Name: Herstellung einer biomimetischen Nano-Matrix mit Janus Base Nanotubes und Fibronectin zur Stammzellhaftung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung einer biomimetischen Nano-Matrix aus Janus Base Nanotubes und Fibronectin zur Stammzellhaftung. Diese Methode fördert die Adhäsion humaner mesenchymaler Stammzellen für Anwendungen in der Geweberegeneration.

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Diese Arbeit wird finanziell unterstützt durch NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) und University of Connecticut.

1. Synthese von JBNTs
HINWEIS: JBNT monomer wurde wie zuvor veröffentlicht11erstellt.
<ol><li>Synthese der Verbindung A1<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung vor, die 8,50 g 2-Cyanoessigsäure und 9,80 g Ethylcarbamat in 25 ml Toluin und 2,5 ml N, N-Dimethylformamid enthält. 4,90 ml Phosphorylchlorid tropfenweise hinzufügen. Dann die Mischung auf 70 °C erhitzen und 1,5 h rühren.</li>
		<li>Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur und gießen Sie 100 g Eiswasser ein. Die wässrige Schicht mit Ethylacetat (3 x 250 ml) abziehen und mit 100 ml Sole waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Flüchtige unter Vakuum, um einen hellgelben Feststoff zu erhalten.</li>
		<li>Den gelben Feststoff der Kieselgel-Flashsäulenchromatographie (3% Methanol/Dichlormethan) unterziehen, um 15,61 g Verbindung A1 als weißes Pulver zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A2<ol>
<li>3,12 g Verbindung A1 und 2,75 g Kaliumcarbonat in 50 ml N, N-Dimethylformamid mischen. Bei Raumtemperatur 2 h umrühren.</li>
		<li>Fügen Sie der Reaktionssuspension 2,6 ml Kohlenstoffdisulfid hinzu. Halten Sie rühren für 4 h.</li>
		<li>Absolutes Ethanol bei 0 °C in das Reaktionsgemisch geben. Filtern Sie den gelben Niederschlag heraus und waschen Sie ihn mit dem Ethylether. Unter Vakuum über Nacht trocknen, um 6,18 g Verbindung A2 als hellgelb fest zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A3<ol>
<li>2,7 ml Methyljodid in 15 ml Acetonitril hinzufügen. Außerdem eine Lösung der Verbindung A2 separat vorbereiten, indem 6,18 g A2 bis 80 ml Wasser/Acetonitril (7:3-Verhältnis) hinzugefügt werden. Mischen Sie beide Lösungen und rühren Sie bei Raumtemperatur für 30 min.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch auf 95 °C erhitzen und 3 h rühren.</li>
		<li>Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur, und verdampfen Sie dann die Flüchtigen unter Vakuum.</li>
		<li>Den Rückstand 3x mit 100 ml Ethylacetat extrahieren und mit Salzlake waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um einen gelben Feststoff zu erhalten.</li>
		<li>Den gelben Feststoff der Kieselgel-Blitzsäulenchromatographie (30% Ethylacetat/Hexane) unterziehen, um 4,52 g der Verbindung A3 als hellgelben Feststoff zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A4<ol>
<li>Bereiten Sie die Allylaminlösung vor, indem Sie 925 L Allylamin in 20 ml Ethanol hinzufügen. Fügen Sie diese Lösung tropfenweise in die Lösung der Verbindung A3, vorbereitet durch Zugabe von 3,14 g A3 in 75 ml absolutem Ethanol, über 30 min. Dann erhitzen Sie das Reaktionsgemisch zu Reflux für 16 h.</li>
		<li>Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur und verdampfen Sie die Flüchtigen, um einen gelben Feststoff zu geben.</li>
		<li>Den gelben Feststoff der Kieselgel-Säulenchromatographie (50% Ethylacetat/Hexanen bis 2% Methanol/Dichlormethan) unterziehen, um 1,80 g Verbindung A4 als weißen Kristall zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A5<ol>
<li>2,05 g Guanidiniumhydrochlorid und 7,8 ml Natriumethoxid (21 Gew.-% in Ethanol) in 14 ml absolutes Ethanol hinzufügen. Das Gemisch 15 min auf 45 °C erhitzen.</li>
		<li>Filtern Sie das unlösliche Material ab und fügen Sie das Filtrat direkt in die Lösung der Verbindung A4 ein, die durch Zugabe von 2,70 g A4 in 40 ml absolutem Ethanol hergestellt wird. Erhitzen Sie das Reaktionsgemisch auf Reflux für 16 h.</li>
		<li>Filtern Sie den Niederschlag heraus, um 2,65 g Verbindung A5 als off-white Feststoff zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A6<ol>
<li>Fügen Sie 24,9 ml Triethylamin langsam in das Güllegemisch, das durch Zugabe von 2,11 g Verbindung A5 und 1,10 g 4-Dimethylaminopyridin in 120 ml Tetrahydrofuran über 1 min erhalten wird. Bei Raumtemperatur 2 min rühren.</li>
		<li>20,7 ml Di-Tert-Butyldicarbonat tropfenweise in das Reaktionsgemisch geben und bei Raumtemperatur 40 h rühren.</li>
		<li>Fügen Sie 20 ml Wasser hinzu, um die Reaktion zu löschen. Verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum.</li>
		<li>Extrahieren Sie den roten viskosen Rückstand mit 500 ml Ethylacetat. Dann mit 250 ml Wasser, 75 ml 10% Zitronensäure, 2x mit 200 ml Wasser, 200 ml gesättigtem Natriumbicarbonat und 200 ml Sole einwaschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um einen rot/orange festen Körper zu geben.</li>
		<li>Den Feststoff der Kieselgel-Säulenchromatographie (0-20% Ethylacetat/Hexane) unterziehen, um 3,87 g Verbindung A6 als weißen Schaum zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A7<ol>
<li>N-Methylmorpholine N-Oxid (50 Gew.% in Wasser, 1,64 ml) tropfenweise in die Lösung der Verbindung A6 (2,93 g) in Aceton/Wasser (8:1, 58,5 ml) geben und bei Raumtemperatur 5 min rühren.</li>
		<li>Osmiumtetraoxid (4% wässrige Lösung) über einen Zeitraum von 3 min tropfenweise in das Gemisch geben und bei Raumtemperatur 24 h rühren.</li>
		<li>Die Reaktion mit 1,0 M wässrigem Natriumsulfit ablöschen, bis die Lösung farblos wird. Entfernen Sie die flüchtigen Stoffe unter Vakuum, um eine weiße Gülle in Wasser zu führen. Den Rückstand mit 350 ml Dichlormethan abziehen und dann mit 150 ml Wasser waschen, gefolgt von einer Wäsche mit 150 ml Sole.</li>
		<li>Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um 2,45 g Verbindung A7 als weißen Feststoff zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A8<ol>
<li>760 g Natriumperiodid in 35 ml Dichlormethan/Wasser (6:1, 35 ml) in das Gemisch von 1,36 g Verbindung A7 geben und bei Raumtemperatur 42 h rühren.</li>
		<li>Filtern Sie das unlösliche Material ab und konzentrieren Sie das Filtrat unter Vakuum. Die resultierenden Rückstände mit 250 ml Dichlormethan extrahieren und dann mit 100 ml Wasser und 100 ml Sole waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um das Rohprodukt zu erhalten.</li>
		<li>Das Rohprodukt der Kieselgel-Säulenchromatographie (5-40% Ethylacetat/Hexane, dann 5% Methanol/Dichlormethan) auf 1,08 g Verbindung A8 auferliegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A9<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von 830 mg Verbindung A8 in 15 ml 1,2-Dichlorethan vor. Fügen Sie die Lösung tropfenweise in das Gemisch aus 6-Benzyloxycarbonylamino-2-L-Amino-Hexanosäure-Trimethylsilyl-Ethylester (649,5 mg) und N,N-Diisopropylethylamin (591 l) in 24 ml von 1,2-Dichlorethan über 3 min und rühren bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
		<li>360,3 mg Natriumtriacetoxyborohydrid in die Lösung geben und bei Raumtemperatur 24 h rühren.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch mit 6 ml Wasser ablöschen. Das Reaktionsgemisch 3x mit 200 ml Dichlormethan extrahieren und mit 200 ml 10% Zitronensäure in Wasser, 2x mit 200 ml Wasser, 200 ml gesättigtem Natriumbicarbonat und 200 ml Sole in dieser Reihenfolge waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um das Rohprodukt zu erhalten.</li>
		<li>Das Rohprodukt der Kieselgel-Flashsäulenchromatographie (5-30% Ethylacetat/Hexane) auf 885 mg Verbindung A9 aussetzen.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese von JBNT-Monomer<ol>
<li>0,54 g Verbindung A9 (0,54 g) in 10 ml 94% Trifluoressigsäure/Thioanisollösung auflösen und bei Raumtemperatur 72 h rühren.</li>
		<li>Diethylether (80 ml) dem Reaktionsgemisch hinzufügen und den Niederschlag zentrieren. Gießen Sie die klare Trifluoressigsäure, die Überstand enthält, und waschen Sie den weißen Niederschlag mit Demethylether und Methanol, um 168,6 mg Roh-JBNT-Monomer(Ergänzungsdatei 1) zu ergeben.</li>
		<li>Reinigen Sie das rohe JBNT-Monomer durch eine hochleistungsreiche Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Reverse-Phase-Säule. Das Isolationsprogramm ist unten aufgeführt: Lösungsmittel A: 100% Wasser; Lösungsmittel B: 100% Acetonitril; Lösungsmittel C: pH=1 HCl-Wasserlösung; Durchfluss: 3 ml/min (siehe Tabelle 1).</li>
		<li>Sammeln Sie den größten Gipfel in etwa 7,2 min.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Herstellung für JBNT/FN
<ol><li>Fügen Sie die wässrige Lösung JBNT mit 80 l von 1 mg/ml mehrmals in eine 1 mg/ml FN-Wässerlösung und Pipette.</li>
	<li>Prüfen Sie, ob eine weiße Feststoffsuspension nach dem Pipetieren ca. 10 s ist. HINWEIS: Ein Video wurde aufgenommen, um den Selbstmontageprozess von NM (Supplemental File 2) zu erfassen.</li>
</ol>3. Beobachtung lyophilisierter Proben
HINWEIS: Dieser Schritt wird ausgeführt, um die Gerüststruktur von NM aus JBNTs und FN anzuzeigen.
<ol><li>Bereiten Sie FN-, JBNT- und FN/JBNT NM-Lösungen für die Lyophilisierte Materialbeobachtung vor. Verdünnen Sie 10 l von 100 g/ml FN mit 40 l destilliertem Wasser, um eine 20-g/ml-Lösung von FN herzustellen.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mg/ml Lösung von JBNTs durch Verdünnung von 5 l von 1 mg/ml JBNTs in 45 l DI-Wasser vor.</li>
	<li>Mischen Sie 10 l von 100 g/ml FN und 5 x l von 1 mg/ml JBNTs in 35 l DI-Wasser, um die NM-Lösung zu bilden.</li>
	<li>Beschichten Sie drei Bohrungen mit 96-gut klaren rundrunden Boden-Mikroplatten mit der FN-, JBNT-Lösung bzw. NM-Lösung. Jeder Brunnen erhält 50 l der Lösung.</li>
	<li>Führen Sie eine Lyophilisierung durch, wie unten beschrieben, um die Gerüststruktur des NM zu visualisieren.<ol>
<li>Einfrieren der Platte bei -80 °C über Nacht.</li>
		<li>Schalten Sie das lyophilisierte Instrument und die Vakuumpumpe ein.</li>
		<li>Drücken Sie die Abkühltaste, um die Temperatur des Systems auf -50 °C zu reduzieren.</li>
		<li>Legen Sie die gefrorene Platte in das lyophilisierte Instrument und schließen Sie alle Öffnungen der Instrumente.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Starttaste, um den Systemdruck auf 0,9 mbar zu reduzieren.</li>
		<li>Nach 4 h drücken Sie die Belüftungstaste und öffnen Sie das Ventil, um den Systemdruck auf den atmosphärischen Druck zu erhöhen.</li>
		<li>Nehmen Sie die Platte aus dem lyophilisierten Instrument.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Mikroskop, um die FN, JBNTs und das resultierende selbstmontierte NM zu beobachten. Nehmen Sie mehrere Fotos mit einer Kamera für die Materialien.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Absorptionsspektrenmessung
HINWEIS: Verwenden Sie den Spektrenwechsel für FN und JBNTs, um den selbst montierten JBNT/FN NM12vorzustellen.
<ol><li>Mischen Sie 30 l von 100 g/ml FN mit 15 l destilliertem Wasser und 5 l von 1 mg/ml JBNTs, um die JBNT/FN NM-Lösung vorzubereiten. Weiße feste Suspension kann nach dem Pipettieren der Lösung mehrmals gesehen werden. ANMERKUNG: Die Endkonzentrationen von JBNTs und FN in der Lösung betragen 100 g/ml bzw. 60 g/ml. JBNTs und FN-Lösungen in der gleichen Konzentration wie in der NM-Lösung wurden ebenfalls als Steuerungslösungen vorbereitet.</li>
	<li>Verdünnen Sie 5 l von 1 mg/ml JBNTs mit 45 l destilliertem Wasser, um die JBNT-Kontrolllösung vorzubereiten.</li>
	<li>Zur Herstellung der FN-Kontrolllösung 30 l von 100 g/ml FN mit 20 l destilliertem Wasser verdünnen.</li>
	<li>Messen Sie die UV-Vis-Absorptionsspektren von FN-, JBNT- und JBNT/FN NM-Lösungen mit dem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle), um die Montage von NM zu charakterisieren.<ol>
<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche UV-Vis. Reinigen Sie die Testfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 l destilliertes Wasser darauf fallen. Messen Sie es als Leerzeichen von 190-850 nm.</li>
		<li>Reinigen Sie die Testfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 L FN-Lösung darauf fallen. Messen Sie die UV-Vis Absorptionsspektren der FN-Lösung von 190 nm bis 850 nm.</li>
		<li>Reinigen Sie die Testfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 L JBNT-Lösung darauf fallen. Messen Sie die Absorptionsspektren der JBNT-Lösung von 190 nm bis 850 nm.</li>
		<li>Reinigen Sie die Testoberfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 L JBNT/FN NM-Lösung darauf fallen. Messen Sie die Absorptionsspektren der JBNT/FN NM-Lösung von 190 nm bis 850 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Vorbereitung von JBNT/FN NM für die elektronische Übertragungsmikroskopie (TEM)
<ol><li>Reinigen Sie mehrere Gitter vor negativer Färbung mit einem grundlegenden Plasmareiniger (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Führen Sie die negative Färbung für die Proben nach zwei verschiedenen Prozessen durch.<ol>
<li>Lassen Sie 3 l von 1 mg/ml jbNTs wässrige Lösung und 3 l JBNT/FN NM-Lösung auf getrennten Gittern fallen und lassen Sie es für 2 min. Spülen Sie dann jedes Gitter mit 100 l 0,5% Uranylacetat (UA) Lösung. Entleeren Sie die überschüssige Lösung mit Filterpapier und trocknen Sie die Gitter lufttrocken.</li>
		<li>Mischen Sie die JBNT/FN NM-Lösung mit einer Lösung von 3 l mit einer UA-Lösung von 2,0 % und führen Sie sie mehrmals durch. Pipette die gemischte Lösung auf den Gittern und halten Sie es auf den Gittern für 2 min. Verwenden Sie ein Filterpapier, um die gemischte Lösung aus den Gittern zu entfernen und die Gitter bei Raumtemperatur zu trocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schließlich charakterisieren Sie die Probe für JBNTs, JBNT/FN NM mit Schritt 5.2.1 und JBNT/FN NM mit Schritt 5.2.2 mit dem TEM gebeizt.</li>
</ol>6. In-vitro-Biologische Funktion Assay
<ol><li>Fügen Sie 200 L Negativsteuerungen (NC, PBS), JBNTs, FN und die JBNT/FN NM-Lösungen in einen Brunnen einer 8-Well-Kammerrutsche ein.</li>
	<li>Das 8-well-kammerförmige Deckglas mit dem lyophilisierten Instrument trocknen, um Materialien auf dem Boden der Brunnen zu beschichten. Das Protokoll zum Gefriertrocknen entspricht Schritt 3.5.</li>
	<li>Dann 10.000 Zellen/Brunnen hMSCs (Passage 3) in die Brunnen geben und 24 h bei 37 °C mit 5%CO2bebrüten.</li>
	<li>Nach der Inkubation das Zellkulturmedium aus den Brunnen herauspipetten und die Kultur mit 1x PBS-Lösung abspülen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l der fixativen Lösung zu jedem Brunnen mit Zellen hinzu und lassen Sie sie 5 min. Spülen Sie zellen vorsichtig mit 1x PBS zweimal.</li>
	<li>1% Triton-X 100 bis 0,1% verdünnen. Fügen Sie 100 l von 0,1% Triton-X 100 zu jedem Brunnen mit Zellen hinzu und lassen Sie es 10 min. Spülen Sie zellen vorsichtig mit 1x PBS zweimal.</li>
	<li>Verdünnen Sie das Rhodamine Phalloidin auf 1,65 m. Fügen Sie 100 L Rhodamine Phalloidin zu jedem Brunnen mit Zellen hinzu und inkubieren Sie das kammerförmige Deckglas, das bei Raumtemperatur 30 min vom Licht gehalten wird. Spülen Sie zellen vorsichtig mit 1x PBS zweimal.</li>
	<li>Erfassen Sie die Zellbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellennummern für fluoreszierende Bilder für jede Gruppe. Berechnen Sie die Zellhaftungsdichte, indem Sie in jedem Brunnen drei zufällige Bereiche durchschnittlich umstellen.</li>
	<li>Präsentieren Sie alle Daten als durchschnittliche ± Standardabweichung (SD). Führen Sie statistische Analysen mit einem einseitigen t-Test durch, gefolgt von einer Varianzanalyse (ANOVA) mit p<0.05, die als statistisch signifikant angesehen wird.</li>
</ol>

<ol><li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li>
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<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Material%22%5BJournal%5D)">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089(2017).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li>
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Dr. Yupeng Chen ist Mitbegründer von NanoDe Therapeutics, Inc.

In dieser Studie entwickelten wir ein selbstzusammengesetztes biomimetisches NM, das mit DNA-inspirierten JBNTs und FN gebildet wurde. Bei der Herstellung der JBNT-Lösung sollte das lyophilisierte JBNT-Pulver anstelle von PBS ins Wasser aufgelöst werden, da PBS eine Agglomeration von JBNTs verursacht, was ihre Montage hemmt. Darüber hinaus sollte das NM auch in Wasser montiert werden, wenn wir die nanofibrilen Strukturen des NM beobachten wollen, da das Salz in PBS mit NM-Fasern gebündelt wird, was die Auflösung der Bild...

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) haben das Potenzial für Selbsterneuerung und Selbstdifferenzierung entlang verschiedener mesenchymaler Abstammunggezeigt, was bei der Regeneration und Erhaltung von Geweben hilft1. Basierend auf dem Differenzierungspotenzial werden hMSCs als Kandidaten für mesenchymale Gewebeverletzungen und hämatopoetische Störungstherapie2betrachtet. hMSCs haben die Fähigkeit gezeigt, die Wundheilung durch Erhöhung der Gewebereparatur, Angiogenese und Verringerung der Entzündung3zu fördern. Ohne hilfe durch biochemische oder biomaterialien ist die Effizienz der hMSCs, ein Zielgewebe zu erreichen und am gewünschten Ort zu funktionieren, gering4. Obwohl verschiedene technische Gerüste verwendet wurden, um hMSCs anzuziehen, um an den Läsionen festzuhängen, sind einige Stellen wie Wachstumsplattenfrakturen in der Mitte eines langen Knochens nicht leicht zugänglich durch die herkömmlichen vorgefertigten Gerüste, die möglicherweise nicht perfekt in eine unregelmäßig geformte verletzte Stelle passen.
Hier haben wir ein biomimetisches Nanomaterial entwickelt, das sich vor Ort selbst zusammenbauen und in ein schwer erreichbares Zielgebiet injiziert werden kann. Das injizierbare Biogerüst NM besteht aus Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN). JBNTs, auch bekannt als Rosette Nanotubes (RNTs), werden aus DNA-Basenpaaren abgeleitet, insbesondere Thymin und Adenin, hier5,6,7. Wie in Abbildung 1dargestellt, bilden sich die Nanoröhren, wenn sich sechs Moleküle der abgeleiteten DNA-Basenpaare selbst über Wasserstoffbindungen zu einer Ebene6zusammensetzen. Sechs Moleküle werden dann über eine starke Pi-Stacking-Wechselwirkung7,die bis zu 200-300 m lang sein kann, in einer Ebene übereinander gestapelt. Die JBNTs wurden entwickelt, um Kollagenfasern morphologisch nachzuahmen, so dass FN mit ihnen reagiert.
FN ist ein hochmolekulares Klebeglykoprotein, das in der extrazellulären Matrix (ECM)9zu finden ist. Diese können die Befestigung von Stammzellen an anderen Komponenten des ECM, insbesondere Kollagen10, vermitteln. Wir haben JBNTs entwickelt, um Kollagenfasern morphologisch nachzuahmen, so dass FN mit ihnen reagieren kann, um NM in wenigen Sekunden durch nicht kovalente Bindung zu bilden. Daher ist NM ein vielversprechendes Biogerüst, das in eine Knochenbruchstelle injiziert werden kann, die von den konventionell gefertigten Gerüsten nicht zugänglich ist. Hier präsentiert das injizierbare NM eine hervorragende Fähigkeit, die hMSC-Verankerung in vitro zu verbessern und zeigt ihr Potenzial, als Gerüst für die Geweberegeneration zu dienen.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dichlorethan</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>2-Cyanoessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimethylaminopyridin</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8-Wells Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>absolutes Ethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>Allylamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>Basic Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>konzentriert Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes Wasser</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Di-tert-butyldicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>Ethylcarbamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fixierlösung (4 % Formaldehyd in PBS hergestellt)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>Guanidiniumhydrochlorid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>Mensch mesenchymale Stammzellen</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Methyliodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamin</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-Methylmorpholin N-oxid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetraoxid</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpufferlösung</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorylchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumcarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>Umkehrphasensäule</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Kieselgel</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumethoxid</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>Natriumperiodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>Natriumtriacetoxyborhydrid</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer (NanoDrop One/Onec UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stammzellwachstumsmedium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Thioanisol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung einer biomimetischen nano-matrix mit janus base nanotubes und fibronectin zur stammzellhaftung

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Ein biomimetisches NM wurde entwickelt, um als gewebetechnisches biologisches Gerüst zu dienen, das die Stammzellverankerung verbessern kann. Das biomimetische NM wird aus JBNTs und FN durch Selbstmontage in wässriger Lösung gebildet. JBNTs messen 200-300 m lang mit inneren hydrophoben Hohlkanälen und äußeren hydrophilen Oberflächen. JBNTs sind positiv geladen und FNs sind negativ geladen. Daher werden sie, wenn sie in eine neutrale wässrige Lösung injiziert werden, über nicht kovalente Bindungen zu den NM-Bündeln zusammengebunden. Der Selbstmontageprozess wird innerhalb weniger Sekunden ohne chemische Initiatoren, Wärmequelle oder UV-Licht abgeschlossen. Wenn der pH-Wert der NM-Lösung niedriger ist als der isoelektrische Punkt von FNs (pI 5.5-6.0), werden sich die NM-Bundles aufgrund des Vorhandenseins von positiv geladenem FN selbst freisetzen.
NM ist dafür bekannt, die extrazelluläre Matrix (ECM) morphologisch nachzuahmen und kann daher als injizierbares Gerüst verwendet werden, das eine hervorragende Plattform zur Verbesserung der hMSC-Haftung bietet. Zelldichteanalysen und Fluoreszenz-Bildgebungsexperimente zeigten, dass die NMs die Verankerung von hMSCs im Vergleich zur Negativkontrolle signifikant erhöhten.

Unsere Studien entdeckten, dass die Bildung des NM von JBNTs und FN schnell ist, was in 10 Sekunden geschah. Wie in Abbildung 2dargestellt, wurde weißes Flockel erhalten, wenn die JBNT-Lösung mit der FN-Lösung gemischt und mehrmals pipettiert wurde. Der Entstehungsprozess von NM ist vollständig biomimetisch. Es sind keine äußeren Reize erforderlich. Der Herstellungsprozess ist viel einfacher als der einiger aufkommenden Biomaterialien, die auf ultraviolettem Licht oder chemischem Initiator f...

Ziel dieses Protokolls ist es, die Montage einer biomimetischen Nanomatrix (NM) mit Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN) zu zeigen. Bei der Kokultur mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) weisen die NMs eine ausgezeichnete Bioaktivität bei der Förderung der hMSCs Adhäsion auf.

Herstellung einer biomimetischen Nano-Matrix mit Janus Base Nanotubes und Fibronectin zur Stammzellhaftung

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

Wir haben eine biomimetische Nanomatrix entwickelt, die vielversprechend ist, um als Gerüst für die Gewebezüchtung zu dienen. Dieses Protokoll zeigt, wie man die Nanomatrix aus Janus-Basis-Nanoröhren, die in meinem Labor synthetisiert wurden, sowie das Fibronektin-Protein zusammensetzt. Diese Nano-Matrix kann sich in wenigen Sekunden ohne zusätzliche Hilfe selbst zusammenbauen.Bei der Co-Kultivierung mit humanen mesenchymalen Stammzellen zeigte die Nanomatrix eine hervorragende Bioaktivität bei der Förderung der Zelladhäsion. Die Nanomatrix ahmt die extrazelluläre Matrix morphologisch nach. Daher hat es das Potenzial, als injizierbares Gerüst zur Reparatur von Knochenbrüchen zu dienen, indem es die Zelladhäsion und -funktion am Zielort fördert.Beginnen Sie mit der Herstellung der Nanomatrix. Geben Sie 80 Mikroliter Nanoröhrchen auf Janusbasis von einem Milligramm pro Milliliter zu 40 Mikrolitern Fibronektin von einem Milligramm pro Milliliter und pipettieren Sie die Mischung mehrmals vorsichtig und langsam. Überprüfen Sie das Rohr nach 10 Sekunden visuell auf das Vorhandensein einer weißen festen Suspension.Bereiten Sie als Nächstes Fibronektin-, JBNT- und Fibronektin/JBNT-Nanomatrixlösungen für die Beobachtung lyophilisierter Materialien gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor. Beschichten Sie drei Vertiefungen einer klaren Mikroplatte mit 96 Vertiefungen und rundem Boden mit Lösungen und fügen Sie jeder Vertiefung 50 Mikroliter hinzu. Frieren Sie die Platte über Nacht bei minus 80 Grad Celsius ein.Schalten Sie am nächsten Tag das lyophilisierte Instrument und die Vakuumpumpe ein und drücken Sie die Abkühltaste, um die Temperatur des Systems auf minus 50 Grad Celsius zu senken. Setzen Sie die gefrorene Platte in das Instrument ein und schließen Sie alle Öffnungen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um den Systemdruck auf 0,9 Millibar zu reduzieren.Drücken Sie nach vier Stunden die Belüftungstaste und öffnen Sie das Ventil, um den Systemdruck auf den atmosphärischen Druck zu erhöhen. Nehmen Sie dann die Platte aus dem lyophilisierten Instrument. Bereiten Sie die JBNT/Fibronektin-Nanomatrixlösung wie im Textmanuskript beschrieben vor und verdünnen Sie die JBNT- und Fibronektinlösungen mit destilliertem Wasser, um Kontrolllösungen herzustellen.Messen Sie die Absorptionsspektren der Lösungen mit dem Spektralphotometer, um den Aufbau von Nanomatrizen zu charakterisieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche UV-Vis. Reinigen Sie dann die Testoberfläche des Spektralphotometers und tropfen Sie zwei Mikroliter destilliertes Wasser darauf.Messen Sie das Wasser als Blank von 190 bis 850 Nanometern. Reinigen Sie für jede Probe die Testoberfläche und tropfen Sie zwei Mikroliter der Lösung darauf. Messen Sie dann die UV-Vis-Absorptionsspektren von 190 bis 850 Nanometern.Geben Sie 200 Mikroliter Negativkontrollen, JBNTs, Fibronektin und die Nanomatrixlösungen in die Vertiefungen eines Objektträgers mit acht Vertiefungen. Trocknen Sie das Deckglas mit acht Vertiefungen mit dem lyophilisierten Instrument, um den Boden der Vertiefungen mit Materialien zu beschichten. Geben Sie dann 10.000 menschliche mesenchymale Stammzellen in jede Vertiefung des Deckglases und inkubieren Sie es 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.Entfernen Sie nach der Inkubation das Zellkulturmedium aus den Vertiefungen und spülen Sie sie mit PBS aus. Geben Sie 100 Mikroliter der Fixierlösung in jede Vertiefung und lassen Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie dann die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS und geben Sie 100 Mikroliter 0,1 % Triton X-100 in jede Vertiefung.Wiederholen Sie nach 10 Minuten die Spülungen mit PBS. Geben Sie 100 Mikroliter Rhodamin-Phalloidin in jede Vertiefung und inkubieren Sie das Deckglas 30 Minuten lang, um es vor Licht zu schützen. Spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS und bilden Sie sie mit einem Fluoreszenzmikroskop ab.Die Bildung von Nano-Matrizen ist schnell und vollständig biomimetisch. Die weiße Flockung war 10 Sekunden nach dem Mischen der JBNT-Lösung mit der Fibronektinlösung sichtbar. Kamerabilder von Fibronektin, JBNTs und der Nanomatrix wurden aufgenommen und analysiert.In der Fibronektingruppe wurden keine langen Fasern beobachtet, was darauf hindeutet, dass sich die Gerüststruktur ohne JBNTs nicht bilden kann. JBNTs erscheinen als lange und dünne Fasern. Bei der Vernetzung mit Fibronektin kann die Nanomatrixfaser bis zu mehreren Zentimeter lang werden.Der Zusammenbau der Nano-Matrix wurde auch durch die Aufnahme von UV-Vis-Spektren bestätigt. Die beiden Absorptionsspitzen von JBNTs allein nehmen nach der Bildung der Nanomatrix ab. Die Transmissionselektronenmikroskopie wurde verwendet, um die Morphologie der JBNTs und Nanomatrizen zu charakterisieren.Bei den JBNTs handelt es sich um schlanke Rohre mit einheitlichen Durchmessern. Wenn sie mit Fibronektin gemischt werden, bilden sie über Ladungswechselwirkungen eine lange Myom-Nanomatrix. Wenn der pH-Wert niedriger ist als der isoelektrische Punkt des Fibronektins, bündelt die Nanomatrix aufgrund des positiv geladenen Fibronektins die Selbstfreisetzung.Die Wirkung der JBNT/Fibronektin-Nanomatrix auf die Zelladhäsion wurde ebenfalls untersucht. Da Nanomatrizen so konzipiert sind, dass sie die extrazelluläre Matrix morphologisch nachahmen, bieten sie ein Gerüst und erhöhen die Zelladhäsion. Die Fluoreszenzmikroskopie bestätigte, dass die Inkubation mit den Nanomatrizen die Zelladhäsion erhöhte.Im folgenden Verfahren können die Zellmigration, die Differenzierung und die Langzeitfunktion gezeigt werden, um die Wirkung der Nano-Matrix auf das Wachstum und die Funktionen menschlicher mesenchymaler Stammzellen weiter zu untersuchen.

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Herstellung von biomimetischen Herzzellkultursubstraten, die aus zwei unterschiedlichen Polymermaterialien mittels Kapillarkraftlithographie hergestellt werden.  Die beschriebenen Methoden bieten eine skalierbare, kostengünstige Technik, um die Struktur und Funktion von makroskopischem Herzgewebe für in vitro und in vivo Anwendungen zu entwickeln.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

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