Name: Kontinuierliche Messung des biologischen Rauschens in Escherichia Coli mittels Zeitraffermikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Erfahren Sie die kontinuierliche Messung genetischer Schaltkreise in Escherichia coli mittels Zeitraffermikroskopie. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Quantifizierung biologischen Rauschens.

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Wir danken Herrn Gil Gelbert (Fakultät für Elektrotechnik, Technion) für die Unterstützung mit dem MATLAB-Code. Wir danken Dr. Ximing Li (Fakultät für biomedizinische Technik, Technion) für die Unterstützung bei der Korrektur dieses Artikels. Diese Forschung wurde teilweise von der Neubauer Family Foundation und dem israelischen Wissenschaftsministerium, Stipendium 2027345, unterstützt.

1. Medien- und Kulturvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die Stammlösung von 1.000x Carbenicillin (50 mg/ml) oder relevantem Antibiotikum vor.<ol>
<li>. Wiegen Sie 0,5 g Carbenicillin. 10 ml sterilhh2O. vollständig auflösen.</li>
		<li>Sterilisieren Sie Carbenicillin-Lager durch einen 0,22 m Spritzenfilter. Aliquot die Antibiotikum-Lösung und lagern bei -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zur Herstellung von Lysogeny-Brühe (LB) Platten, mischen 5 g Trypton, 5 g NaCl, 2,5 g Hefeextrakt und 7,5 g Bacto Agar mit 0,5 L sterilhH2O. Autoklavier die Lösung bei 121 °C für 20 min.<ol>
<li>Untertauchen Sie die geschmolzene Gelmischung teilweise in einem 50 °C Wasserbad. Fügen Sie 1.000 l Carbenicillin (50 mg/ml) hinzu.</li>
		<li>Bereiten Sie Petrigerichte in einer sterilen Umgebung zu. Lassen Sie die Teller vor dem Aufbewahren im Kühlschrank.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für M9-Mindestmedien separate Lagerlösungen aus den folgenden 5x M9-Salzen (56,4 g/L), 2 M Glukose und 2% biotinfreien Kasaminosäuren zubereiten. Autoclavieren Sie die Lösungen bei 121 °C für 20 min.</li>
	<li>Um 5 Petriplatten herzustellen, mischen Sie 1125 mg niedrigschmelzender Agar und 400 mg Agar mit 89,2 ml minimalem Medium (1x M9). 10 ml 2% Casaminosäuren (2% [vol/vol]) in einen 250 ml ErlenmeyerKolben geben. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Medien auf die inneren Lippen des Kolbens zu gießen.</li>
	<li>Mikrowelle der Lösung in kurzen Bursts von 3 bis 4 Sekunden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Lösung klar ist. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie den Siedepunkt nicht erreichen.</li>
	<li>Den 250 ml Erlenmeyerkolben in ein Warmwasserbad (60 °C) legen, um ihn durch Diffusion weiter zu mischen, und ihn abkühlen lassen, bis seine Temperatur auf etwa 45-50°C fällt.</li>
	<li>Zünden Sie die Flamme an der Plattengießbank an.</li>
	<li>Fügen Sie schnell alle Lösungen in der folgenden Reihenfolge hinzu: 800 l von 50% Glycerin (0,4% [vol/vol]) 100 l Thiamin (B1) 1100 l Glukose (2M) 100 l Carbenicillin (50 mg/ml).</li>
	<li>Wirbeln Sie den Erlenmeyerkolben, um eine gleichmäßige Verteilung aller Zutaten im gesamten Agar zu gewährleisten.</li>
	<li>Öffnen Sie eine Platte nach der anderen neben der Flamme und beginnen Sie zu gießen.<ol>
<li>Lassen Sie die Platten für ein paar Minuten bis zur ersten Erstarrung.</li>
		<li>Drehen Sie die Platten auf den Kopf, um zu verhindern, dass Wasserkondensation auf das Gel tropft.</li>
		<li>Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur für ca. 2 h erstarren.</li>
		<li>Sobald die Platten erstarrt und getrocknet sind, können sie bei 4 °C für ca. 3 Monate gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bakterielle Stämme und Plasmide Konstruktion
ANMERKUNG:Der genetische Kreislauf enthält einen Teil; ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP), das von einem PtetO-Promotor angetrieben wird, was zu einer konstitutiven Expression führt. Alle Plasmide in dieser Arbeit wurden mit grundlegenden molekularen Klontechniken konstruiert und mit einem Standard-Wärmeschockprotokoll24in Escherichia coli 10" umgewandelt. Das letzte Konstrukt wurde in Escherichia coli MG1655 Wild-Stamm für Tests umgewandelt.
<ol><li>Verwandeln Sie das gewünschte Plasmid in Escherichia coli MG1655 Zellen mit dem Standard-Wärmeschockprotokoll24.</li>
	<li>Wachsen Sie die transformierten Zellen auf einer LB-Agarplatte über Nacht bei 37°C. HINWEIS: Es ist möglich, die Petrischalen von Schritt 2.2 bis zu 3 Tagen für die Mikroskopie zu halten.</li>
	<li>Impfen Sie eine einzelne Kolonie in 5 ml LB-Brühe, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika in einem Glasrohr.</li>
	<li>Wachsen Sie Zellen bei 37 °C mit 250 Rpm Schüttelungsgeschwindigkeit im Inkubator für 2 h, bis die Flüssigkeit trüb ist.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 ml Verdünnungslösung wie folgt vor: 892 L minimale Medien (1x M9) 8 l von 50% Glycerin (0,4% [vol/vol]) 100 l mit 2% Casamino-Säuren (0,2% [wt/vol]) 1 L Thiamin (B1) 11 l Glukose (2 M) 1 L relevanter Antibiotika<ol>
<li>Mischen und spinnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellkultur (1:30) von Schritt 2,4 in ein 2 ml-Rohr, indem Sie 30 l Escherichia coli-Wachstum zu 1000 l Verdünnungslösung (Schritt 2,5) hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr für 1 h mit Schütteln (250 U/min) bei 37 °C.</li>
	<li>Wachsen Sie 40 l - 60 l auf M9-Platten, die in Schritt 1.10 hergestellt werden. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C über Nacht. HINWEIS: Die optische Dichte (OD600nm) für die Beschichtung sollte um 0,1 betragen.</li>
	<li>Legen Sie bis zu drei 35 mm Glasbodenplatten auf die Bank. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Glas der Platte die richtige Dicke für die verwendeten Mikroskoplinsen aufweist.</li>
	<li>Bereiten Sie die Kultur für die Aussaat auf Gelplatten vor, wiederholen Sie die Schritte 2.3 bis 2.6 für Kolonien aus Derplatte, die bei Schritt 2.9-Mikroskopmessungen vorbereitet wurden.</li>
	<li>Bereiten Sie die folgende Lösung vor, um drei Mikroskopplatten herzustellen.<ol>
<li>Das Wasserbad auf 60 °C vorheizen.</li>
		<li>Mischen Sie 112,5 mg niedrigschmelzender Agar und 40 mg Agar mit 8,92 ml minimalem Medium (1x M9) und fügen Sie 1 ml 2% Casaminosäuren (0,2% [vol/vol]) in einen 25 ml ErlenmeyerKolben. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Medien auf die inneren Lippen des Kolbens zu gießen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikrowelle der Lösung in kurzen Bursts von 2 bis 3 Sekunden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Lösung klar ist. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie den Siedepunkt nicht erreichen.</li>
	<li>Den 25 ml Erlenmeyerkolben in ein Warmwasserbad (60 °C) zum weiteren Mischen durch Diffusion legen und auf der Bank abkühlen lassen, bis seine Temperatur auf etwa 45-50 °C sinkt.</li>
</ol>3. Herstellung von Agarose-Pads
<ol><li>Saubere Bank mit 70% Ethanol. Stretchband auf der gereinigten Bank. Stellen Sie sicher, dass das Band glatt und nivelliert ist.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei Abdeckungen vor: eine auf dem Band und eine zweite in der Nähe. Bereiten Sie ein Deckel.</li>
	<li>Kolben (vorbereitet bei Schritt 2.14) aus dem Wasserbad nehmen, die Außenseite des Kolbens reinigen und abkühlen lassen, bis die Temperatur auf etwa 45-50 °C fällt.</li>
	<li>Um die Gellösung zu erstellen, mischen Sie schnell alle Lösungen in der folgenden Reihenfolge: 80 l von 50% Glycerin (0,4% [vol/vol]) 1 ml 2% Casaminosäuren (0,2% [wt/vol]) 10 l Thiamin (B1) 110 l Glukose (2 M) 10 L relevanter Antibiotika.</li>
	<li>Gießen Sie 1,5 ml des Gels auf den Deckelund und decken Sie es mit dem zweiten Stück, das ein "Sandwich" macht.</li>
	<li>Den Erlenmeyer ins Warmwasserbad zurückgeben. Bedecken Sie das Sandwich mit dem Deckel und stellen Sie Timer für 20 Minuten.</li>
	<li>Gleichzeitig das Rohr ab Schritt 2.11 für 1 h bei 37 °C mit Schütteln (250 U/min) inkubieren</li>
	<li>Nach 20 Minuten das Sandwich umdrehen (Schritt 3.5), abdecken und 1 H ruhen lassen. HINWEIS: Für bessere Ergebnisse ruhen sie das "Sandwich" bei 4 °C für die Dauer von Schritt 3.8.</li>
	<li>Samen Escherichia coli Kultur von Schritt 3.7 durch Pipettieren der Probe auf die 35 mm Schale. ANMERKUNG: Das Pipetieren von 6 L Zellen als separate kleine Tropfen liefert die besten Ergebnisse.</li>
	<li>Lassen Sie die Tropfen trocknen, für mindestens 15 Minuten und bis zu 30 Minuten.</li>
	<li>Setzen Sie das erstarrte Gel des Sandwiches aus Schritt 3.8 aus, indem Sie den Deckelrutsch wegschieben.</li>
	<li>Sandwich in kleine Einzelpads mit Biopsie-Punch oder Spitze schneiden.</li>
	<li>Lehnen Sie es vorsichtig auf die Probe (Schritt 3.9). Lassen Sie das Gericht für 20 Minuten auf der Bank.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Probe für die Mikroskopie-Bildgebung
<ol><li>Entfernen Sie den Kolben aus dem Wasserbad aus Schritt 3.6. Wischen Sie die Außenseite des Kolbens sauber und lassen Sie auf Raumtemperatur (25 °C) abkühlen. HINWEIS: Entfernen Sie den Kolben bei Schritt 4.1 ca. 3 Minuten vor dem Ende des Timers.</li>
	<li>Gießen Sie 3 ml des Gels in einer kreisförmigen Bewegung ständig auf den Plattenumfang. Lassen Sie für ein paar Minuten zu erstarren.</li>
	<li>Platten mit Klebeband versiegeln und mehrere Löcher mit 25 G Nadel durchbohren. Drehen Sie alle Gerichte, um zu verhindern, dass Wasserkondensation auf das Gel tropft.</li>
	<li>Alle Gerichte bei 4 °C für 30 min inkubieren, um eine vollständige Erstarrung zu ermöglichen und gleichzeitig eine Zellmitose zu verhindern. HINWEIS: Lassen Sie die Proben bei 4 °C für aufeinanderfolgende Messungen, nicht mehr als einen Tag.</li>
	<li>Starten Sie das Mikroskop gemäß Herstelleranleitung.</li>
	<li>Finden Sie den Anfangsfokus mit der niedrigsten Amplifikationslinse und greifen Sie auf das automatische Fokussystem (AFS) ein.</li>
	<li>Verwenden Sie Öl, wenn nötig, ertränken Sie die Linse mit Öl und verteilen Sie es sorgfältig, indem Sie die Platte mit einem Plattform-Controller (nicht manuell) bewegen und AFS kann wieder eingeschaltet werden.</li>
	<li>Verwenden Sie den relativen Querschnitt in Z-Richtung, und folgen Sie dem Standardvorschlag für Z-Schrittquerschnitte. HINWEIS: Wir haben alle 5 Minuten helle Feldbilder und alle 20 Minuten fluoreszierende Bilder aufgenommen. Manchmal muss der Fokus in den ersten 30 Minuten angepasst werden. Die Vorwärmung der Mikroskop-Inkubatorbox und des Öls während der Kühlung der Probe hilft dazu, den anfänglichen Fokusverlust zu reduzieren.</li>
</ol>5. Datenanalyse
HINWEIS: Um Mikroskopiedaten zu verarbeiten, haben wir in MATLAB eine computerbasierte Software entwickelt. Diese Software erleichtert die Identifizierung von Zellgrenzen aus hellen Feld-Tiff-Bildern und Segmenten und sortiert Zellen nach Flächen. Der Ausgang dieser Bildanalyse kann als Maske auf fluoreszierenden Tiff-Bildern verwendet werden, um Zellintensitätsniveaus abzuleiten und Artefakte in der fluoreszierenden Domäne wie Zellhalo aufgrund von Mikroskop-Auflösungsgrenzen abzubrechen. Die entwickelte Software wurde von ähnlichen Arbeiteninspiriert 7,25,26,27,28,29,30 und bietet eine elegante Lösung für das Labor zugeschnitten.
<ol><li>Definieren Sie zunächst die folgenden Parameter in main_code.m.<ol>
<li>Definieren Sie den Ordner der Aufnahmebilder.</li>
		<li>Definieren Sie den Bildzeitraum - heller Feldkanalzeitschritt in Minuten.</li>
		<li>Definieren Sie die GFP-Frequenz - Rate der Erfassung von GFP-Bildern.</li>
		<li>Definieren Sie die Mikroskopauflösung (d. h. wie viele Pixel gleich 1 m sind).</li>
		<li>Definieren Sie den Bereich des Histogramm-Bin-Bereichs - zellbereichsbereich. ANMERKUNG: Der Prozess der Klassifizierung der Daten nach Zellbereich ähnelt den Prinzipien des Gatings in der Flusszytometrie-Datenanalyse. Gates werden um Populationen von Zellen mit gemeinsamen Eigenschaften platziert, in der Regel vorwärts verstreut und seitlich verstreut, um diese Populationen von Interesse zu isolieren und zu quantifizieren. Die Mikroskopie ermöglicht es, mehrere Zellgruppen zu vereiten, zu untersuchen und zu quantifizieren.</li>
		<li>Konvolution-Kernel definieren (3,3) - dieser Parameter erkennt Zellgrenzen durch globale Schwellenwerte (count_cells.m). HINWEIS: Diese Einrichtung wird nur benötigt, wenn das Labor oder das Mikroskop gewechselt wird. Software erfordert, dass der Eingabe-Lichtfeldkanal mit Index c1, Fluoreszenzkanal mit der Bezeichnung c2 gekennzeichnet ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie main_code.m aus,mit dem alle anderen Skripts automatisch ausgeführt werden (count_cells.m, cell_growth_rate.m).<ol>
<li>Programm segmentiert automatisch helle Feldbilder (siehe Ergänzende Abbildung 2-4).</li>
		<li>Kombinieren Sie das Segmentierungsbild mit dem Fluoreszenzbild (GFP), um die Intensitätsstufe pro Zelle zu extrahieren.</li>
		<li>Berechnen Sie das Diagramm der Zellmenge nach Zeit und passen Sie entsprechend dem exponentiellen Wachstum.</li>
		<li>Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung (STD) für jeden Zellbereichsbereich.</li>
		<li>Berechnen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) für jeden Zellbereichsbereich.</li>
		<li>Zeichnen und passen Sie die Verteilung der Menge der Zellen nach Intensität an.</li>
		<li>Berechnen Sie den Varianzkoeffizienten (CV) und vergleichen Sie mit Flow Analyzer-Daten. HINWEIS: Software gibt als Ausgabe die endgültigen Segmentierungsbilder für die Anpassung conv_kernel in einem neuen Ordner "yourfolder/Segmented". Software gibt als Ausgabe die Graphen in einem neuen Ordner "yourfolder/Graphs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um zwischen Experimenten zu vergleichen, verwenden Sie compare_experiments.m.<ol>
<li>Definieren Sie Verzeichnisse für die gespeicherten Diagramme und die Adresse für das Verzeichnis .CompareResult.</li>
		<li>Führen Sie die Datei aus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In dieser Arbeit haben wir ein Protokoll entwickelt, das die Computerverfolgung von Escherichia coli-Lebendzellen ermöglicht, die Teilung und Fluoreszenzüberstand über einen Zeitraum von Stunden verfolgen. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, die stochastische Dynamik genetischer Schaltkreise in Escherichia coli zu quantifizieren, indem wir den Lebenslauf und SNR in Echtzeit messen. In diesem Protokoll haben wir das stochastische Verhalten von zwei verschiedenen Schaltkreisen verglichen, wie in A...

Synthetische Biologie ist ein multidisziplinäres Feld, das in den letzten zehn Jahren entstanden ist und darauf abzielt, technische Designprinzipien in rationales biologisches Design zu übersetzen1,2,3, in dem Bemühen, Multi-Signal-Integration und Verarbeitung in lebenden Zellen für das Verständnis der grundlegenden Wissenschaft4,5, diagnostische, therapeutische und biotechnologische Anwendungen6,7,8,9,10zu erreichen. Unsere Fähigkeit, die Input-Output-Antwort synthetischer Genkreise zu quantifizieren, wurde durch die jüngsten Fortschritte in der Einzelzelltechnologie, einschließlich des Durchflussanalysators und der Live-Zell-Bildgebung mittels automatisierter Zeitraffermikroskopie11, revolutioniert. Ein Strömungsanalysator wird häufig verwendet, um das Ansprechen dieser Schaltkreise im stationären Zustand1,12, und invertierte Mikroskopie wird verwendet, um die dynamische Reaktion von synthetischen Genkreisen auf der Ebene einer einzelnen Zelle3zu messen. Zum Beispiel, eine der frühen Arbeiten in der synthetischen Biologie beinhaltete den Aufbau von genetischen Oszillator-Netzwerken in lebenden Zellen mit negativen Rückkopplungsschleifen mit einer Verzögerung3. Später wurden die genetischen Oszillator-Schaltungen angewendet, um die metabolische Kontrolle in der dynamischen Umgebung der lebenden Zellen zu verstehen4. Die automatisierte Zeitraffermikroskopie ist eine Methode, um solche Schaltkreise zu charakterisieren. Wir vermuten, dass die Wirtszellen, Escherichia coli, bei der Bildung von Mikrokolonien synchronisieren, was die Messung von Signal und die Berechnung von Rauschen ermöglicht, ohne genaue Mutter-Tochter-Beziehungen zu verfolgen.
Lärm ist ein grundlegender, inhärenter Aspekt biologischer Systeme, die oft aus mehreren Quellen stammen. Man denke beispielsweise an biochemische Reaktionen mit Signalen, die aus dem Transport diskreter Zufälliger Träger wie die Diffusion von Proteinen13stammen. Diese Signale verbreiten sich mit zufälligen Schwankungen14. Weitere Lärmquellen sind Ressourcenverfügbarkeit, Zellteilung und Schwankungen der Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Druck. Biologische Signale, die sich in synthetischen Genkreisen ausbreiten, haben oft ein sehr niedriges Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), das die Leistung solcher Schaltkreise stört. Daher bleibt das genetische Schaltungsdesign einer der anspruchsvollsten Aspekte der Gentechnik15. Im Gegensatz zu den meisten Ansätzen, die nur die mittlere Genexpression berechnen (gemessen über die gesamte Zellpopulation), wird die Varianz des gemessenen Signals berücksichtigt, um ein vorhersagbares Verhalten durch synthetische Gennetzwerke zu entwickeln12. Daher spielen die Variabilitäts- oder Rauschengrade in der Proteinexpression eine dominierende Rolle bei der Gestaltung und Leistung analoger und digitaler Genkreise1,16,17.
Viele Ansätze wurden entwickelt, um die Zell-zu-Zell-Variabilität zu quantifizieren, unter anderem in Escherichia coli3,7,18. Diese Methoden werden häufig verwendet, um Genaktivierung und Stoffwechselwege zu studieren, jedoch mit weniger Fokus auf die Untersuchung der stochastischen Lärmdynamik, wie das Messen und Entwirren spezifischer Lärmquellen, insbesondere für genetische Schaltkreise in lebenden Zellen, wo dies eine grundlegende Herausforderung ist19,20,21. Mehrere Faktoren, die sowohl an den Schaltkreis selbst (intrinsisch) vererbt als auch von den Wirtszellen abgeleitet werden (extrinsisch), können die kontinuierliche Leistung genetischer Schaltkreise stören. In diesem Beitrag haben wir ein Protokoll entwickelt, das darauf abzielt, das Gesamtrauschen in Escherichia coli-Zellen zu quantifizieren, einschließlich der intrinsischen und extrinsischen Lärmquellen6,22. Durch quantifizieren des Gesamtrauschens und anschließende Bewertung des SNR23kann die Konstruktion von Genkreisläufen verbessert werden. Diese Methode kann modifiziert werden, um unabhängige Rauschquellen getrennt zu messen, indem mehrere fluoreszierende Proteine6,20überwacht werden. Für das hier beschriebene Protokoll halten wir die Umgebungsbedingungen gut kontrolliert und messen kontinuierlich die Aktivität von Zellen ohne Einfluss externer Faktoren. Wir messen das Signal von fluoreszierenden Proteinen in einzelnen Zellen im Laufe der Zeit und stellen es gleichzeitig unter einem Agarosesubstrat ab. Die resultierenden Bilder werden mit dem kundenspezifischen MATLAB des Labors analysiert.
Im Idealfall wird die kontinuierliche Messung der Echtzeitaktivität von fluoreszierenden Proteinen in einer Zelle genaue Daten durch das Wachstum und die Teilung der Zellen erzeugen. Es ist jedoch schwierig, solche Daten zu erfassen. Dies ist auf den Abbau von fluoreszierenden Proteinen, bekannt als Photobleichung7, zurückzuführen, wenn sie im Anregungsprozess Strahlung ausgesetzt sind. Darüber hinaus sind Escherichia coli Zellen auch empfindlich für die Anregung, die zu Phototoxizität führen könnte7. Beide Ausgaben begrenzen die Anzahl der fotorahmen, die erworben werden können, und die Zeit zwischen den Akquisitionen. Eine entscheidende Rolle spielen auch die Substrat- und Mitteltypen (z.B. Lysogeny-Brühe), die zum Wachstum der Zellen während der Bildgebung verwendet wird. Wir empfehlen dringend die Verwendung von minimalem Medium, das den nicht fluoreszierenden Hintergrund minimiert und die Zellteilungszeit verlängert.
Darüber hinaus muss die Probe unter Berücksichtigung der folgenden Anforderungen vorbereitet werden (1) Niedrige Zellteilungsrate ermöglicht weniger häufige Expositionen für die genaue Abbildung des Teilungszyklus und die Verringerung der Wahrscheinlichkeit von Phototoxizität und Photobleichungen. Wir stellen die Erfassungszeit auf etwa die Hälfte der vorhergesagten Mitosezeit (2) Niedrige Zelldichte zu Beginn des Experiments ermöglicht eine bessere Homogenität und Nachverfolgbarkeit der Teilung. Die Zelldichte wird durch das Verdünnungsverhältnis der Escherichia coli-Zellen beeinflusst, das ein wichtiger Parameter für den Erfolg dieses Protokolls ist und für jedes Labor bestimmt werden muss. Um das Verhältnis zu ermitteln, sollte jeder neue Escherichia coli-Stamm oder jede verwendete Form mit Wachstumsratendiagrammen versehen werden (Zusatzabbildung 1). Ein angemessenes Verhältnis wurde erreicht, wenn Zellen nach einer kurzen Inkubation von einer Anfangsdichte von etwa OD600nm = 0,1 ohne zusätzliches Schütteln wachsen können. Zellen in dieser Phase teilen sich nur nach der Umgebungstemperatur (3) Einschränkung der Zellbewegung: Die Zellbewegung hängt stark von der Festigkeit des Substrats (Agarosepad) ab. Die Festigkeit des Substrats hängt von der Menge der gesamten Agarose und der Gelerstarrungszeit ab. Gele können nicht über Nacht bei Raumtemperatur erstarren, da die Escherichia coli an Einer Mitose erleidet. Andere Faktoren, die die Substratstabilität beeinflussen, sind die Wassermenge in der Probe und die Feuchtigkeit. Weitere Fragen werden in den repräsentativen Ergebnissenausführlich erörtert. Dieses Protokoll bietet viele Details und wechselt schrittweise von einem Schritt zum anderen. Das Protokoll bietet lange Stabilität für Bildgebungsexperimente und bietet ein grundlegendes Bildverarbeitungswerkzeug.

<table><tbody><tr><td>35mm Glasschale</td><td>mattek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>Dicke entsprechend der Mikroskoplinse.</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>5004</td><td>LB Vorbereitung</td></tr><tr><td>AHL&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3007</td><td>Induktor</td></tr><tr><td>Bacto Trypton</td><td>BD - Becton, Dickinson und Company&nbsp;</td><td>211705</td><td>LB Zubereitung</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Invitrogen</td><td>10177-012</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Formedium</td><td>CAR0025</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Casaminosäuren&nbsp;</td><td>BD - Becton, Dickinson und Company&nbsp;</td><td>223050</td><td>minimale Medienlösung</td></tr><tr><td>eclipse Ti</td><td>nikon</td><td></td><td>inverses</td></tr><tr><td>Mikroskop Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>minimale Medienlösung</td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Bio-Lab</td><td>000712050100</td><td>minimales Medium</td></tr><tr><td>Substrat Immersol 518F</td><td>zeiss</td><td>44496000000000</td><td>Immersionsöl</td></tr><tr><td>M9 Salzlösung &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td>minimale Medienlösung</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>214010</td><td>LB Vorbereitung</td></tr><tr><td>Edler Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5431</td><td>minimales Mediensubstrat</td></tr><tr><td>Parafilmband</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>bezeichnet als Band im Text</td></tr><tr><td>Seaplaque GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50111</td><td>minimales Mediensubstrat</td></tr><tr><td>Thaymin B1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376&nbsp;</td><td>Minimale Medienlösung</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BD - Becton, Dickinson und Company&nbsp;</td><td>212750</td><td>LB Vorbereitung</td></tr></tbody></table>

kontinuierliche messung des biologischen rauschens in escherichia coli mittels zeitraffermikroskopie

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

Das hier entwickelte Protokoll bietet ein Tool, um die Computerverfolgung der Escherichia coli-Division und der Fluoreszenzüberschüsse über mehrere Stunden hinweg zu ermöglichen. Der Prozess beginnt mit einem Screening auf Kolonien, die auf minimalen Medien überleben, vorausgesetzt, dass nur Escherichia coli, die das richtige Plasmid beherbergt, in der Lage sein wird, unter den spezifischen Bedingungen zu gedeihen. Da der Prozess des Aufbaus großer genetischer Schaltkreise, der die Montage vieler DNA-Teile erfordert, eine Herausforderung darstellt, werden Schaltkreiskomponenten oft zwischen mehreren Plasmiden in verschiedenen Kopiernummern verteilt, die den Einsatz mehrerer Antibiotika erfordern. Mutationen im Plasmid können die Transkription der Antibiotikaresistenzgene zerstören und mit Ressourcenmanagement in der Zelle intervenieren, was zu Nekrose führt. Die ausgewählte Kolonie wird auf einer Glasboden-Petrischale gesetzt und einige Fokusebenen werden für die Mikroskopie-Tracking in hellen Feld- und Fluoreszenzdomänen ausgewählt. Das Protokoll behält den Bildfokus für mehr als 12 Stunden unter anfänglichen Bedingungen, die nicht reguliert werden können, was einige Schwierigkeiten verursacht. Zum Beispiel beginnen sich abgestorbene Zellen im Fokusfeld der Linsen nach ein paar Stunden der Bildgebung anzusammeln, was dazu führt, dass sich Giftstoffe ansammeln und das Signal verschwimmt und zerfällt. Der Erschöpfungswert von Nährstoffen führt zu neuen Stoffwechselprozessen und behindert die gewünschte Reaktion des Kreislaufs. Die Temperatur des Experiments senkt die Wirksamkeit von Induktoren und Antibiotika, was die Zuverlässigkeit des Signals weiter beeinträchtigen kann. Das minimale Mediengel schrumpft und trocknet, und dadurch ändert sich der optische Fokus im Laufe der Zeit. Wir haben diese Methode entwickelt, um diese Herausforderungen in Escherichia colizu überwinden, ähnlich wie frühere Arbeiten, die analoge Methoden für andere Mikroorganismen entwickeln. Darüber hinaus bietet diese Methode einen Algorithmus zur Quantifizierung des gesamten stochastischen Rauschens in unveränderten und veränderten Zellen und stellt fest, dass die Ergebnisse mit den Strömungsanalysevorhersagen übereinstimmen, wie ein ähnlicher Variationskoeffizient (CV) zeigt.

Die Software analysiert helle Feld-Domänenbilder, die nicht weiß und schwarz sind. Die Escherichia coli wird wie schwarze längliche Formen auf einem weißen Hintergrund aussehen und dynamischer Bereich der Luminanz sollte eine Spitze in ihrer Mitte zeigen (Abbildung 1). In fluoreszierenden Bildern können Zellen einen kleinen Halo haben, aber einzelne Zellen mit längigen Formen können immer noch aufgelöst werden. Ein Mitose-Ereignis sollte zuerst nach 30 Minuten erkannt werden. Der Mi...

Diese Arbeit stellt eine Mikroskopiemethode vor, die eine Live-Bildgebung einer einzelnen Zelle von Escherichia coli zur Analyse und Quantifizierung des stochastischen Verhaltens synthetischer Genkreise ermöglicht.

Kontinuierliche Messung des biologischen Rauschens in Escherichia Coli mittels Zeitraffermikroskopie

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Dieses Protokoll in Kräutern kontinuierliche Messung von genetischen Schaltkreisen in E.coli und die Berechnung der Signalvariabilität und Signal-Rausch-Verhältnis in einzelnen Bakterienzellen zur Beurteilung der Schaltungsleistung. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie leicht an verschiedene Stämme und Labore angepasst werden kann, minimale sorgsam und ohne spezielle Ausrüstung erfordert und relativ kostengünstig ist. Lärm spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Funktionalität biologischer Systeme.Derzeit besteht ein Interesse am Bau von groß angelegten Genkreisläufen. Diese Systeme können durch Lärm gehemmt werden Achten Sie darauf, die Proben gut zu trocknen, diese Chillpads so lange wie möglich bei vier Grad Celsius zu halten und die Teile geduldig und schonend zu schneiden und zu teilen. Um die Bakterien für die Analyse vorzubereiten, impfen Sie eine einzelne Kolonie aus einer transfizierten E.coli-Kultur.Zum Beispiel eine Schaltung mit einem GFP-Reporter. In einem Glasrohr mit fünf Millilitern LB-Brühe wird es mit den entsprechenden Antibiotika ergänzt. Wachsen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute in einem zitternden Inkubator für zwei Stunden, bis die Brühe trüb ist.Am Ende der Inkubation einen Milliliter Verdünnungslösung in einer Zwei-Milliliter-Mini-Mikrozentrifuge abdrehen und 30 Mikroliter Bakterien und das gesamte Volumen der Verdünnungslösung in eine neue Zwei-Milliliter-Röhre übertragen. Dann bebrüten Sie die Kultur für eine Stunde mit Schütteln, bevor Sie 40 bis 60 Mikroliter dieser Suspension auf M9-Kulturplatten säen. Um die Bakterien für die Analyse vorzubereiten, impfen Sie eine einzelne Kolonie aus einer transfizierten E.Coli-Kultur.Zum Beispiel eine Schaltung mit einem GFP-Reporter in einem Glasrohr mit fünf Millilitern LB-Brühe, ergänzt durch die entsprechenden Antibiotika. Wachsen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute in einem zitternden Inkubator für zwei Stunden, bis die Brühe trüb ist. Am Ende der Inkubation einen Milliliter Verdünnungslösung in einem Zwei-Milliliter-Mini-Mikrozentrifugenrohr versenken und 30 Mikroliter Bakterien und das gesamte Volumen der Verdünnungslösung in ein neues Zwei-Milliliter-Rohr übertragen.Dann bebrüten Die Kultur für eine Stunde mit Schütteln. Um Mikroskopplatten herzustellen, mischen Sie 112,5 Milligramm niedrigschmelzenden Agar mit 40 Milligramm Agar und einen Milliliter 2%Casaminosäure in einem 25 Milliliter Erlenmeyer Kolben. Als nächstes fügen Sie 8,92 Milliliter minimales Medium über die inneren Lippen eines 25 Milliliter Erlenmeyer Kolbens und Mikrowelle die resultierende Lösung in kurzen, zwei bis drei Sekunden Bursts.Dann stellen Sie das Wasserbad auf 55 Grad Celsius. Wenn die Lösung klar ist, legen Sie den 25 Milliliter Erlenmeyer-Kolben in ein 60 Grad Celsius-Wasserbad und lassen Sie die Agar-Lösung abkühlen, bis ihre Temperatur auf etwa 45 bis 50 Grad Celsius fällt. Während der Agarkühlung, reinigen Sie die Laborbank mit 70% Ethanol und glätten Sie ein Stück Laborband auf die gereinigte Bank.Legen Sie einen Glasdeckel auf das Band und legen Sie einen zweiten Deckelschlupf in der Nähe. Die gekühlte Agarlösung zu den entsprechenden Antibiotika und der entsprechenden Lösung hinzufügen. Gießen Sie 1,5 Milliliter frisch zubereitete Gellösung auf den über das Band platzierten Deckelschlupf und legen Sie den zweiten Deckelschlupf auf das Gel, wobei Sie darauf achten, Blasen zu vermeiden.Bringen Sie den Erlenmeyer ins Warmwasserbad zurück und decken Sie die Deckelschlupffürst2 minutenlang ab. Drehen Sie die Abdeckung Slips für eine Stunde Inkubation bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Deckelschlupf vom trockenen Gel entfernen und ein kleines Pad aus der Agarose schneiden.Während der Inkubation sechs Mikrolitertröpfchen der vorbereiteten bakteriellen Suspension in eine 35-Millimeter-Schale geben und die Tropfen mindestens 15 bis 30 Minuten trocknen lassen. Dann legen Sie das Pad vorsichtig auf ein Tröpfchen von Bakterien und lassen Sie die Proben für 20 Minuten bei Raumtemperatur einstellen. Um das Agarbett ohne Verschmieren der Probe zu platzieren, positionieren Sie das kühle Pad vorsichtig mit sanftem Klopfen auf das Tröpfchen.Um die Proben abzubilden, entfernen Sie den Kolben aus dem Wasser und lassen Sie die Gellösung auf Körpertemperatur abkühlen. Gießen Sie drei Millimeter des Gels auf den Umfang der Probenplatte. Wenn die Agarose verfestigt ist, versiegeln Sie die Platte mit Klebeband und verwenden Sie eine 25-Spur-Nadel, um mehrere Löcher in das Band zu stecken.Dann stellen Sie die Platte auf vier Grad Celsius für mindestens 30 Minuten, damit die Agarose vollständig erstarrt, während Zellmitose zu verhindern. Verwenden Sie innerhalb von 24 Stunden ein fluoreszenzkonfokales Mikroskop, um die Probe bei der niedrigsten Vergrößerung zu lokalisieren und das automatische Fokussystem des Mikroskops einzubinden. Tragen Sie Öl auf das entsprechende Ziel auf und verwenden Sie die Plattformsteuerung, um die Platte zu bewegen, um das Öl vorsichtig zu verteilen.Setzen Sie dann den automatischen Fokus erneut ein und folgen Sie dem Standardvorschlag für Z-Schrittquerschnitte, um das Beispiel abzubilden. Der E.coli sollte als schwarze länschliche Formen auf einem weißen Hintergrund erscheinen. Und der Dynamikbereich der Leuchtdichte sollte eine Spitze in der Mitte zeigen.Mitoseereignisse können zunächst durch Fluoreszenzmikroskopie nach 30 Minuten nachgewiesen werden. Obwohl einzelne Zellen bei geringer Vergrößerung schwer zu erkennen sind. Bakterielle Zellkulturen, die mit einem falschen Verdünnungsverhältnis hergestellt werden, können eine unveränderliche Anzahl von Zellen aufweisen, und Proben, die ohne Plattenversiegelung hergestellt werden, können eine übermäßige Schrumpfung aufweisen, was zu einem Verlust des Fokus führt.Zellen können das Gel auch bei der Suche nach Nährstoffen einrücken, was zu einer Stapelung der Bakterienzellen übereinander führt und die Zellmonoschicht kompromittiert, wodurch die Zelldetektion effektiv verhindert und zuverlässige fluoreszierende Signalmessungen durchgeführt werden. Wie aus diesen Daten vorgeschlagen, wirkt sich die Zellstufe im Teilungszyklus nicht auf den Geräuschpegel aus, da verschiedene Flächenbereiche den gleichen Trend aufweisen. Darüber hinaus wird keine wesentliche Änderung des Signal-Rausch-Verhältnisses zwischen GFP und Superfold GFP beobachtet, wie diese repräsentativen Daten zeigen.Achten Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens darauf, das richtige Verdünnungsverhältnis für den für das Experiment verwendeten Bakterienstamm zu bestimmen. Der Vergleich des Signal-Rausch-Verhältnisses jeder geregelten Schaltung mit dieser Basislinie ermöglicht die Auswahl der besten Leistungsschaltung und kann interessante Phänomene aufdecken

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Recording Multizelluläre Behavior in Myxococcus xanthus Biofilme mit Zeitraffer-Microcinematography

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Verfolgung der bakteriellen Infektionsdynamik in einer Maus mit Hilfe von Biolumineszenz

Quelle: Oms, T., et al. Populations- und Einzelzellanalyse der Antibiotikapersistenz in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)Dieses Video stellt ein Protokoll zur Überwachung einzelner Bakterienzellen vor, die ein fluoreszenzmarkiertes DNA-bindendes Protein in einem mikrofluidischen System exprimieren. Es zeigt, wie Antibiotika die meisten Zellen hemmen, während eine Subpopulation von Persisterzellen die Behandlung überlebt und nach der Entfernung von Antibiotika wieder nachwächst.

Mikrofluidische Zeitraffermikroskopie zur Untersuchung der Antibiotika-Persistenz in Bakterien

Quelle: Cabeen, M. T., et al. Einzellige mikrofluidische Analyse von Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)Das Video demonstriert den Einsatz eines mikrofluidischen Geräts zur Beobachtung des bakteriellen Wachstums auf Einzelzellebene. Es zeigt, wie nicht bewegliche bakterielle Zellen, die in mikrogroßen Gräben eingeschlossen sind, kontinuierlich unter einem Fluoreszenzmikroskop genährt und abgebildet werden. Das Setup ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung der Zellteilung und der...

Verfolgung des Bakterienwachstums bei Einzelzellauflösung in einem mikrofluidischen System

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