineren Netz-ECT entspricht.
Es ist wichtig, die Zellmatrixmischung gleichmäßig in die Gewebeform zu gießen, ohne Blasen zu erzeugen, um Gefühlsfehler im endlichen Gel zu verhindern. Funktionale Charakterisierung des Auftragnehmers. und vierte Frequenzbeziehungen können mit eingebauten Systemen durchgeführt werden.
Unser oberstes Ziel ist die Umsetzung von ECT-Paradigmen in klinische Therapien, die große präklinische Studien von Tieren nutzen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige und einfache Methode zur Herstellung von maschenförmigen, aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten kardialen Geweben. Die Technik ermöglicht die Untersuchung der Zelltransplantationstherapie bei Herzerkrankungen, insbesondere in einem Rattenmodell des Myokardinfarkts.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kardiale Gewebeengineering
- Stammzelltherapie
- Regenerativmedizin
Hintergrund
- Technisch hergestellte Herzgewebe können die Herzstruktur und -funktion wiederherstellen.
- Menschliche induzierte pluripotente Stammzellen sind eine wertvolle Ressource zur Herleitung von Herzzellen.
- Die Flexibilität der Gewebegeometrie ist entscheidend für eine effektive Implantation.
- Die Reproduzierbarkeit bei der Verarbeitung von Stammzellen ist für konsistente Ergebnisse unerlässlich.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Herstellung von maschenförmigen, gewebetechnisch hergestellten kardialen Geweben.
- Beurteilung der Machbarkeit dieser Gewebe für die kardiale regenerative Therapie.
- Untersuchung der Wiederherstellung der Herzfunktion nach der Implantation.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer rechteckigen Schale aus PDMS und Silikonkleber.
- Erzeugung von Stützpfeilern für die gezüchteten Gewebe.
- Implantation der gezüchteten kardialen Gewebe in ein Rattenmodell.
- Beurteilung der Wiederherstellung von Herzstruktur und -funktion.
Hauptergebnisse
- Die netzartigen, künstlich hergestellten Herzmuskulaturgewebe konnten die Herzfunktion erfolgreich wiederherstellen.
- Die Methode zeigte Skalierbarkeit und Flexibilität hinsichtlich der Gewebegeometrie.
- Konsistente Ergebnisse wurden durch reproduzierbare Stammzellverarbeitung erzielt.
- Die Technik ist für den Einsatz in der kardialen regenerativen Therapie geeignet.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll stellt eine zuverlässige Methode zur Herstellung von künstlichem Herzmuskelgewebe bereit.
- Gewebestrukturen in Netzform können die Herzfunktion in einem Modell des Myokardinfarkts wirksam wiederherstellen.
- Der Ansatz zeigt vielversprechende Ergebnisse für zukünftige kardiale regenerative Therapien.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die skalierbare Herstellung von netzförmigen, aus humanen iPSC-abgeleiteten kardiovaskulären Zellen generierten Herzgeweben und bietet eine reproduzierbare Plattform für Strategien zur Myokardreparatur. Der Ansatz unterstützt die präklinische Evaluierung der Gewebaintegration und der funktionellen Wiederherstellung in Modellen ischämischer Verletzungen und schließt damit eine wichtige Lücke in der regenerativen Kardiologie. Durch die Bereitstellung eines geometrisch anpassbaren und skalierbaren Konstrukts erleichtert es die translationale Risikominimierung von stammzellbasierten Therapien bei Herzinsuffizienz.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Beurteilung der strukturellen und funktionellen Integration von aus hiPSCs abgeleiteten Herzzellen in vivo.
- Operativer Wert: Bietet ein standardisiertes, reproduzierbares Gewebeformat für konsistente präklinische Messwerte über verschiedene Studien hinweg.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare strukturelle Metriken (z. B. Ausrichtung der Myofasern, synchronisierte Kontraktion) zur Entwicklung funktioneller Assays.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die Skalierung auf größere Konstrukte (bis zu 3,0 cm), wodurch Dosis-Wirkungs- und Chargenkonsistenztests durchführbar werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Demonstriert die Durchführbarkeit der Wiederherstellung von Herzstruktur und -funktion in einem Rattenmodell für Myokardinfarkt und unterstützt die mechanistische Entlastung von Risiken.
- Operationaler Wert: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung durch standardisierte Implantations- und Funktionsbewertungsabläufe.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode positioniert netzartige EKTs als Brücke zwischen Entdeckung und präklinischer Phase, indem sie die Hypothesenprüfung in der frühen Entdeckungsphase und die funktionelle Validierung in präklinischen Stadien durch skalierbare, reproduzierbare Gewebeherstellung ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Risikominimierung, indem die kontrollierte Beurteilung der Integration und elektromechanischen Funktion von aus hiPSCs abgeleiteten Herzzellen ermöglicht wird.
- Screening: Bietet assaysbereite, standardisierte Gewebe mit quantifizierbaren Ausgangsparametern (Schlag-Synchronität, Ausrichtung) für den Vergleich von Wirkstoffen oder Bedingungen.
- Analytik: Liefert strukturelle und funktionelle Messgrößen (Konstruktabmessungen, Myofibrillendurchmesser, Kontraktionssynchronität), um vergleichende Analysen zwischen experimentellen Gruppen zu ermöglichen.
- Translationale Forschung: Stellt eine kontinuierliche Übertragbarkeit von der in-vitro-Maturierung bis zur in-vivo-funktionellen Wiederherstellung sicher und unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen für die Weiterentwicklung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine Plattformtechnologie, die an verschiedene Geometrien und Maßstäbe angepasst werden kann, und fördert so die Reproduzierbarkeit über Projekte hinweg sowie die Ressourceneffizienz.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unklarheiten bezüglich der Einheilung von Stammzellen und deren funktioneller Beteiligung an der Herzwiederherstellung verringert werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Skalierbarkeit durch definierte Zellverhältnisse, Matrixformulierung und Formgeometrie.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch reproduzierbare präklinische Wirksamkeitsdaten und reduziert biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten für die Herzwiederherstellung basierend auf validierter Gewebeleistung und Skalierbarkeit.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Expertise in der Differenzierung menschlicher iPSCs, der Spezifikation kardiovaskulärer Zelllinien und der 3D-Gewebekulturtechniken.
- Ist abhängig vom Zugang zu PDMS-Formgebungsgeräten, Sterilisationsmöglichkeiten und präzisen Flüssigkeitsmanipulationstechniken für die Matrix-Zell-Mischung.
- Erfordert eine standardisierte, interdisziplinäre Abstimmung hinsichtlich der Zellbeschaffung, der Matrixpräparation und der Inkubationsprotokolle, um eine Konsistenz zwischen Chargen zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Hochskalieren auf größere Konstrukte oder alternative Geometrien, insbesondere im Hinblick auf Nährstoffdiffusion und elektrische Kopplung.
- Ist durch die gegenwärtige Abhängigkeit von Nagetiermodellen zur funktionellen Validierung begrenzt, weshalb umfangreichere präklinische Systeme für die klinische Translation erforderlich sind.
