Biofunktionalisierung magnetischer Nanomaterialien
16. Juli 2020
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Biofunktionalisierung von magnetischen Nanomaterialien mit Antikörpern für spezifisches Zell-Targeting zur Verfügung. Zum Beispiel verwenden wir Eisen-Nanodrähte, um Krebszellen anzugreifen.
Das Hauptmerkmal dieses Protokolls ist, dass es auf eine breite Palette von Eisen-Eisenoxid-Nanomaterialien angewendet werden kann. Es kann auch auf mehrsegmentige Nanomaterialien, wie z. B. Eisen-Gold-Nanodrähte, angewendet werden. Dieses Protokoll kann in jedem biologischen Standardlabor sicher durchgeführt werden.
Der Hauptvorteil dieser Biofunktionalisierungstechnik ist die Fähigkeit, ein spezifisch zielgerichtetes Nanomaterial herzustellen, das auf einer starken kovalenten Bindung zwischen dem Nanodraht und den Antikörpern basiert. Beginne damit, die Aluminiumscheiben mit einer einschneidigen Klinge und einem kleinen Hammer in kleine Stücke zu schneiden. Legen Sie die geschnittenen Stücke in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie es mit einem Milliliter einmolaren Natriumhydroxid, wobei Sie darauf achten, dass alle Aluminiumstücke bedeckt sind.
Lassen Sie das Rohr 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem chemischen Abzug. Entfernen Sie nach der Inkubation die Aluminiumstücke mit einer Pinzette und bewahren Sie die freigesetzten Nanodrähte weitere 30 Minuten in Natriumhydroxid auf. Legen Sie das Röhrchen in ein magnetisches Trockengestell, warten Sie zwei Minuten und ersetzen Sie die Lösung durch frisches Natriumhydroxid.
Beschallen Sie das Zwei-Milliliter-Röhrchen 30 Sekunden lang mit den Nanodrähten und lassen Sie es eine Stunde lang in einem chemischen Abzug. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens viermal. Wenn Sie fertig sind, legen Sie das Zwei-Milliliter-Röhrchen in das Magnetgestell, entsorgen Sie das Natriumhydroxid und ersetzen Sie es durch einen Milliliter absolutes Ethanol.
Beschallen Sie die Nanodrähte 30 Sekunden lang, setzen Sie das Röhrchen in das Magnetgestell und ersetzen Sie das Ethanol. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche mindestens viermal. Nachdem Sie die Nanodrähte gewaschen haben, geben Sie sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette in ein Fünf-Milliliter-Glasröhrchen.
Geben Sie 100 Mikroliter APTES in die Nanodrahtlösung und wirbeln Sie das Glasröhrchen 20 Sekunden lang durch. Legen Sie die Röhre in ein Ultraschallbad und beschallen Sie sie eine Stunde lang. Nehmen Sie dann den Schlauch aus dem Bad und fügen Sie 400 Mikroliter entionisiertes Wasser und 20 Mikroliter einmolares Natriumhydroxid hinzu.
Wiederholen Sie die einstündige Beschallung. Nachdem Sie das Glasrohr aus dem Ultraschallbad genommen haben, legen Sie es neben einen Magneten, um die Nanodrähte zu sammeln. Ersetzen Sie den Überstand durch einen Milliliter frisches absolutes Ethanol und beschallen Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang.
Wiederholen Sie die Ethanolwäsche und die Beschallung zweimal. Lösen Sie 0,4 Milligramm EDC und 1,1 Milligramm Sulfo-NHS und einen Milliliter MES in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen. In ein weiteres Zwei-Milliliter-Röhrchen geben Sie 960 Mikroliter 0,1-molares PBS und fügen Sie 30 Mikroliter Anti-CD44-Antikörper hinzu.
Geben Sie anschließend 10 Mikroliter des zuvor vorbereiteten EDC/Sulfo-NHS-Gemisches in dieses Röhrchen. Legen Sie das Antikörperröhrchen in einen Schüttler und schütteln Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 10 mal G. Platzieren Sie in der Zwischenzeit einen Magneten neben der Röhre mit den APTES-beschichteten Nanodrähten für zwei Minuten, entsorgen Sie das Ethanol und ersetzen Sie es durch PBS.
Beschallen Sie die Nanodrähte 10 Sekunden lang. Nach dem letzten Waschen mit PBS sammeln Sie die Nanodrähte und übertragen die aktivierte Antikörperlösung in das Röhrchen des Nanodrahtes. Dann beschallen Sie es 10 Sekunden lang.
Tauschen Sie den Schlauch über Nacht bei vier Grad Celsius in den Rotator ein. Am nächsten Tag sammeln Sie die Nanodrähte mit dem Magneten und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie einen Milliliter 2%BSA hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius, um die Reaktion zu blockieren.
Die Elektronenenergieverlustspektroskopie oder EELS-Karten können verwendet werden, um die Siliziumatome auf der Nanodrahtoberfläche sichtbar zu machen und das Vorhandensein der APTES-Beschichtung zu bestätigen. Auf den unbeschichteten Nanodrähten erscheinen die Eisenatome dunkelblau und die Eisen-Sauerstoff-Mischatome hellblau. Die entsprechende EELS-Kartierung von unbeschichteten Nanodrähten zeigt eine höhere Intensität von Eisen gegenüber Sauerstoff im Zentrum als auf der Oberfläche, was auf eine Eisen-Eisenoxid-Struktur hinweist.
Die Kartierung zeigte, dass die Eisenoxidschicht aus mehr Eisen(II,III)oxid als aus Eisen(III)oxid besteht. Die Antigenität der angehängten Antikörper wurde mit Hilfe der Immunpräzipitation und des Western-Blot-Assays bestätigt. Der BCA-Assay wurde verwendet, um die Anzahl der Antikörper auf den Nanodrähten zu quantifizieren.
Die Messung des Zetapotenzials wurde verwendet, um die Oberflächenfunktionalisierung aufzuklären. Die terminale Amingruppe auf APTES reduzierte die negative Ladung im Vergleich zu unbeschichteten Nanodrähten. Die Funktionalisierung der Antikörper reduzierte die Ladung zusätzlich.
Das spezifische Zelltargeting der Antikörper-funktionalisierten Nanodrähte wurde mittels konfokaler Mikroskopie bestätigt. Die Abbildungen A und B stellen die Hellfeldmikroskopie-Aufnahmen von Probe C bzw. D dar. Die Farbe Rot entspricht der Darstellung der Zellmembran, Blau repräsentiert den Zellkern und die grünen Cluster stellen das Vorhandensein von angehängten, zielgerichteten CD44-Nanodrähten dar.
Darüber hinaus wurde der Zellviabilitätsassay verwendet, um zu überprüfen, ob die unbeschichteten, APTES-beschichteten und Antikörper-beschichteten Nanodrähte biokompatibel sind. Bei der APTES-Prozessbeschichtung ist es sehr wichtig, das deionisierte Wasser vor der Natronlauge hinzuzufügen, um die Bindung zwischen dem APTES-Molekül und den Nanodrähten zu verbessern. Außerdem ist es während des Biofunktionalisierungsprozesses notwendig, den Nanodraht einige Male mit PBS-Puffer zu waschen, um die kovalente Bindung zwischen dem Antikörper und den Nanodrähten zu verbessern.
Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur biofunktionalisierung magnetischer Nanomaterialien mit Antikörpern zur gezielten Zellmarkierung vor, insbesondere unter Verwendung von Eisen-Nanodrähten zur gezielten Bekämpfung von Krebszellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Nanotechnologie
- Biomaterialien
- Zellbiologie
Hintergrund
- Magnetische Nanomaterialien haben potenzielle Anwendungen in der gezielten Arzneimittelabgabe.
- Die Biofunktionalisierung erhöht die Spezifität von Nanomaterialien für bestimmte Zelltypen.
- Eisen-Nanodrähte können modifiziert werden, um ihre Zielgerichtetheit zu verbessern.
- Das Verständnis der Wechselwirkung zwischen Nanomaterialien und biologischen Systemen ist entscheidend für deren Anwendung.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls zur biofunktionalisierung von eisernen Nanodrähten.
- Nachweis der Wirksamkeit von antikörperfunktionalisierten Nanodrähten bei der gezielten Bindung an Krebszellen.
- Beurteilung der Biokompatibilität der modifizierten Nanodrähte.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Eisen-Nanodrähten durch chemische Verfahren.
- Beschichtung der Nanodrähte mit APTES zur Förderung der Antikörperbindung.
- Verwendung von EDC/Sulfo-NHS zur Aktivierung von Antikörpern.
- Charakterisierung der Nanodrähte mittels Elektronenenergieverlustspektroskopie und Zetapotentialmessungen.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll erzeugte erfolgreich mit Antikörpern funktionalisierte Eisen-Nanodrähte.
- Die konfokale Mikroskopie bestätigte die spezifische Anbindung der modifizierten Nanodrähte an Krebszellen.
- Biokompatibilitätsanalysen zeigten, dass die Nanodrähte für zelluläre Anwendungen sicher sind.
- Die Oberflächenfunktionalisierung wurde durch verschiedene Charakterisierungstechniken verifiziert.
Schlussfolgerungen
- Diese biofunktionalisierende Technik ermöglicht die gezielte Abgabe von therapeutischen Wirkstoffen.
- Das Protokoll kann für verschiedene Arten von Nanomaterialien angepasst werden.
- Zukünftige Anwendungen könnten gezielte Krebstherapien unter Verwendung dieser Nanodrähte umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung gezielt wirkender magnetischer Nanomaterialien durch kovalente Antikörperbindung und unterstützt so die Entwicklung präziser Therapeutika und Diagnostika. Durch die Erhöhung der Target-Spezifität und die Möglichkeit der ferngesteuerten magnetischen Kontrolle trägt die Methode zur mechanistischen Risikominimierung in frühen onkologischen Programmen bei. Der Ansatz verbessert die Vorhersagegenauigkeit bei nanomaterialbasierten Interventionen, indem er sowohl die Effizienz der gezielten Anbindung als auch die Biokompatibilität validiert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch gezielte Ansprache spezifischer Oberflächenmarker, wie beispielsweise die Überexpression von CD44 in Krebszellen.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem die Antigenität angebundener Antikörper mittels Immunpräzipitation und Western Blot bestätigt wird.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem spezifische Zielgerichtetheit und Biokompatibilität in relevanten zellulären Modellen nachgewiesen werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt validierte biologische Systeme, die für nachgeschaltete Workflows bereitstehen, wobei die Oberflächenfunktionalisierung durch EELS- und Zeta-Potential-Messungen bestätigt wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch kontrollierte kovalente Bindung und Blockierschritte unter Verwendung von BSA.
- Skalierbarkeitswert: Unterstützt die Wiederverwendung der Plattform bei Eisen-Eisenoxid- und mehrsegmentierten Nanomaterialien, einschließlich Eisen-Gold-Nanodrähte.
Translationale und präklinische Forschung
- Übertragbarer Nutzen: Zeigt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung mithilfe der konfokalen Mikroskopie zur Verfolgung und Zellviabilitätsassays auf.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Biokompatibilität von nicht beschichteten, APTES-beschichteten und antikörperbeschichteten Nanomaterialien überprüft wird.
- Mechanistische Risikominimierung: Verringert Unklarheiten bezüglich der Targeting-Mechanismen, indem die Bindung von Antikörpern an spezifische Zellbindung, die in der Bildgebung beobachtet wird, miteinander verknüpft wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung ein und ermöglicht eine zuverlässige Verbindungsbewertung mithilfe quantifizierbarer, magnetisch ansprechender Nanomaterialien.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem eine gezielte Abgabe an CD44-positive Krebszellen ermöglicht wird.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Tests und quantitative Auswertungen durch Verschiebungen des Zetapotenzials und durch EELS-bestätigte Oberflächenmodifizierungen.
- Analytik: Liefert messbare Ergebnisse, wie die Antikörpermenge mittels BCA-Assay und die zelluläre Aufnahme mittels konfokaler Mikroskopie.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch nachgewiesene Biokompatibilität und gezielte Anbindung in zellulären Modellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Kapazität zur Herstellung gezielt wirkender Nanomaterialien über mehrere Projekte und Nanomaterialformate hinweg.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Unschärfen bei der Wechselwirkung von Nanomaterialien mit Zellen.
- Operativer Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der biofunktionalisierung in verschiedenen Laboreinstellungen.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und geringeres biologisches Risiko in fortgeschrittenen Entwicklungsphasen von Nanotherapeutika.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung und Förderentscheidungen basierend auf validierten Targeting- und Sicherheitsprofilen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Nanomaterialien, der Antikörperkonjugation und Oberflächencharakterisierungstechniken.
- Setzt den Zugang zu Ultraschallbädern, magnetischen Gestellen und Instrumenten für EELS-, Zetapotential- und Western-Blot-Analysen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Wasch-, Blockier- und Inkubationsprotokollen, um die Konsistenz zwischen Chargen sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung der Methode auf unterschiedliche Formen, Zusammensetzungen oder Oberflächenchemien von Nanomaterialien.
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit einer sorgfältigen Reihenfolge der Reagenzien (z. B. entionisiertes Wasser vor Natriumhydroxid), um die APTES-Bindung zu verbessern.
