Geführte Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus human induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen

Protokolle für die Differenzierung von Stammzellen in funktionsfähige Nierenzellen sind nach wie vor schwer fassbar. Diese Methode erzeugt reife Podozyten mit Spezifität und Effizienz und bietet neue Werkzeuge für die Untersuchung von Mechanismen von Nierenerkrankungen. Bei diesem Verfahren werden Zellkulturmedium und extrazelluläre Matrixproteine mit einer chemisch definierten Zusammensetzung verwendet, um aus humanen iPS-Zellen gewonnene Podozyten mit hoher Reinheit herzustellen, ohne dass eine Subpopulationsselektion oder genetische Manipulation erforderlich ist.

Für Patienten mit Nierenerkrankungen gibt es nur begrenzte Therapiemöglichkeiten. Diese Methode hat Auswirkungen auf die Modellierung und das Verständnis von Krankheitsmechanismen, was die Entwicklung neuartiger Biomarker und Therapeutika erleichtern könnte. Um eine Feeder-freie humane iPSC-Kultur einzurichten, aspirieren Sie die Restlösung der Basalmembranmatrix 1 von vorbeschichteten Platten und waschen Sie die Wells dreimal mit ein bis zwei Millilitern pro Well erwärmtem Basalmedium.

Aspirieren Sie das verbrauchte Zellkulturmedium aus einer humanen iPSC-Kultur und spülen Sie die Zellen dreimal mit erwärmtem Medium. Geben Sie einen Milliliter warme Zellablösungslösung in jede Vertiefung für eine einminütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die abgerundeten Ränder der Zellkolonie unter einem Gewebekulturmikroskop bestätigt haben, aspirieren Sie die Zellablösungslösung schnell und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit Zellkulturmedium ab.

Geben Sie drei Milliliter humanes iPSC-Kulturmedium zu den humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und verwenden Sie einen Zelllifter, um die Kolonien abzukratzen. Pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig, um lose anhaftende Zellen zu entfernen, und waschen Sie die Platte gründlich, um die Entnahme aller Zellen sicherzustellen. Übertragen Sie 500 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung einer neuen Basalmembranmatrix 1 beschichteten Sechs-Well-Platte, die zwei Milliliter humaninduzierter pluripotenter Stammzellen pro Vertiefung enthält, und bewegen Sie die Platte in einer Achterform, um die Zellkolonien gleichmäßig in den Vertiefungen zu verteilen.

Legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator und erfrischen Sie das Medium täglich, bis die Zellen eine Konfluenz von etwa 70 % erreichen. Falls erforderlich, Differenzierungsbereiche aseptisch abkratzen, bevor der Überstand aus den Vertiefungen abgesaugt wird. Nachdem Sie die Vertiefungen dreimal gewaschen haben, dissoziieren Sie die Zellen wie gezeigt und ziehen Sie die resultierenden Zellsuspensionen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Nach dem Mischen durch Pipettieren das endgültige Volumen im Röhrchen mit warmem Medium auf 15 Milliliter bringen und die Zellen durch Zentrifugation sammeln. Resuspendieren Sie das Pellet in frischem Medium für eine zweite Zentrifugation und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Mesoderm-Induktionsmedium zur Zählung. Nach der Zählung resuspendieren Sie die Zellen auf eine Konzentration von eins mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter Mesoderm-Induktionsmedium und aspirieren Sie die extrazelluläre Matrixlösung aus den mit Basalmembranmatrix 2 beschichteten Platten.

Spülen Sie die Platten zweimal mit warmem Medium ab und mischen Sie die humaninduzierte pluripotente Stammzellsuspension durch sanftes Pipettieren. Geben Sie einen Milliliter Zellen in jede Vertiefung der mit Basalmembranmatrix 2 beschichteten 12-Well-Platten und schütteln Sie die Platten vorsichtig, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen. Legen Sie dann die Platte in den Zellkultur-Inkubator.

Ersetzen Sie an den Tagen 2-15 der Differenzierung das Mesoderm-Induktionsmedium durch einen Milliliter intermediäres Mesoderm-Induktionsmedium pro Well. Wenn ein erhebliches Zellwachstum und eine schnelle Erschöpfung der Nährstoffe beobachtet wird, was durch eine Vergilbung des Mediums angezeigt wird, kann das Volumen des intermediären Mesoderm-Differenzierungsmediums auf 1,3 Milliliter pro Vertiefung erhöht werden. Am Tag 16 der Kultur spülen Sie die intermediären Mesodermzellen mit warmem Medium und inkubieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 0,05 % Trypsin EDTA pro Vertiefung für drei Minuten bei 37 Grad Celsius.

Wenn die Zellen zu dissoziieren beginnen, kratzen Sie die Zellen mit einem Zellheber ab und mischen Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren. Stoppen Sie die Reaktion mit etwa zwei Millilitern Trypsin-Neutralisationslösung pro Vertiefung und geben Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Bringen Sie das Volumen mit Medium auf 50 Milliliter und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Resuspendieren Sie das Pellet in Podozyten-Induktionsmedium bei einer einmaligen 10 bis fünften Zellen pro Milliliter mittlerer Konzentration und fügen Sie die Zellen zu Basalmembran-Matrix-2-beschichteten Platten hinzu. Schütteln Sie dann die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen, und legen Sie die Zellen für bis zu fünf Tage in den Inkubator. Mit der gezeigten Kulturstrategie können die Stammzellen zunächst in Mesodermzellen differenziert werden, die Brachyury exprimieren, gefolgt von der Differenzierung in PAX2-positive intermediäre Mesodermzellen und schließlich in reife glomeruläre Podozyten der Nieren

Aus Stammzellen gewonnene Podozyten färben sich positiv für WT1 sowie für den Abstammungsidentifikationsmarker Nephrin. Interessanterweise liegt die subzelluläre Lokalisation von Nephrin überwiegend innerhalb der Podozytenfußfortsätze und des zellulären Zytoplasmas, was mit einem reifen Podozyten-Phänotyp übereinstimmt. Zellen, die in Dichten ausgesät werden, die die empfohlene Dichte von einer mal 10 bis fünf Zellen pro Well einer 12-Well-Platte deutlich überschreiten, führen zu großen Zellclustern, denen der erwartete morphologische Phänotyp reifer Podozyten innerhalb der Standardzeitachse des Protokolls fehlt.

Die Aussaat in den in diesem Protokoll empfohlenen Dichten führt jedoch zu Zellkulturen mit der gewünschten Morphologie. Wir empfehlen, das geeignete Basalmembranprotein für die Zellablösung zu verwenden und die korrekte Zellaussaatdichte für die Mesoderm- und Podozyteninduktion aufrechtzuerhalten. Diese Podozytendifferenzierungsmethode kann in mikrofluidische Organ-on-Chips-Systeme oder 3D-Bioprinting-Technologien integriert werden, um Funktionsmodelle der menschlichen Niere für das Wirkstoffscreening und Nephrotoxizitätstests zu entwickeln.

Der Mangel an geeigneten Zellkulturmodellen hat Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen von Nierenerkrankungen behindert. Dieses Protokoll bietet Forschern eine unerschöpfliche Quelle von patienteneigenen Podozyten für die Modellierung von Krankheiten.