Name: Selbstmontage von Gamma-modifizierten Peptid-Nukleinsäuren in komplexe Nanostrukturen in organischen Lösungsmittelmischungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Selbstassemblierung von Gamma-PNA-Nanostrukturen in organischen Lösungsmitteln. Diese Methode ermöglicht die Anpassung nukleinsäurebasierter Nanotechnologie an nichtwässrige Umgebungen für biochemische Forschung.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch das Stipendium der National Science Foundation 1739308, das NSF CAREER-Stipendium 1944130 und das Air Force Office of Science Research Grant-Nummer FA9550-18-1-0199 unterstützt. "PNA-Sequenzen waren ein großzügiges Geschenk von Dr. Tumul Srivastava von Trucode Gene Repair, Inc. Wir danken Dr. Erik Winfree und Dr. Rizal Hariadi für ihre hilfreichen Gespräche zum DNA Design Toolbox MATLAB Code. Wir danken auch Joseph Suhan, Mara Sullivan und dem Center for Biological Imaging für ihre Unterstützung bei der Erfassung von TEM-Daten.

1. PNA-Sequenzdesign
<ol><li>Laden Sie die DNA Design Toolbox22 herunter, die vom Winfree Lab bei Caltech23 entwickelt wurde, in den Ordner mit Programmierskripten zum Entwerfen von Sequenzen.</li>
	<li>Öffnen Sie in diesem Sequenzentwurfsordner eine Programmiersprache der vierten Generation, die mit der Dateierweiterung ".m" kompatibel ist, und fügen Sie dann den zuvor heruntergeladenen Ordner "DNAdesign" mit dem folgenden Befehl zum Pfad hinzu: >> Pfad Hinzufügen DNAdesign</li>
	<li>Führen Sie anschließend das folgende Skript mit dem Namen "PNA3nanofiber.m" (siehe Ergänzende Abbildung 1) mit dem folgenden Befehl aus: >> PNA3nanofiber</li>
	<li>Führen Sie dieses Skript aus, um Variablen mit den Namen "thisSeqs" und "thisScore" zu erstellen. Die Variable "thisSeqs" enthält die Sequenzen der entworfenen Oligomere, und "thisScore" ist der Strafpunkt.</li>
	<li>Führen Sie das Skript mehrmals aus, um die minimalste Punktzahl zu erhalten. Eine Stichprobe von 20 solcher Durchläufe ist in Tabelle 1dargestellt.</li>
	<li>Bestätigen Sie manuell die gewünschte Watson-Crick Komplementarität jeder Domäne der generierten Sequenzen für das angegebene SST-Strukturmotiv. Sequenzspezifikationen für die 3-Helix-Nanofaserstruktur sind in Tabelle 2dargestellt.</li>
	<li>Überprüfen Sie Folgendes auf generierte Sequenzen.<ol>
<li>Vermeiden Sie die Verwendung von vier aufeinanderfolgenden C- und G-Basen.</li>
		<li>Wählen Sie manuell spezifische Sequenzen für die N-Terminal-Funktionalisierung mit Fluoreszenzfarbstoff und Biotinmolekülen aus, um fluoreszierende Mikroskopiestudien zu ermöglichen.</li>
		<li>Fügen Sie mindestens 3 Mini-PEG-Gamma-Modifikationen auf dem Rückgrat ein, um eine vororganisierte Spiralkonformation in den einsträngigen Oligomeren zu ermöglichen, wie von Sahu et albeschrieben. 21
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung von PNA-Stocksträngen
<ol><li>Erhalten Sie die Komponentenstränge von PNA spezifizierten Sequenzen bei der 50-nmol-Skala-Synthese mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Reinigung von einem kommerziellen Hersteller.</li>
	<li>Setzen Sie jeden Strang in entionisiertem Wasser auf 300 M Konzentrationen aus. Bewahren Sie die resuspendierten Stränge bis zu mehreren Monaten in einem Gefrierschrank auf, bis sie zum Experimentieren benötigt werden.</li>
</ol>3. Schmelzkurvenstudien von PNA-Oligomer-Untergruppen
<ol><li>Erhalten Sie Schmelztemperaturbereiche für verschiedene Kombinationen von komplementären 2-Oligomer- und 3-Oligomer-Untergruppen, indem Sie eine Schmelzkurvenstudie in wässrigen Puffern wie 1x Phosphatgepuffern (PBS) oder bevorzugtes polares organisches Lösungsmittel wie Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) durchführen (siehe Abbildung 2). ANMERKUNG: Thermische Schmelzkurven bei >50% der DMF beginnen, die obere Grundlinie zu verlieren und zeigen schwere Störungen, teilweise aufgrund der hohen Absorption von DMF bei der Wellenlänge, die für die Experimente erforderlich ist. Dies ist ein bekanntes Phänomen in der Literatur24. Es ist jedoch möglich, die Schmelzkurven bei 5 m pro Strangkonzentration unter diesen Lösungsmittelbedingungen zu erhalten.<ol>
<li>Aliquot 16,7 l aus dem 300-M-Bestand jedes Oligomers und machen das Endvolumen entweder in 1x PBS oder 100% (v/v) DMSO oder 100% (v/v) DMF effektiv zu einer Endkonzentration von 5 m pro Oligomer. Übertragen Sie diese Oligomer-Untermenge auf einen 1 cm optischen Pfad, Quarzküvette.</li>
		<li>Führen Sie UV-Vis-Experimente mit variabler Temperatur in einem Spektralphotometer durch, das mit einem programmierbaren Temperaturblock ausgestattet ist.</li>
		<li>Sammeln Sie Datenpunkte für die Schmelzkurven über einen Temperaturbereich von 15 bis 201290 °C sowohl für Kühl- (Glühen) als auch Für Heizzyklen (Schmelzen) mit einer Rate von 0,5 °C/min. Bewahren Sie die Proben 10 min bei 90 °C vor dem Abkühlen und bei 15 °C vor dem Erhitzen auf. Bestimmen Sie die Schmelztemperatur (Tm) vom Höhepunkt der ersten Ableitung der Heizkurve.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Schmelztemperaturbereiche für 2-Oligomer-Teilmengen in allen Lösungsmittelfällen über 35 °C liegen. Überprüfen Sie außerdem, ob die entsprechenden 3-Oligomer-Untermengen, die einen zusätzlichen Strang zu ihrer äquivalenten 2-Oligomer-Untermenge enthalten, aufgrund der erhöhten Kooperativität einen erheblichen Anstieg der Tm aufweisen. HINWEIS: Dies würde sicherstellen, dass eine einzelne Topf-Selbstmontage mehrerer Oligomere mit angemessener thermischer Stabilität kooperativ in die gewünschte Nanostruktur gefaltet werden kann.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Selbstmontage-Protokoll für mehrere unterschiedliche PNA-Oligomere
ANMERKUNG: Um ein selbstbauliches thermisches Rampenprotokoll für die Nanostrukturen von PNA zu entwickeln, ist ein langsames Glüh-Glühen wünschenswert.
<ol><li>Bei erzeugten Oligomersequenzen werden die Proben für 22,5 h in einer thermischen Cyclerkühlung von 90 bis 20 °C anneal. Typischerweise liegt die Schmelztemperatur, die für 2-Oligomer- und 3-Oligomer-Untergruppen erhalten wird, in Bereichen von 40 bis 201270 °C für unterschiedliche Lösungsmittelbedingungen.</li>
	<li>Programmieren Sie den Thermischen Cycler wie folgt: halten Sie bei 90 °C für 5 min, Rampe von 90 bis 70 °C bei einer konstanten Rate von 0,1 °C/min, Rampe von 70 bis 40 °C bei einer Rate von 0,1 °C/3 min, Rampe von 40 bis 20 °C bei einer Geschwindigkeit von 0,1 °C/min und halten Sie bei 4 °C (siehe Tabelle 3). Proben können in 4 °C für 12-u201224 h vor der Charakterisierung gelagert werden. HINWEIS: Während 2- und 3-Oligomer-Teilmengen unseres Nanofasersystems in 1x PBS bilden können, werden die nanofaserigen Nanofasern im gesamten Mikron-Maßstab in 1x PBS aggregiert. Daher sollten die Lösungsmittelbedingungen basierend auf der Größe und Größe der gebildeten Struktur sowie der Art und Dichte von Gammamodifikationen optimiert werden.</li>
	<li>Für Mikron lange 3-Helix-Nanofasern, bereiten Sie Neal-Chargenproben in 75% DMSO: H2O (v/v), 75% DMF: H2O (v/v), 40% 1,4-Dioxan:H2O (v/v) auf Basis von Lösungsmitteloptimierungsstudien15.</li>
	<li>Bereiten Sie anneale Chargen wie folgt vor (siehe Tabelle 4). Zunächst können Sie für jeden Oligomer 10 L-Unterbestände mit 20-M-Konzentrationen von 20 M aus den 300-M-Hauptbeständen vorbereiten, indem Sie 0,67 l aus dem Hauptbestand aliquotieren und das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 10 l erhöhen.</li>
	<li>Aliquot 1 l aus den 20-M-Unterbeständen für jeden Oligomer und fügen Sie es zu einem 200-L-PCR-Rohr hinzu. Dies entspricht einem Gesamtvolumen von 9 l für 9 Oligomere.</li>
	<li>Fügen Sie entweder 30 l wasserfreies DMSO/DMF für die 75% DMSO-Gehäuse und 75% DMF-Fälle mit einem zusätzlichen 1 l entionisiertem Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 40 l mit jedem Oligomer bei 500 nM Endkonzentrationen zu machen. Fügen Sie 16 l von 1,4-Dioxan hinzu und machen Sie das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 40 l für den 40% Dioxan-Lösungsmittelzustand.</li>
	<li>Laden Sie die Nealchargen auf den thermischen Cycler und an neal mit dem in Schritt 4.2 genannten Protokoll.</li>
</ol>5. Gesamte interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF) Mikroskopie-Bildgebung
<ol><li>Bereiten Sie eine Feuchtigkeitskammer aus einer leeren Pipettenspitzenbox vor. Füllen Sie die Box mit ca. 5 ml Wasser, um eine Trocknung der wie folgt beschriebenen Probendurchflusskanäle zu verhindern (siehe Abbildung 3).</li>
	<li>Bereiten Sie die Durchflusskammer mit einem Mikroskopschlitten, 2 doppelseitigen Bandstreifen und nitrozellulosebeschichtetem Abdeckrutsch vor. Um den Deckelmitrutsch mit Nitrocellulose zu beschichten, tauchen Sie den Deckelschlupf in ein Becherglas, das 0,1% Kollodium in Amylacetat und lufttrocken enthält.<ol>
<li>Bereiten Sie die Nitrocelluloselösung vor, indem Sie eine 20-fache Verdünnung aus handelsüblichen 2% Kollodium in Amylacetat mit Isoamylacetatlösungsmittel herstellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die biotinylierte Rinderserumalbuminlösung (Biotin-BSA) vor, indem Sie 1 mg Biotin-BSA wiegen und in 1 ml 1x 1x PBS auflösen. Durchfluss von 1mg/ml Biotin-BSA im 1x PBS-Puffer, indem der Durchflusskanal in einem Winkel platziert wird. Inkubieren Sie den Strömungskanal für 2-4 min bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.</li>
	<li>Bereiten Sie den Waschpuffer vor, indem Sie 1 mg BSA in 1 ml 1x PBS auflösen. Waschen Sie den überschüssigen Biotin-BSA, indem Sie 15 l des Waschpuffers fließen. Um die Oberfläche passivieren, inkubieren Sie den Strömungskanal für 2–4 Min. bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.</li>
	<li>Bereiten Sie die Streptavidin-Lösung vor, indem Sie 0,5 mg Streptavidin und 1 mg BSA messen und sich dann mit 1 ml 1x PBS auflösen. Durchfluss von 0,5 mg/ml Streptavidin in 1x PBS mit 1 mg/ml BSA. Inkubieren Sie den Strömungskanal für 2-4 min bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Durchfluss 15 l des Waschpuffers, um ungebundenes Streptavidin wegzuwaschen.</li>
	<li>Durchfluss von 15 l der zuvor geglühten Charge von PNA-Oligomeren bei 500 nM Konzentration pro Strang in entweder 75% DMSO, 75% DMF oder 40% 1,4-Dioxan-Zustand. Inkubieren Sie den Durchflusskanal für 2–4 Min. bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 mM Trolox unter bevorzugten Lösungsmittelbedingungen vor, indem Sie das 10-fache aus einem 10 mM-Bestand von Trolox in DMSO verdünnen (Maßnahme 2,5 mg Trolox und in 1 ml DMSO auflösen). Waschen Sie die ungebundenen Nanostrukturen im Strömungskanal mit 15 l von 1 mM Trolox mit der gleichen Lösungsmittelzusammensetzung wie die Nanostrukturen. HINWEIS: Der DMSO-Gehalt von >50 % im Durchflusskanal würde aufgrund des unterschiedlichen Brechungsindex des Lösungsmittelzustands während TIRF geringfügige Signalstörungen verursachen, die typischerweise für Deckenrutschwasser-TIRF-Winkel kalibriert sind. Dies kann durch Waschen mit 1 mM Trolox durch Verdünnung der 10 mM Trolox 10-fach mit entionisiertem Wasser behoben werden. Diese Technik liefert klarere Bilder, ist aber nur nützlich, um zu beurteilen, ob die Bildung stattgefunden hat, da sie zweiphasige Mikroblasen im Strömungskanal erzeugt. Dadurch können Nanostrukturen an der Schnittstelle der zweiphasigen sichtbar sein, wie in Abbildung 4Ddargestellt.</li>
	<li>Übertragen Sie den Durchflusskanal auf den Diahalter und das Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit TIRF-Bildgebung ausgestattet ist, mit einem 60-fachen Öl-Immersion-Objektiv und einer 1,5-fachen Lupe. Scannen Sie den Durchflusskanal mit einer 60-fachen oder 90-fachen Vergrößerung, indem Sie den Cy3-Kanal überwachen (siehe Abbildung 4).</li>
</ol>6. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
<ol><li>Wiegen Sie 0,5 g Uranylacetat in 50 ml destilliertem Wasser, um eine 1% wässrige Uranylacetat-Färbung summieren. Filtern Sie die 1% wässrige Uranlacetat-Färbungslösung mit einem 0,2 m-Filter, der an einer Spritze befestigt ist. HINWEIS: Alternativ könnten 2% wässriges Uranylacetat bei einem kommerziellen Hersteller erworben werden.</li>
	<li>Kaufen Sie handelsübliche Formvar-Unterstützungsschicht beschichtete Kupfergitter mit 300-Maschen-Größe. HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass die Formvar-Stützschicht durch Lösungsmittel wie DMSO über 2 min gelöst werden könnte. Für eine längere Probeninkubation stehen handelsübliche Formwaren mit Siliziummonoxid auf Kupfergittern zur Verfügung, die es ermöglichen, hydrophiler zu sein als kohlenstoffbeschichtete Gitter und können kräftigen Probenbedingungen und Elektronenstrahl standhalten, wie in Abbildung 5Cdargestellt.</li>
	<li>Pipette 4 l Der Probe auf das Gitter für 15 s. Verwenden Sie ein Stück Filterpapier, um die Probe abzuleiten, indem Sie das Filterpapier von der Seite mit dem Gitter in Kontakt bringen.</li>
	<li>Fügen Sie sofort 4 l der Fleckenlösung für 5 s ins Gitter.</li>
	<li>Wick aus dem Fleck wie zuvor und halten Sie das Filterpapier gegen das Gitter für 1-u20122 min, um sicherzustellen, dass das Gitter trocken ist. Die Proben sollten in der Regel innerhalb von 1-u20122 h nach der Färbung abgebildet werden. Wenn das Gitter vollständig trocken ist, können die Gitter bis zu 3 Tage vor der Bildgebung in einer TEM-Gitterlagerbox gelagert werden.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gitter auf einen TEM-Probenhalter und ein Bild mit einem Transmissionselektronenmikroskop, das mit 80 kV betrieben wird und eine Vergrößerung von 10 K bis 150K hat (siehe Abbildung 5).</li>
</ol>7. Unterschiedliche Morphologien für PNA-DNA-Hybriden auf Basis des selektiven Ersatzes mit DNA
<ol><li>Erhalten Sie DNA-Oligomere spezifizierter Sequenzen (siehe Tabelle 5) von kommerziellen Oligonukleotidherstellern, die im 25 nmol-Skala mit Standardentaltisierung synthetisiert werden. Setzen Sie diese DNA-Sequenzen mit RNase-freiem entionisiertem Wasser bei 20 M Lagerkonzentrationen aus.</li>
	<li>Für zusammenhängende Strängeersatzteile mit DNA können sequenzen D3, D5 und D9 die Stränge p3, p5 und p9 ersetzen. Ebenso können die Sequenzen D1, D4 und D7 bei Crossover-PNA-Strangersatz durch DNA die Stränge p1, p4 und p7 ersetzen.</li>
	<li>Aliquot 1 l aus den 20-M-Unterbeständen für jeden PNA- oder DNA-Oligomer und fügen Sie es wie in Schritt 2.7 zu einem 200-L-PCR-Rohr hinzu. Fügen Sie 30 l wasserfreies DMSO und 1 l RNase-freies entionisiertes Wasser hinzu, um das Endvolumen auf 40 l zu erhöhen (siehe Tabelle 6).</li>
	<li>Laden Sie die Nealchargen auf den thermischen Cycler und an neal mit dem in Schritt 4.2 genannten Protokoll.</li>
	<li>Charakterisieren Sie die in Abschnitt 6 genannten PNA-DNA-Hybrid-Nanostrukturen unter Verwendung des TIRF-Protokolls nach den Schritten in Abschnitt 5 oder unter Verwendung des tem-Bildgebungsprotokolls (siehe Abbildung 6).</li>
</ol>8. Unterschiedliche Morphologien für DiePNA-Nanofasern in unterschiedlichen SDS-Konzentrationen
<ol><li>Bereiten Sie einen 20% (wt/v) SDS-Hauptbestand vor, indem Sie 20 mg SDS messen und in 100 l entionisiertem Wasser auflösen.</li>
	<li>Bereiten Sie einen 6% (wt/v) SDS-Unterbestand vor, indem Sie 3 l aus dem 20% SDS-Bestand aliquotieren und das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 10 'L erhöhen.</li>
	<li>Anneal die PNA-Oligomere in Endkonzentrationen von 5,25 mM und 17,5 mM SDS wie folgt. Aliquot 1 l aus den 20-M-Unterbeständen für jedes PNA-Oligomer und fügen Sie es wie in Schritt 2.7 zu einem 200-L-PCR-Rohr hinzu. Fügen Sie 30 l wasserfreies DMSO und 1 l 6 % bzw. 20 % SDS hinzu, um das Endvolumen auf 40 l zu erhöhen, um SDS-Endkonzentrationen von 5,25 mM bzw. 17,5 mM zu erreichen (siehe Tabelle 7).</li>
	<li>Laden Sie die Nealchargen mit unterschiedlichen SDS-Konzentrationen auf den thermischen Cycler und an Neal mit dem in Schritt 4.2 genannten Protokoll.</li>
	<li>Charakterisieren Sie die In-PNA-Nanostrukturen in Gegenwart von SDS unter Verwendung des TIRF-Protokolls, die den Schritten in Abschnitt 5 folgen, oder mit dem in Abschnitt 6 erwähnten TEM-Bildgebungsprotokoll (siehe Abbildung 7).</li>
</ol>

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<li>Yang, Z., Williams, D., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+protein-containing+polymers+in+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Synthesis of protein-containing polymers in organic solvents.</a> Biotechnology and Bioengineering. 45, 10-17 (1995).</li>
<li>Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+peptide+synthesis%3A+from+standard+procedures+to+the+synthesis+of+difficult+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences.</a> Nature Protocols. 2, 3247(2007).</li>
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Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Anpassung und Verbesserung bestehender Nukleinsäure-Nanotechnologieprotokolle an organische Lösungsmittelgemische. Die hier beschriebenen Methoden konzentrieren sich auf Modifikationen und Fehlerbehebung innerhalb eines definierten experimentellen Raumes ausgewählter polarer aprotischer organischer Lösungsmittel. Es gibt noch unerforschtes Potenzial für andere etablierte Nukleinsäure-Nanotechnologie-Protokolle, die in diesem Raum angepasst werden. Dies könnte potenzielle Anwendung...

Erfolgreicher Aufbau zahlreicher komplexer Nanostrukturen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 in wässrigen oder im Wesentlichen hydratisierten Medien, die mit natürlich vorkommenden Nukleinsäuren wie DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 und RNA11,12 hergestellt wurden, wurde in früheren Arbeiten gezeigt. Natürlich vorkommende Nukleinsäuren unterliegen jedoch duplexen Spiralkonformationsveränderungen oder haben in organischen Lösungsmittelmischungen13,14die thermischen Stabilitäten verringert.
Zuvor hat unser Labor eine Methode zur Konstruktion von 3-Helix-Nanofasern unter Verwendung von Gamma-Position modifizierte synthetische Nukleinsäure-Mimikikos, sogenannte Gamma-Peptid-Nukleinsäuren, gemeldet ( PNA)15 (Abbildung 1A). Die Notwendigkeit einer solchen Entwicklung und potentiellen Anwendungen der synthetischen Nukleinsäure imitiert PNA wurde im Feld16,17diskutiert. Wir haben durch eine Anpassung der für DNA-Nanostrukturen18,19,20vorgestellten Strategie für einsträngige Fliesen (SST) gezeigt, dass 9 sequenziell unterschiedliche PNA-Oligomere so konzipiert werden können, dass sie 3-Helix-Nanofasern in ausgewählten polaren aprotischen organischen Lösungsmittelmischungen wie DMSO und DMF bilden. Die "PNA-Oligomere" wurden mit Modifikationen von (R)-Diethylenglykol (Mini-PEG) an drei γ-Positionen (1, 4 und 8 Basispositionen) entlang jedes 12-Basis-Oligomers auf der Grundlage von Methoden, die von Sahu et al.veröffentlicht wurden, kommerziell bestellt. 21 Diese Gamma-Modifikationen verursachen die spiralförmige Vororganisation, die mit der höheren Bindungsaffinität und thermischen Stabilität von PNA im Verhältnis zu unverändertem PNA verbunden ist.
Dieser Artikel ist eine Adaption unserer berichteten Arbeit, in der wir die Auswirkungen von Lösungsmittellösung und Substitution mit DNA auf die Bildung von "PNA-basierten Nanostrukturen" untersuchen15. Ziel dieses Artikels ist es, detaillierte Beschreibungen des Designs sowie detaillierte Protokolle für lösungsmittelangepasste Methoden zu liefern, die für die Selbstmontage und Charakterisierung von "PNA-Nanofaser" entwickelt wurden. So stellen wir zunächst die modulare SST-Strategie vor, eine allgemeine Plattform für Nanostrukturdesign mit der synthetischen Nukleinsäure-Mimik PNA.
Die Spiraltonhöhe für PNA-Duplexe wurde als 18 Basen pro Zug im Vergleich zu DNA-Duplexen berichtet, die eine Drehung pro 10,5 Basen durchlaufen(Abbildung 1B). Daher wurde die Domänenlänge der gezeigten "PNA SSTs" auf 6 Basen festgelegt, um ein Drittel einer vollen Drehung oder 120° Drehung aufzunehmen, um eine Interaktion zwischen drei dreieckig angeordneten Helices zu ermöglichen. Im Gegensatz zu früheren SST-Motiven enthält jeder SST nur 2 Domänen, wodurch eine eindimensionale, bandartige Struktur entsteht, die zu einem Drei-Helix-Bundle umschließt (Abbildung 1C). Jedes 12-Basis-PNA-Oligomer wird an den 1,4 und 8 Positionen gammamodifiziert, um eine gleichmäßige Verteilung der Mini-PEG-Gruppen über das gesamte SST-Motiv zu gewährleisten. Darüber hinaus gibt es innerhalb des Motivs zwei Arten von Oligomeren: "zusammenhängende" Stränge, die auf einer einzigen Spirale existieren, und helix-spannende "Crossover"-Stränge (Abbildung 1D). Darüber hinaus sind die Oligomere P8 und P6 mit fluoreszierendem Cy3 (grüner Stern) bzw. Biotin (gelb oval) gekennzeichnet,um den Nachweis der Strukturbildung mittels Fluoreszenzmikroskopie zu ermöglichen. Insgesamt besteht das SST-Motiv aus insgesamt 9 Oligomeren, um die Bildung von 3-Helix-Nanofasern durch programmierte Komplementarität jeder einzelnen Domäne zur entsprechenden Domäne auf einem benachbarten Oligomer zu ermöglichen (Abbildung 1E).

<table><tbody><tr><td>&Gamma; PNA-Stränge/Oligomere</td><td>Trucode Gene Repair Inc.</td><td></td><td>Sektion 2.1</td></tr><tr><td>UV-Vis Spektralphotometer</td><td>Agilent</td><td>Varian Cary 300</td><td>Sektion 3.1.2</td></tr><tr><td>Quarzküvetten</td><td>Starna</td><td>29-Q-10</td><td>Sektion 3.1.1</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio Rad</td><td>C1000 touch</td><td>Sektion 4.1</td></tr><tr><td>0,2 mL PCR-Röhrchen</td><td>VWR</td><td>53509-304</td><td>Sektion 4.5</td></tr><tr><td>Wasserfreies DMF</td><td>VWR</td><td>EM-DX1727-6</td><td>Sektion 4.6</td></tr><tr><td>Wasserfreies DMSO</td><td>VWR</td><td>EM-MX1457-6</td><td>Abschnitt 4.6</td></tr><tr><td>Wasserfreies 1,4-Dioxan</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC615121000</td><td>Abschnitt 4.6</td></tr><tr><td>10X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>VWR</td><td>75800-994</td><td>Abschnitt 3.1.1</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>89085-399</td><td>Abschnitt 5.2</td></tr><tr><td>Deckgläser aus Glas</td><td>VWR</td><td>48382-126</td><td>Abschnitt 5.2</td></tr><tr><td>2%iges Kollodium in Amylacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9817</td><td>Abschnitt 5.2</td></tr><tr><td>Isoamylacetat</td><td>VWR</td><td>200001-180</td><td>Abschnitt 5.2</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Rinderserumalbumin (Biotin-BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td>Abschnitt 5.3</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>Abschnitt 5.4</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>sigma-aldrich</td><td>189730</td><td>Sektion 5.5</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>Sektion 5.7</td></tr><tr><td>Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>Nikon Ti2-E</td><td>Sektion 5.8</td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>Joel</td><td>JEM 1011</td><td>Sektion 6.6</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont</td><td>0203-N5AC-PO</td><td>Sektion 6.3</td></tr><tr><td>Uranylacetat-Elektron</td><td> Mikroskopie Wissenschaften</td><td>22400</td><td>Abschnitt 6.1</td></tr><tr><td>Formvar, 300 Mesh, Kupfergitter</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1701-F</td><td>Abschnitt 6.2</td></tr><tr><td>Formvar-Siliziummonoxid Typ A, 300 Mesh, Kupfergitter</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1829</td><td>Abschnitt 6.2</td></tr><tr><td>DNA-Oligomere/-Stränge</td><td>IDT</td><td></td><td>Abschnitt 7.1</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>VWR</td><td>97064-860</td><td>Abschnitt 8.1</td></tr></tbody></table>

selbstmontage von gamma-modifizierten peptid-nukleinsäuren in komplexe nanostrukturen in organischen lösungsmittelmischungen

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Aktuelle Strategien in der DNA- und RNA-Nanotechnologie ermöglichen die Selbstmontage einer Vielzahl von Nukleinsäure-Nanostrukturen in wässrigen oder im Wesentlichen hydratisierten Medien. In diesem Artikel beschreiben wir detaillierte Protokolle, die den Aufbau von Nanofaserarchitekturen in organischen Lösungsmittelmischungen durch die Selbstmontage von eindeutig adressierbaren, einsträngigen, gammamodifizierten Peptidnukleinsäurefliesen ermöglichen. Jede einsträngige Fliese (SST) ist ein 12-Basis-PNA-Oligomer, der aus zwei verketteten modularen Domänen mit jeweils 6 Basen besteht. Jede Domäne kann sich an eine sich gegenseitig ergänzende Domäne binden, die auf benachbarten Strängen vorhanden ist, indem programmierte Komplementarität verwendet wird, um Nanofasern zu bilden, die bis zu Mikron en länge nausen können. Das SST-Motiv besteht aus insgesamt 9 Oligomeren, um die Bildung von 3-Helix-Nanofasern zu ermöglichen. Im Gegensatz zu analogen DNA-Nanostrukturen, die durchmessermonodisperse Strukturen bilden, bilden diese PNA-Systeme Nanofasern, die sich bei der Selbstmontage in organischen Lösungsmittelmischungen entlang ihrer Breite bündeln. Die hier beschriebenen Selbstmontageprotokolle enthalten daher auch ein herkömmliches Tensid, Natriumdodecylsulfat (SDS), um Bündelungseffekte zu reduzieren.

Die in den obigen Abschnitten besprochenen Protokolle beschreiben die Konstruktion eines angepassten SST-Motivs aus DNA-Nanofasern für die robuste Erzeugung selbstmontierter Nanofaserstrukturen unter Verwendung mehrerer, ausgeprägter PNA-Oligomere. In diesem Abschnitt wird die Interpretation der Daten beschrieben, die aus der erfolgreichen Wiedererstellung der beschriebenen Protokolle gewonnen wurden.
Nach dem in Abschnitt 5 beschriebenen Protokoll für die TIRF-Bildgebung von Proben von PNA-Ol...

Dieser Artikel enthält Protokolle für die Konstruktion und Selbstmontage von Nanostrukturen aus gammamodifizierten Peptidnukleinsäure-Oligomeren in organischen Lösungsmittelmischungen.

Selbstmontage von Gamma-modifizierten Peptid-Nukleinsäuren in komplexe Nanostrukturen in organischen Lösungsmittelmischungen

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Dieses neuartige Protokoll beschreibt die Verwendung mehrerer unterschiedlicher Sequenzen der synthetischen Nukleinsäure, die Gamma PNA imitiert, um Nanostrukturen in spezifischen organischen Lösungsmittelmischungen zu bilden. Die hier beschriebenen Assays zeigen die Notwendigkeit, bestehende Nukleinsäure-Nanotechnologieprotokolle an organische Lösungsmittel anzupassen, bei denen wenig bis gar keine Protokolle veröffentlicht wurden. Praktiker, die mit dieser Technik neue, könnten aufgrund der Neigung des Nanomaterials PNA, sich zu aggregieren, Schwierigkeiten haben, vorhandene Protokolle, die für wässrige Umgebungen entwickelt wurden, in organische lösungsmittelreiche Umgebungen anzupassen.Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Gamma PNA-Bestände. Nach Erhalt von HPLC-gereinigten Gamma-PNA-Strängen von einem kommerziellen Hersteller, setzen Sie jeden Strang in entionisiertem Wasser auf 300 mikromolare Konzentrationen aus. Bewahren Sie die Gamma-PNAs bei minus 20 Grad Celsius für bis zu mehrere Monate auf.Wenn Sie bereit sind, selbst zu montieren, bereiten Sie Aneal-Chargenproben in 75%DMSO, 75%DMF und 40%1, 4-Dioxan vor. Bereiten Sie zunächst 20 mikromolare Substocks jedes Oligomers vor, indem Sie 0,67 Mikroliter aus dem Hauptbestand aliquotieren und entionisiertes Wasser für ein Endvolumen von 10 Mikrolitern hinzufügen. Fügen Sie einen Mikroliter von jedem Oligomer aus den 20 mikromolaren Substocks zu einem 200 Mikroliter PCR-Rohr hinzu, das für neun Oligomere ein Gesamtvolumen von neun Mikrolitern erreicht.Fügen Sie 30 Mikroliter wasserfreies DMSO oder DMF mit einem zusätzlichen Mikroliter entionisiertem Wasser für ein Endvolumen von 40 Mikrolitern hinzu. Zur Zubereitung der 40%1, 4-Dioxan-Charge 16 Mikroliter 1, 4-Dioxan hinzufügen und das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 40 Mikroliter bringen. Anneal die Proben für 22,5 Stunden in einem thermischen Cycler Kühlung von 90 bis 20 Grad Celsius.Typischerweise liegen die Schmelztemperaturen für zwei Oligomer- und drei Oligomer-Gamma-PNA-Teilmengen im Bereich von 40 bis 70 Grad Celsius für unterschiedliche Lösungsmittelbedingungen. Programmieren Sie den thermischen Cycler nach Manuskriptanweisungen. Nach abschlussdem Glühen können proben12 bis 24 Stunden vor der Charakterisierung bei vier Grad Celsius gelagert werden.Machen Sie eine Feuchtigkeitskammer aus einer leeren Pipettenspitzen-Box, indem Sie die Box mit etwa fünf Milliliter Wasser füllen. Bereiten Sie eine 20-fache Verdünnung von handelsüblichen 2%kollodium in Amylacetat mit Isoamylacetat-Lösungsmittel vor, um die Nitrocelluloselösung zu erzeugen. Verwenden Sie eine Pinzette, um einen Deckelschlupf in die Nitrozelluloselösung einzutauchen und ihn lufttrocknen zu lassen, und dann eine Durchflusskammer aus einem Mikroskopschlitten, zwei doppelseitigen Bandstreifen und dem nitrozellulosebeschichteten Deckelrutsch zu machen.Bereiten Sie die Biotin-BSA-Lösung vor, indem Sie ein Milligramm Biotin BSA wiegen und in einem Milliliter PBS auflösen. 15 Mikroliter des Biotins BSA schräg in den Strömungskanal pfeifen und bei Raumtemperatur in der Befeuchtungskammer zwei bis vier Minuten inkubieren. 15 Mikroliter des Waschpuffers, der aus einem Milligramm BSA in einem Milliliter PBS besteht, in den Kanal blasen, um überschüssiges Biotin BSA wegzuwaschen, und dann die Oberfläche passivieren, indem sie den Durchflusskanal für zwei bis vier Minuten in der befeuchteten Kammer inkubieren.Messen Sie 0,5 Milligramm Streptavidin und ein Milligramm BSA, dann lösen Sie beide in einem Milliliter PBS. 15 Mikroliter der Streptavidin-Lösung in den Strömungskanal geben und zwei bis vier Minuten in die befeuchtete Kammer legen und den Kanal durch fließendes 15 Mikroliter Waschpuffer waschen. Als nächstes fließen 15 Mikroliter der geglühten Charge von Gamma-PNA-Oligomeren in die befeuchtete Kammer und waschen dann die ungebundenen Nanostrukturen, indem sie 15 Mikroliter eines Millimolaren Trolox in der gleichen Lösungsmittelzusammensetzung wie die Nanostrukturen fließen.Übertragen Sie den Durchflusskanal auf den Diahalter und bebildern Sie ihn mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit TIRF-Bildgebung, einem 60-fachen Öl-Tauchobjektiv und einer 1,5-fachen Lupe ausgestattet ist. Scannen Sie den Durchflusskanal mit einer 60- oder 90-fachen Vergrößerung, während Sie den Cy3-Kanal überwachen. Bereiten Sie 20 und 6% SDS-Bestände nach Manuskriptanweisungen vor, dann die Gamma-PNA-Oligomere annealieren, indem Sie einem 200 Mikroliter-PCR-Röhrchen einen Mikroliter von jedem 20 Mikromolaren-Oligomer hinzufügen.Fügen Sie 30 Mikroliter wasserfreies DMSO und einen Mikroliter 6% oder 20%SDS zu den PCR-Röhren für ein Endvolumen von 40 Mikrolitern hinzu, was zu einer endgültigen SDS-Konzentration von 5,25 bzw. 17,5 Millimolar führt. Anneal die Gamma-PNAs im Thermocycler wie zuvor beschrieben. Charakterisieren Sie Gamma-PNA-Nanostrukturen in Gegenwart von SDS mit dem TIRF- oder TEM-Protokoll.Die TIRF-Bildgebung von Gamma-PNA-Oligomeren, die in 75% DMSO geglüht wurden, zeigte gut organisierte Architekturen, während das Glühen in 75%DMF zu spikulierenförmigen oder nadelartigen Nanostrukturen führte. Der Zustand von 40%1, 4-Dioxan erzeugte eine spärliche Dekoration von fadenförmigen Nanostrukturen. Darüber hinaus zeigten die Proben von Gamma-PNA-Nanoröhren, die in 75%DMSO gebildet wurden, die Bündelung von Nanofasern bei hoher Vergrößerung oder nanoskopischen Auflösungen während der TEM-Bildgebung.Die quantitative Analyse der Breite der Nanostrukturen ergab eine mittlere Breite von 16,3 Nanometern mit Höchstwerten jenseits von 80 Nanometern. Isosequenzielle DNA-Oligomere, die zusammenhängende Gamma-PNAs ersetzten, bildeten gerade fadenförmige Strukturen, während der Ersatz von Crossover-Gamma-PNAs zu stellaten Strukturen führt. Die Nanostrukturen, die durch zusammenhängende DNA-Oligomere ersetzt wurden, hatten eine mittlere Breite von etwa 19 Nanometern.Bei hohen SDS-Konzentrationen nehmen Gamma-PNA-Nanofasern auch hoch vernetzte Morphologien im Vergleich zu ihren kritischen Micelle-Konzentrationen an, wenn sie mit TIRF-Bildgebung betrachtet werden. DIE TEM-Bildgebung zeigt an, dass die Gamma-PNA-Baugruppe in 5,25 Millimolar-SDS die größten Reduktionen bei der strukturellen Bündelung aufwies. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, die Lösungsmittelzusammensetzungen, wie erwähnt, zu erhalten, da die Nanostrukturen zu einer Aggregation führen.Diese Methoden ermutigen Praktiker, andere unerforschte Wege verschiedener Lösungsmittelzusammensetzungen, Tenside und anderer PNA-DNA-Nanostrukturen zu verfolgen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Solid-Phase Submonomer Synthese von Peptoid Polymere und ihre Self-Assembly in hoch geordneten Nanoschichten

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Selbstmontage von Gamma-modifizierten Peptid-Nukleinsäuren in komplexe Nanostrukturen in organischen Lösungsmittelmischungen

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