Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

Die Automatisierung des Rasterkraftmikroskops ist eine Schlüsselinnovation in der Entwicklung der Technologie hin zu biomedizinischen Anwendungen. Es eröffnet auch den Zugang zur Untersuchung der biomechanischen Eigenschaften von Zellpopulationen. Unsere Methode ermöglicht es, AFM-Messungen für 1.000 Zellen in vier Stunden aufzuzeichnen, verglichen mit den üblichen Methoden, die vier Stunden dauern, um 10 Zellen zu messen, ist dies wirklich ein erheblicher Zeitgewinn.

Wenn Automatisierung eine Voraussetzung ist, um diese Technologie in Krankenhauslabore zu bringen, deutet dieses Proof-of-Concept-Protokoll auf ihr Potenzial für die Entwicklung spezifischer medizinischer Diagnosestrategien hin. Dieses Protokoll verwendet einen vielseitigen PDMS-Stamm, der mit verschiedenen Mikroben gefüllt werden kann, so dass verschiedene Systeme erforscht werden können. Um den PDMS-Stempel vorzubereiten, mischen Sie 55 Gramm PDMS-Präpolymerlösung in einem Massenverhältnis von 10 zu eins in PDMs, Oligomeren und Härter und entgasen Sie die resultierende Lösung unter Vakuum bei einmal 10 bis zum Minus eins zu eins mal 10 zu den negativen zwei Balken für fünf bis 10 Minuten.

Wenn alle Fallenblasen entfernt sind, gießen Sie 20 Gramm der entgasten Lösung auf eine Silikon-Masterform auf eine Dicke von zwei bis drei Millimetern und entgasen Sie erneut. Wenn alle Blasen entfernt wurden, setzen Sie das PDMS eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius und schneiden Sie den PDMS-Mikrostrukturstempel parallel zu den sichtbaren Mikrostrukturarrays mit einem Skalpell. Ziehen Sie dann den Stempel von der Silizium-Masterform und legen Sie die Stempel-Mikrostrukturstelle auf einen Glasträger, wobei die Mikrostrukturen an der Seite des Objektträgers ausgerichtet sind.

Um die Zellen für das Gerät vorzubereiten, zentrifugieren Sie 600 Mikroliter der Zellsuspension von Interesse und fügen Sie 200 Mikroliter des Überstands auf den Stempel hinzu. Entgasen Sie den Überstand unter Vakuum für etwa 40 Minuten. Wenn alle Blasen entfernt wurden, ersetzen Sie den Überstand von der PDMS-Oberfläche durch 200 Mikroliter der resuspendierten Zelllösung für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.

Um die Zellen in die Mikrostrukturen des Stempels zu laden, verwenden Sie einen Glasträger, der in einem Winkel von 30 bis 50 Grad gehalten wird, um die Zellen mehrmals nach Bedarf über den Stempel in beide Richtungen zu verteilen. Wenn eine hohe Füllrate der Mikrostrukturen erreicht wurde, verwenden Sie eine Pipette, um die Zellsuspension zu entfernen, und waschen Sie die dreimal mit einem Milliliter Acetatpuffer pro Waschgang, um nicht eingefangene Zellen zu entfernen. Nach dem letzten Waschen verwenden Sie Stickstofffluss, um die Rückseite der Probe zu trocknen und den Stempel in eine Petrischale zu legen.

Dann fügen Sie zwei Milliliter frischen Acetatpuffer in die Schüssel. Für die Rasterkraftmikroskopie der Zellen legen Sie die Schüssel auf die Rasterkraftmikroskopstufe und zentrieren Sie die Stufe bei Null bis Null. Wenn die Bühne zentriert ist, bewegen Sie die Schüssel in den Petrischalenhalter des Mikroskops und richten Sie den Rand des Stempels so aus, dass er senkrecht zur y-Achse des Petrischalenhalters steht.

Legen Sie dann den Rastermikroskop-Kraftkopf auf die Bühne und achten Sie darauf, dass die Schrittmotoren ausreichend ausgefahren sind, um zu vermeiden, dass die Spitze auf den Stempel prallt. Verwenden Sie für die Bildgebung die Mikroskopknöpfe, um die Rasterkraftmikroskopspitze über die linke Ecke der 4,5 x 4,5 Quadrat-Mikrometer-Vertiefungen zu zentrieren und wählen Sie den Kraftmapping-Modus in der Mikroskopsoftware. Um eine Kraftkarte von 64 x 64 über einen Bereich von 100 x 100 Mikrometern einzustellen, setzen Sie den relativen Sollpunkt auf drei bis fünf Nanonewton, die Z-Länge auf vier Mikrometer, die Z-Bewegung auf konstante Dauer, die Verlängerungszeit auf 0,01 Sekunden, die Verlängerungsverzögerung auf Null, die Rückzugsverzögerung auf Null, den Verzögerungsmodus auf konstante Kraft , die Abtastrate auf 2048 Hertz.

Deaktivieren Sie Z closed loop und aktivieren Sie das quadratische Bild. Stellen Sie den schnellen Zugriff auf 100 Mikrometer, die langsame Achse auf 100 Mikrometer, den X-Offset auf Nullmikrometer, den Y-Offset auf null Mikrometer, den Rasterwinkel auf null Grad, die Pixel auf 64 x 64 und das Pixelverhältnis auf eins zu eins eins ein. Öffnen Sie als Nächstes die Automatisierungssoftware.

Wählen Sie im Popup-Fenster den Pfad zur Skriptdatei aus. Geben Sie die W1-Koordinate in der P1-Variablenlinie 239 des Eingangsfeldabschnitts des Gyfon-Skripts und den W2-Koordinatenwert in der P2-Variablenzeile 241 ein. Ordnen Sie den Pitch-Wert der Pitch-Variablenlinie 245 des Skripts zu und geben Sie die Bohrplatzdimension ein, die aus dem Design der Bohrbrunnenmuster in die W-S-Variable Linie 248 bestimmt werden kann.

Schreiben Sie den Pfad in das Speicherverzeichnis in Zeile 251, um die Daten an der gewünschten Stelle zu speichern, und setzen Sie die Gesamtflächenvariable Zeile 254 auf den Wunsch nach mehreren Enden der 100 Mikrometer. Legen Sie dann die Matrixzeile und -spalte der Kraftkurven fest, die pro Vertiefung in der Variablen Zeile 257 für Zahlenscans aufgezeichnet wurden, und klicken Sie auf Ausführen, um das Programm zu starten. Um die Daten zu analysieren, verwenden Sie die Videostudio-Code-Software, um das Python-Skript zu öffnen und das Python-Skript zum Kopieren von Dateien auszuführen, um die Kraftkurvendateien in einem Ordner zu organisieren.

Geben Sie den Pfad zum allgemeinen Ordner ein, in dem die Daten gespeichert werden. Um die Kraftkurven zu analysieren, öffnen Sie die Datenverarbeitungssoftware des Rasterkraftmikroskopherstellers. Wählen Sie im Menü Datei den Stapel von Spektroskopiekurven aus.

Wählen Sie als Nächstes Datei und Ladevorgang und wählen Sie den Steifigkeitsprozess aus. Wählen Sie den letzten Schritt des Prozesses aus und klicken Sie auf Behalten und auf alle anwenden, damit alle Kraftkurven die gleiche Behandlung erhalten. Um das R-Skript zu öffnen, laden Sie die Dateien mit den mit der Datenverarbeitungssoftware extrahierten Informationen in die R Studio-Software.

Klicken Sie im Umgebungsfenster auf Datensatz importieren und im Popupfenster im Textleser auf Durchsuchen, um die Punkt-TSV-Datei zu suchen. Sobald die Datei geladen wurde, wählen Sie Codeausführungsregion und führen Sie alle aus, um den gesamten Code auszuführen. Hier werden typische Histogramme gezeigt, die mit dem protokolliert erhalten wurden.

In dieser Analyse wurde die Steifigkeitsrepartition an 957 nativen Zellen aufgezeichnet, während in dieser Analyse die Steifigkeit von 574 mit Caspofungin behandelten Zellen gemessen wurde. Wisse, dass die Verwendung von Hunderten von Zellen eine bimodale Verteilung der zu beobachtenden Werte ermöglicht. In kleineren Stichproben wird typischerweise eine einzelne Verteilung beobachtet, die zu einer mangelnden Beobachtung der Heterogenität der Population führen kann.

Ein Vergleich der beiden Bedingungen unterstreicht die Auswirkungen von Caspofungin auf die Verringerung der Zellsteifigkeit. Ein durch ANOVA-Vergleich der nativen und behandelten Zellen aufgedeckt, weisen die beiden Zustände sehr, signifikant unterschiedliche Steifigkeiten auf. Dieser Wert wurde aufgrund der großen Anzahl der analysierten Zellen erreicht, was ein größeres Vertrauen in die erhaltenen Ergebnisse bietet.

Das Hinzufügen des Überstands zum PDMS-Stempel, bevor die Zellen wiederholt in die Vertiefungen gespült werden, bis der Stempel voll ist, ist entscheidend für den Erfolg der Analyse. In diesem Proof of Concept wurden Candida albicans-Zellen analysiert, aber das Protokoll kann auf jede Gruppe von Musterzellen, Molekülen oder Materialien angewendet werden.