Name: Verwendung von primär kultivierten Hippocampus-Neuronen zur Untersuchung der Anordnung von Axon-Anfangssegmenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie primär kultivierte Hippocampus-Neuronen nutzen, um die Anordnung von Axon-Anfangssegmenten quantitativ zu untersuchen. Diese Methode erlaubt die Analyse genetischer Einflüsse auf die neuronale Struktur.

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Wir danken Dr. Gary Banker für den Vorschlag zum neuronalen Kulturprotokoll. Diese Arbeit wird vom Howard Hughes Medical Institute, einem Stipendium des NIH und einer George Barth Geller-Professur (V.B.) unterstützt.

HINWEIS: Diese Kulturmethode von Hippocampus-Neuronen aus postnatalen 0-Tage-ANK3-E22/23f/f-Mäusen wurde von Gary Bankers Glia/Neuron-Co-Culture-System adaptiert. Daher ist es wichtig, alle Schritte nach der Dissektion in einer sauberen Haube mit sterilisierten Werkzeugen durchzuführen. Dieses Protokoll dauert bis zu 1 Monat. Der Workflow wird in Abbildung 3angezeigt. Das Protokoll folgt den Tierrichtlinien der Duke University.
1. Zubereitung von Coverlips und neuronalen Beschichtungsschalen
<ol><li>Mindestens eine Woche vor dem Kulturtag die Abdeckripp auf das Abdeckgestell laden und über Nacht in Salpetersäure (70% W/W) einweichen (könnte tagelang verlängert werden).</li>
	<li>Mit Salpetersäure behandelte Abdeckstücke mit destilliertem Wasser auf einem Low-Speed-Shaker in einem Glas 2 mal, jeweils 1 Stunde, waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Coverlips in gesättigtem KOH, gelöst in 100% Ethanol über Nacht. Fügen Sie KOH in Ethanol hinzu, bis es nicht mehr gelöst ist.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Waschschritt mit destilliertem Wasser. Decken Sie die Abdeckungen mit 100% Ethanol einmal für 10 Minuten ab.</li>
	<li>Übertragen Sie die Abdeckschichten vom Rack in ein Glasbecherglas. Decken Sie das Becherglas mit Aluminiumfolie ab. Backen Sie Diedeckel über Nacht in einem 225 °C-Ofen, um die Abdecklippen zu sterilisieren. (Coverlips könnten wochenlang im Becherglas aufbewahrt werden).</li>
	<li>Legen Sie die Coverlips in eine Petrischale und tragen Sie dann 3-4 Wachspunkte auf die Coverlip auf, um als Füße zu dienen. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um in einer Glasflasche in gekochtes Wachs zu tauchen. Berühren Sie dann schnell den Coverlip, um einen Punkt zu erstellen. Eine 60 mm Petrischale kann 4 Abdecklippen aufnehmen. Eine 10 mm Petrischale kann ~10 Abdecklippen aufnehmen.</li>
	<li>2 Tage vor dem Kulturtag Deckschichten (die Seite mit den Wachspunkten) mit Filter sterilisiert 1 mg/ml Poly-L-Lysin in 0,1 M Borsäure (pH 8,5) für mindestens 6 Stunden und spülen Sie mit Wasser 2 mal, jeweils 1 Stunde. Coverlips bleiben in der gleichen Petrischale.</li>
	<li>Beschichtungsmedium (MEM ergänzt mit Glukose 0,6% (wt/vol) und 10% (vol/vol) Pferdeserum) langsam auf Platten geben, ohne störende Coverlips. Legen Sie Platten bis zum Kulturtag in den Inkubator, um Neuronen zu säen.</li>
</ol>2. Zubereitung von Gliazell-Feeder-Gerichten (2 Wochen vor dem Kulturtag)
<ol><li>Sezieren Sie den Kortex aus einem postnatalen 1 Tag alten Mäusegehirn und schälen Sie die Hirnhäute ab.</li>
	<li>Das Kortexgewebe mit einer sauberen Schere in einer sauberen Petrischale in einer sauberen Bank so fein wie möglich hacken.</li>
	<li>Das gehackte Gewebe in 12 ml HBSS geben und 1,5 ml 2,5% Trypsin und 1% (wt/vol) DNase hinzufügen. Inkubieren Sie in einem 37 °C Wasserbad für 15 min, schwingen Sie alle 5 min. Gut verdautes Gewebe wird klebrig und bildet einen großen Cluster. Triturieren Sie 10-15 mal mit einer 10 ml Pipette, um das Gewebe abzubauen und eine bessere Verdauung zu erhalten.</li>
	<li>Triturieren Sie das gut verdaute Gewebe 10-15 mal mit einer 5 mL Pipette, bis die meisten Brocken verschwinden und das Medium trüb wird. Durch ein Zellsieb gehen, um die verbleibenden Brocken zu entfernen, und 15 ml Gliamedium (Minimales essentielles Medium (MEM) ergänzt mit Glukose (0,6% wt / vol), 10% (vol / vol) Pferdeserum und Penicillin-Streptomycin (1x) hinzufügen, um die Verdauung zu stoppen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 120 x g für 5 Minuten und saugen Sie den Überstand an. Das Zellpellet mit frischem Gliamedium und Samen in Zellkulturschalen (ca. 105 Zellen/cm2) wieder aufspulieren.</li>
	<li>Ersetzen Sie medium am nächsten Tag durch frisches Gliamedium, um nicht befestigte Zellen zu entfernen.</li>
	<li>Füttern Sie die Gliagerichte alle 3-4 Tage mit frischem Glia Medium. Schlagen Sie den Kolben 5-10 Mal mit einer Hand, um lose anhaftende Zellen zu entfernen, bevor Sie das Medium wechseln.</li>
	<li>Nach 10 Tagen Kultur sollten Gliazellen fast konfluent sein. Gliazellen mit 0,25% Trypsin-EDTA lösen und etwa 105 Zellen in einer neuen 60 mm Zellkulturschale aussäen. Verbleibende Zellen könnten für die zukünftige Verwendung eingefroren werden.</li>
	<li>3 Tage vor dem Kulturtag das Gliamedium auf neuronales Kulturmedium umstellen (Neurobasal-A Medium mit 1x GlutaMAX-I und 1x B27 Ergänzung).</li>
</ol>3. Kultur Hippocampus-Neuronen
HINWEIS: Alle Schritte werden bei Raumtemperatur ausgeführt.
<ol><li>Sezieren Sie 6-8 Hippocampi von postnatalen 1-Tag alten Welpen von ANK3-E22/23f Mäusen mit HBSS-Medium in einer Petrischale bei raumtemperiertem Raum. Die Hippocampi mit einer Sezierschere in kleinere Stücke schneiden. Hippocampi von der Petrischale in ein 15 ml Röhrchen geben.</li>
	<li>Hippocampi 2x mit 5 ml HBSS in der Tube waschen. Lassen Sie die Hippocampi nach dem Waschen in 4,5 ml 1x HBSS.</li>
	<li>0,5 ml 2,5% Trypsin in 4,5 ml HBSS geben und in einem 37 °C Wasserbad 15 Minuten lang inkubieren. Kehren Sie die Röhre alle 5 Minuten um. Gut verdaute Hippocampi sollten klebrig werden und eine Gruppe bilden. Bei Bedarf die Verdauung um weitere 5 Minuten verlängern.</li>
	<li>Hippocampi mit HBSS 3 mal für jeweils 5 Minuten waschen. Verwenden Sie kein Vakuum, um das HBSS zu entfernen. Es ist sehr einfach, die Hippocampi zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie nach dem Waschen 2 ml HBSS hinzu und pipetetten Sie die Hippocampi 15 Mal mit einer Pasteur-Pipette auf und ab.</li>
	<li>Triturieren Sie das Gewebe mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette (der Durchmesser des Offenen ist um die Hälfte verengt) 10 mal. Gehen Sie nicht über das 10-fache hinaus, auch wenn noch Brocken übrig sind. Überhören tötet Neuronen.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr für 5 Minuten, bis alle Brocken auf den Boden gesetzt sind. Verwenden Sie vorsichtig eine 1 ml Pipettenspitze, um den Überstand, der die dissoziierten Neuronen enthält, auf Beschichtungsschalen (105 Zellen / 60 mm Schüssel) zu übertragen. Direkt in das vorinkubierte Beschichtungsmedium geben und die Platte vorsichtig schütteln.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.6-3.7 mit den verbleibenden Stücken, bis die meisten Brocken verschwunden sind.</li>
	<li>2-4 Stunden nach der Aussaat die Beschichtungsschalen mit einem Lichtmikroskop überprüfen. Die Mehrheit der Neuronen sollte sich an der Decke befestigt haben. Die angebrachten Zellen sind rund und hell. Klappen Sie die Abdecklippen mit einer feinen Spitzenzette zu den Gliazell-Feederschalen mit vorkonditioniertem neuronalem Kulturmedium mit der Wachspunktseite nach unten.</li>
	<li>Neuronen können in den Gliazell-Futterschalen bis zu 1 Monat lang wachsen. Füttern Sie Neuronen alle 7 Tage mit 1 ml frischem neuronalem Kulturmedium.</li>
	<li>Optionaler Schritt: 1 Woche nach der Aussaat Cytosin-Arabinosid (1-β-D-Arabinofuranosylcytosin) zu einer Endkonzentration von 5 μM hinzufügen, um die Gliaproliferation einzudämmen.</li>
</ol>4. Störung des AIS durch Knockout von Ankyrin-G in einem früheren Stadium der Neuronenentwicklung
<ol><li>Drehen Sie am 3 div (Tag in vitro)die Coverlips mit Wachspunkten mit der Seite nach oben zu einer Gliazell-Feederschale mit konditioniertem neuronalem Kulturmedium.</li>
	<li>Mischen Sie 0,25 μg Cre-BFP-DNA mit 0,5 μg Ankyrin-G-GFP (WT / Mutant) -DNA in einem 1,7-ml-Röhrchen, um 4 Coverlips zu transfizieren (~ 2: 1 Verhältnis der DNA-Kopienzahl). 100 μL Kulturmedium (z.B. Opti-MEM) hinzufügen, mischen und auf einem Rack ruhen lassen. Wenn nur Cre-BFP transfiziert wird, wird das GFP-Plasmid-Rückgrat verwendet, um die Gesamtmenge an DNA abzugleichen.</li>
	<li>Mischen Sie 3 μL Transfektionsreagenz (z. B. Lipofectamine 2000) (~ 3-fache DNA) mit 100 μL Kulturmedium in einem neuen 1,7 ml Röhrchen. Inkubieren Sie für 5 Minuten bei RT.</li>
	<li>Mischen Sie 100 μL DNA-Lösung aus Schritt 4.2 mit 100 μL Transfektionsreagenz aus Schritt 4.3. Ruhen Sie sich für 5-10 Minuten auf einem Rack aus.</li>
	<li>Fügen Sie 50 μL DNA-Mix aus Schritt 4.4 direkt auf jeden Coverlip hinzu, indem Sie die Spitze direkt unter dem Medium einführen, ohne die Coverlips zu berühren. Pipette langsam, um die Ausbreitung des DNA-Mixes zu vermeiden.</li>
	<li>Bringen Sie die Schüssel langsam zurück in den Inkubator und inkubieren Sie sie für 30-45 Minuten.</li>
	<li>Drehen Sie die Coverlips zurück zur home Glia Feeder Dish mit Wachspunkten zur Seite nach unten und legen Sie die Platte zurück in den Inkubator.</li>
</ol>5. Quantifizierung des Axon-Anfangssegments
<ol><li>Fixieren Sie Neuronen auf 7-10 div und färben Sie mit AIS-Marker nach dem Standard-Immunzytochemie-Protokoll für das Protein von interessant.</li>
	<li>Sammeln Sie fluoreszierende Bilder mit der gewünschten Mikroskopie.<ol>
<li>Nehmen Sie Abschnitte der Z-Serie, um das Signal des gesamten AIS zu sammeln. Behalten Sie für alle Bilder die gleiche Z-Tiefe bei.</li>
		<li>Passen Sie die Laserintensität an, um den besten Dynamikbereich für die Pixelintensität zu erreichen.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass alle AIS-Bilder mit demselben Mikroskop-Setup aufgenommen wurden.</li>
		<li>Überprüfen Sie immer das Signal von Cre-BFP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>AIS-Quantifizierung<ol>
<li>Bild öffnen mit Fidschi (https://fiji.sc).</li>
		<li>Generieren Sie eine maximale Projektion von Bildern der Z-Serie.</li>
		<li>Subtrahieren Sie das leere Coverlip-Hintergrundsignal vom Bild.</li>
		<li>Zeichnen Sie eine Linie entlang des AIS. Die Breite der Linie sollte das AIS vollständig abdecken. Starten Sie die Linie, bevor das AIS-Signal über den Hintergrund ausgelöst wird, und stoppen Sie, nachdem es in den Hintergrund fällt.</li>
		<li>Messen Sie die mittlere Pixelintensität allein der Zeile und exportieren Sie sie in eine Tabelle (~ 10-15 AISs werden benötigt).</li>
		<li>Generieren Sie die durchschnittliche Intensitätskurve von AIS mit dem MATLAB-Skript, das von Berger et al.15adaptiert wurde.</li>
		<li>Für jedes Experiment sollten nur Cre und Cre plus Wildtyp 480 kDa Ankyrin-G transfizierte Neuronen als Negativ- und Positivkontrollen eingeschlossen werden, um sicherzustellen, dass der Knockout von AIS effizient ist und die Rettung erfolgreich ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Ankyrin-G+regulates+forebrain+connectivity+and+network+synchronization+via+interaction+with+GABARAP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP.</a> Molecular Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G+stabilizes+somatodendritic+GABAergic+synapses+through+opposing+endocytosis+of+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).</li>
<li>Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axo-axonic+Innervation+of+Neocortical+Pyramidal+Neurons+by+GABAergic+Chandelier+Cells+Requires+AnkyrinG-Associated+L1CAM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM.</a> Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).</li>
<li>Hofflin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+Axon+Initial+Segment+in+Interneurons+and+Pyramidal+Cells+of+Rodent+Visual+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332(2017).</li>
<li>Schluter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Plasticity+of+Synaptopodin+in+the+Axon+Initial+Segment+during+Visual+Cortex+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development.</a> Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).</li>
<li>Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+activity+regulates+Na%28%2B%29+channel+distribution+at+the+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment.</a> Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).</li>
<li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+relocation+of+the+axon+initial+segment+fine-tunes+neuronal+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability.</a> Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).</li>
<li>Pan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+ankyrin-G-based+mechanism+retains+KCNQ+and+NaV+channels+at+electrically+active+domains+of+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon.</a> Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).</li>
<li>Cooper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Made+for+%22anchorin%22%3A+Kv7.2%2F7.3+%28KCNQ2%2FKCNQ3%29+channels+and+the+modulation+of+neuronal+excitability+in+vertebrate+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG+is+required+for+clustering+of+voltage-gated+Na+channels+at+axon+initial+segments+and+for+normal+action+potential+firing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing.</a> The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).</li>
<li>Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG.+A+new+ankyrin+gene+with+neural-specific+isoforms+localized+at+the+axonal+initial+segment+and+node+of+Ranvier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+ankyrin-G%3A+a+critical+innovation+in+vertebrate+evolution+of+fast+and+integrated+neuronal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).</li>
<li>Jenkins, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+polarity+is+determined+by+a+multifunction+motif+mediating+lateral+membrane+retention+through+ankyrin-G+and+apical-lateral+transcytosis+through+clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Berger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Myosin+II+Activity+Regulates+Assembly+and+Plasticity+of+the+Axon+Initial+Segment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment.</a> Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+mutation+of+giant+ankyrin-G+disrupts+a+core+mechanism+for+axon+initial+segment+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Montage von AIS wird von 480 kDa Ankyrin-G organisiert. Ankyrin-G hat jedoch kürzere Isoformen, die auf den AIS von Wildtyp-Neuronen abzielen können, was zu Schwierigkeiten bei der Interpretation von Struktur-Funktions-Analysen der AIS-Assemblierung führen kann. Hier stellen wir eine Methode mit Neuronen von ANK3-E22/23-flox-Mäusen vor, die es ermöglicht, die De-novo-Assemblierung des AIS zu untersuchen. Durch transfizierend mit Cre-BFP bei 3 div eliminieren wir alle endogenen Isoformen von Ankyrin...

Das Axon-Anfangssegment befindet sich am proximalen Axon in den meisten Wirbeltierneuronen. Funktional ist AIS der Ort, an dem Aktionspotentiale aufgrund der hohen Dichte spannungsgesteuerter Natriumkanäle in diesem Bereich initiiert werden. AIS einiger exzitatorischer Neuronen werden auch von inhibitorischen Interneuronen durch die Bildung von GABAergen Synapsen1,2,3angegriffen. Daher ist AIS ein kritischer Ort, um Zellsignale zu integrieren und die Erregbarkeit von Neuronen zu modulieren. AIS ist normalerweise 20-60 μm lang und befindet sich innerhalb von 20 μm des Zellkörpers. Die Länge und Position von AIS variiert in Neuronen über Gehirnregionen hinweg sowie in verschiedenen Entwicklungsstadien desselben Neurons4,5. Gesammelte Beweise deuten darauf hin, dass die Zusammensetzung und Position von AIS dynamisch auf die Veränderung der neuronalen Aktivitätreagieren 4,5,6,7.
480 kDa Ankyrin-G ist der Master-Organizer von AIS. 480 kDa Ankyrin-G ist ein membranassoziiertes Adapterprotein, das direkt an spannungsgesteuerte Natriumkanäle sowie andere wichtige AIS-Proteine bindet, einschließlich Beta4-Spectrin, KCNQ2/3-Kanäle, die die Natriumkanalaktivität8,9und 186 kDa-Neurofascin modulieren, ein L1CAM, das GABAerge Synapsen zum AIS2,10leitet. 480 kDa Ankyrin-G teilt kanonische Ankyrindomänen, die in der kurzen 190 kDa Ankyrin-G-Isoform (ANK-Wiederholungen, Spectrin-Bindungsdomäne, regulatorische Domäne) gefunden werden, unterscheiden sich jedoch durch ein riesiges Exon, das nur in Wirbeltieren vorkommt und spezifisch in Neuronen exprimiert wird (Abbildung 1A)11,12. Die 480 kDa Ankyrin-G Neuronen-spezifische Domäne (NSD) wird für die AIS-Bildungbenötigt 12. Das 190 kDa Ankyrin-G fördert nicht die AIS-Assemblierung oder zielt AIS in Ankyrin-G-Null-Neuronen12. Allerdings sind 190 kDa Ankyrin-G am AIS konzentriert und enthalten 480 kDa Ankyrin-G12. Diese Fähigkeit des 190 kDa Ankyrin-G, auf vormontierte AIS von Wildtyp-Neuronen zu zielen, war eine Quelle der Verwirrung in der Literatur und hat die Wertschätzung der kritischen Spezialfunktionen des 480 kDa Ankyrin-G in der AIS-Assemblierung verlangsamt. Daher ist es wichtig, die AIS-Assemblierung in Ankyrin-G-Null-Neuronen zu untersuchen, denen ein vormontiertes AIS fehlt.
Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung des Aufbaus und der Struktur des AIS mit kultivierten Hippocampus-Neuronen von ANK3-E22/23-flox-Mäusen vor, die alle Isoformen von Ankyrin-G13 eliminiert (Abbildung 1B). Durch die Transfektierung von Neuronen mit einem Cre-BFP-Konstrukt, bevor AIS zusammengesetzt wird, erzeugten wir Ankyrin-G-defiziente Neuronen, die völlig ohne AIS waren (Abbildung 1B, Abbildung 2). Die Montage von AIS ist nach Co-Transfektion von 480 kDa Ankyrin-G-GFP-Plasmid mit einem Cre-BFP-Plasmid vollständig gerettet. Diese Methode bietet eine Möglichkeit, die AIS-Assembly in einer nicht vormontierten AIS-Umgebung zu untersuchen. Wir modifizierten auch das Glia-Neuron-Co-Culture-System von Gary Banker ohne Verwendung von Antibiotika, das zuvor für embryonale Neuronen am Tag 18 entwickelt wurde, für die Anwendung auf postnatale Mausneuronen und passten eine AIS-Quantifizierungsmethode an durchschnittliche AIS-Messungen von mehreren Neuronen an, um die Variation von AIS14,15zu normalisieren.

<table><tbody><tr><td>10xHBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>18mm Deckglas (1.5D)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84-1D</td><td></td></tr><tr><td>190kDa Ankyrin-G-GFP</td><td>Addgene</td><td>#31059</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Tripsin ohne Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>480kDa Ankyrin-G-GFP</td><td>Labor hergestellt</td><td>Auf Anfrage</td> <td>zur Verfügung stellen</td></tr><tr><td>ANK3-E22/23f/f Mäuse</td><td>JAX</td><td>Best.-Nr.:</td><td>029797 B6.129-ANK3tm2.1Bnt/J;</td></tr><tr><td>B27 serumfreies Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb mit 70-mm-Maschenweite</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Keramik-Deckglas-Färbegestell</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Cre-BFP</td><td>Addgen</td><td>#128174</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>MEM mit Earle' s Salze und L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Salpetersäure 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225711</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduziertes Serummedium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysinhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26124-78-7</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von primär kultivierten hippocampus-neuronen zur untersuchung der anordnung von axon-anfangssegmenten

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronale Axon-Initialsegmente (AIS) sind Orte der Initiierung von Aktionspotentialen und wurden umfassend auf ihre molekulare Struktur, Anordnung und aktivitätsabhängige Plastizität untersucht. Giant Ankyrin-G, der Hauptorganisator von AIS, verbindet sich direkt mit membranübergreifenden spannungsgesteuerten Natrium- (VSVG) und Kaliumkanälen (KCNQ2/3) sowie 186 kDa-Neurofaszin, einem L1CAM-Zelladhäsionsmolekül. Riesen-Ankyrin-G bindet und rekrutiert auch zytoplasmatische AIS-Moleküle, einschließlich Beta-4-Spectrin und die Mikrotubuli-bindenden Proteine EB1 / EB3 und Ndel1. Riesiges Ankyrin-G reicht aus, um die AIS-Bildung in Ankyrin-G-defizienten Neuronen zu retten. Ankyrin-G enthält auch eine kleinere 190 kDa-Isoform, die sich an dendritischen Stacheln anstelle des AIS befindet, die nicht in der Lage ist, auf den AIS zu zielen oder den AIS in Ankyrin-G-defizienten Neuronen zu retten. Hier beschrieben wir ein Protokoll mit kultivierten Hippocampus-Neuronen von ANK3-E22/23-Flox-Mäusen, die, wenn sie mit Cre-BFP transfiziert werden, einen Verlust aller Isoformen von Ankyrin-G aufweisen und die Bildung von AIS beeinträchtigen. In Kombination eines modifizierten Banker-Glia/Neuron-Co-Culture-Systems entwickelten wir eine Methode, um Ankyrin-G-Nullneuronen mit einem 480 kDa Ankyrin-G-GFP-Plasmid zu transfizieren, das ausreicht, um die Bildung von AIS zu retten. Darüber hinaus verwenden wir eine quantifizierungsmethode, die von Salzer und Kollegen entwickelt wurde, um die Variation der AIS-Entfernung von den neuronalen Zellkörpern zu behandeln, die in Hippocampus-Neuronenkulturen auftritt. Dieses Protokoll ermöglicht quantitative Untersuchungen der De-novo-Assemblierung und des dynamischen Verhaltens von AIS.

Ein vollständiger Satz von Experimenten sollte Cre-BFP nur Transfektion als Negativkontrolle, Cre-BFP plus 480 kDa Ankyrin-G Co-Transfektion als Positivkontrolle und eine nicht transfizierte Bedingung als Technikkontrolle enthalten. Bei der reinen Cre-BFP-Kontrolle fehlt transfizierten Neuronen die Akkumulation von AIS-Markern, einschließlich Ankyrin-G (ankG), Beta4-Spectrin (β4), Neurofascin (Nf) und spannungsgesteuerten Natriumkanälen (VSVG)(Abbildung 4A)16. Im Gege...

Hier beschrieben wir ein Protokoll zur quantitativen Untersuchung der Anordnung und Struktur der Axon-Anfangssegmente (AIS) von Hippocampus-Neuronen, denen aufgrund des Fehlens eines riesigen Ankyrin-G ein vormontiertes AIS fehlt.

Verwendung von primär kultivierten Hippocampus-Neuronen zur Untersuchung der Anordnung von Axon-Anfangssegmenten

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Dieses Protokoll wird verwendet, um die Anordnung und Struktur der Axon-Anfangssegmente von Hippocampus-Neuronen, denen aufgrund des Fehlens eines riesigen Ankyrin-G ein vormontiertes AIS fehlt, quantitativ zu untersuchen. Sezieren Sie zunächst sechs bis acht Hippocampi von postnatalen, eintägigen Welpen mit HBSS-Medium in einer Petrischale. Die Hippocampi mit einer Sezierschere in kleinere Stücke schneiden und von der Schale in ein 15-Milliliter-Röhrchen geben.Waschen Sie die Hippocampi zweimal mit fünf Millilitern HBSS und lassen Sie sie nach dem Waschen in 4,5 Millilitern HBSS. Fügen Sie 0,5 Milliliter 2,5% Trypsin in 4,5 Milliliter HBSS hinzu und inkubieren Sie in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 15 Minuten, wobei Sie das Röhrchen alle fünf Minuten umkehren. Gut verdaute Hippocampi sollten klebrig werden und eine Gruppe bilden.Bei Bedarf die Verdauung um weitere fünf Minuten verlängern. Hippocampi dreimal mit HBSS für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Nach dem Waschen zwei Milliliter HBSS hinzufügen und die Hippocampi 15 Mal mit einer Pasteur-Pipette auf und ab pipetten.Triturieren Sie das Gewebe mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette 10 Mal und legen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang ab, bis alle Brocken auf den Boden gesetzt sind. Wiederholen Sie die Trituration mit den verbleibenden Brocken, bis die meisten von ihnen verschwunden sind. Verwenden Sie dann eine Pipettenspitze von einem Milliliter, um den Überstand, der die dissoziierten Neuronen enthält, vorsichtig auf das Beschichtungsgeschirr zu übertragen.Direkt in das vorinkubierte Beschichtungsmedium geben und die Platte vorsichtig schütteln. Überprüfen Sie zwei bis vier Stunden nach der Aussaat die Beschichtungsschalen mit einem Lichtmikroskop. Der Großteil der Neuronen sollte am Deckzettel befestigt sein.Drehen Sie mit einer feinen Spitzenzette die Abdeckung zu den Gliazellen-Feederschalen, die vorkonditioniertes neuronales Kulturmedium enthalten, wobei die Wachspunkte nach unten zeigen. Neuronen können in den Gliazellen-Futterschalen bis zu einem Monat lang wachsen. Füttern Sie Neuronen alle sieben Tage mit einem Milliliter frischem neuronalem Kulturmedium.Am dritten Tag in vitro schlüpft der Deckel mit der Wachspunktseite nach oben in eine Gliazellen-Futterschale mit konditioniertem neuronalem Kulturmedium. Mischen Sie 0,25 Mikrogramm CRE BFP DNA mit 0,5 Mikrogramm Ankyrin-G GFP DNA in einem 1,7 Milliliter Röhrchen, um vier Cover-Slips zu transfizieren. Fügen Sie 100 Mikroliter optimal hinzu.Dann mischen Sie die Tube und ruhen auf einem Rack. Wenn nur CRE BFP transfiziert wird, wird das GFP-Plasmische Rückgrat verwendet, um die Gesamtmenge an DNA abzugleichen. Mischen Sie drei Mikroliter Transfektionsreagenz mit 100 Mikrolitern Optimum in einem neuen 1,7-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Mischen Sie dann 100 Mikroliter der zuvor gemischten DNA mit 100 Mikrolitern Transfektionsreagenzmischung und lassen Sie sie fünf bis 10 Minuten auf einem Rack stehen. Fügen Sie 50 Mikroliter des DNA-Mixes auf jeden Deckzettel hinzu, indem Sie die Spitze direkt unter das Medium einführen, ohne die Deckzettel zu berühren. Pipette langsam, um eine Ausbreitung des DNA-Mixes zu vermeiden.Bringen Sie die Schüssel langsam zurück in den Inkubator und lassen Sie sie dort für 30 bis 45 Minuten stehen. Drehen Sie die Abdeckung zurück zur Gliaschale zu Hause mit der Wachspunktseite nach unten und stellen Sie die Schüssel wieder in den Inkubator. Für die AIS-Quantifizierung öffnen Sie die Bilder der Z-Serie in Fidschi und generieren Sie eine maximale Projektion von Bildern.Nachdem Sie das Hintergrundsignal für den leeren Cover-Slip vom Bild subtrahiert haben, zeichnen Sie eine Linie entlang des AIS und stellen Sie sicher, dass die Breite der Linie den AIS vollständig abdeckt. Starten Sie die Linie, bevor das AIS-Signal über den Hintergrund ausgelöst wird, und stoppen Sie, nachdem es in den Hintergrund fällt. Messen Sie die mittlere Pixelintensität entlang der Linie und exportieren Sie sie in eine Tabelle.Führen Sie dann ein MATLAB-Skript aus, um die endgültige Zahl zu generieren. Das Experiment sollte Cre-BFP nur Transfektion als Negativkontrolle, Cre-BFP plus 480 Kilodalton Ankyrin-G Kotransfektion als Positivkontrolle und einen nicht transfizierten Zustand als Technikkontrolle umfassen. In der reinen Cre-BFP-Kontrolle fehlt transfizierten Neuronen die Ansammlung von AIS-Markern, einschließlich Ankyrin-G, Beta-4-Spectrin, Neurofaszin und spannungsgesteuerten Natriumkanälen.Im Gegensatz dazu haben Cre und 480 Kilodalton Ankyrin-G co-transfizierte Neuronen vollständig zusammengesetzte AIS, was durch das Vorhandensein von AIS-Markern gezeigt wird. Es ist wichtig, die Qualität der Kultur durch Vergleich mit den nicht transfizierten Gerichten zu bestätigen. Ungesunde Neuronen neigen dazu, eine abnormale AIS-Struktur zu zeigen, wie abgesetzte oder ektopische AIS.Um zu beurteilen, wie sich eine Mutation einer ankyrin-G-neurologischen Entwicklungsstörung auf die AIS-Assemblierung auswirkt, wurde die durchschnittliche AIS-Intensität vom Soma bis zum distalen Axon dargestellt. AIS-angereicherte Proteine zeigen normalerweise einen schnellen Anstieg des Signals vom proximalen Axon und eine langsame Abnahme des Signals zum distalen Axon. Wenn sie mit dem nicht transfizierten AIS ausgerichtet ist, ist die Mutantenkurve breiter und der Peak der Kurve niedriger, was auf eine Strukturänderung von AIS hindeutet.Das Wildtyp-Ankyrin-G-AIS, das eng mit dem nicht transfizierten AIS übereinstimmt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Dissektion und das Wachstum der Zellen von einem einzelnen Bereich des Gehirns erleichtert Untersuchung zellulärer und physiologischer Parameter. Wir beschreiben ein Verfahren zur Primär-Zellkultur, die Neuron-angereicherten Kulturen produziert in einem Serum-freien Umgebung.

Primäre Kultur des Hippocampus-Neuronen von neugeborenen Ratten P0

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zu zerlegen, zu transfizieren via Elektroporation und Kultur Maus Hippocampus und kortikalen Neuronen. Kurzfristige Kulturen können für die Untersuchung der Axon Auswuchs und Beratung verwendet werden, während die langfristigen Kulturen für ein Studium der Synaptogenese und dendritischen Dorn Analyse verwendet werden können.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Das Video zeigt eine Methode zur Kultivierung von Neuronen aus murinen Hippocampi. Zunächst durchlaufen die Hippocampus eine enzymatische Verdauung, um die extrazelluläre Gewebematrix aufzubrechen. Anschließend wird das verdaute Gewebe mechanisch aufgebrochen, um einzelne Neuronen zu isolieren. Schließlich werden diese Neuronen auf glialen Feederzellen kultiviert.

Eine Technik zur Kultivierung von Hippocampus-Neuronen von Mäusen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Etablierung einer indirekten Neuron-Astrozyten-Co-Kultur unter Verwendung eines kompartimentierten Ansatzes. In diesem Aufbau sind Neuronen und Astrozyten räumlich getrennt, teilen sich aber ein konditioniertes Medium. Neurotrophe Faktoren, die von Astrozyten freigesetzt werden, fördern die Differenzierung von Neuronen und die Bildung synaptischer Verbindungen, was auf Neuron-Glia-Interaktionen hindeutet.

Eine indirekte Neuron-Astrozyten-Co-Kulturtechnik zur Untersuchung von Neuron-Glia-Interaktionen

Wir beschreiben Verfahren für die Kennzeichnung und Genotypisierung neugeborenen Mäusen und Erzeugung primären neuronalen Kulturen von ihnen. Die Genotypisierung ist schnell, effizient und zuverlässig und ermöglicht die automatisierte Nukleinsäureextraktion. Dies ist besonders nützlich für neonatal letale Mäusen und Kulturen, die vor Abschluss der Genotypisierung erfordern.

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

Kulturen mit niedriger Dichte von primären hippokampalen Neuronen benötigen normalerweise eine Glia-Feeder-Schicht, um neurotrophe Faktoren zu liefern und die Langlebigkeit zu erhalten. Wir beschreiben hier eine vereinfachte Methode zur Kultivierung von Neuronen mit extrem niedriger Dichte auf Glasdeckgläsern in Gegenwart einer neuronalen Feeder-Schicht mit hoher Dichte, die die Untersuchung spezifischer neuronal-autonomer Mechanismen erleichtert.

Ein vereinfachtes Verfahren für Ultra-Low Density, Long-Term Primäre Hippocampus Kultur

Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Kultivierung niedriger Dichte primären hippocampalen Neuronen wachsen auf Glasdeckgläschen über einen einschichtigen glial invertiert. Das Neuron und Glia-Schichten werden durch Paraffinwachsperlen abgetrennt. Die Neuronen durch diese Verfahren gezüchtet sind geeignet für hochauflösende optische Bildgebung und funktionelle Assays.

Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

Präsentiert hier ist ein Protokoll für die spontane Erzeugung von Neurosphären in neuronalen Vorläuferzellen aus hochdichten plattierten Neuronen angereichert. Während des gleichen Experiments, wenn Neuronen mit einer niedrigeren Dichte plattiert werden, führt das Protokoll auch zu verlängerten primären Rattenneuronkulturen.

Generation von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus und kortikalen Neuronen isoliert aus E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Dieses Protokoll zeigt, wie man eine hochauflösende Mikroskopie einsetzt, um die Proteinkolokalisierung in primären neuronalen Kulturen zu untersuchen.

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Einfache und reproduzierbare Low-Density-Primärkultur mit gefrorenem Bestand embryonaler Hippocampus-Neuronen

Erfahren Sie, wie Sie primär kultivierte Hippocampus-Neuronen nutzen, um die Anordnung von Axon-Anfangssegmenten quantitativ zu untersuchen. Diese Methode erlaubt die Analyse genetischer Einflüsse auf die neuronale Struktur.

Verwendung von primär kultivierten Hippocampus-Neuronen zur Untersuchung der Anordnung von Axon-Anfangssegmenten

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