Nahezu simultanes Laserscanning Konfokal- und Atomkraftmikroskopie (Conpokal) auf lebenden Zellen
11. August 2020
Hier wird das Protokoll der Conpokal-Technik vorgestellt, das konfokale und atomare Kraftmikroskopie zu einer einzigen Instrumentenplattform vereint. Conpokal bietet die gleiche Zelle, die gleiche Region, fast gleichzeitige konfokale Bildgebung und mechanische Charakterisierung von lebenden biologischen Proben.
Conpokal kombiniert konfokale Mikroskopie mit Atomkraftmikroskopie mit einer Sonde, um die Probenoberfläche zu stochern. Obwohl beide Techniken individuell wirksam sind, erleichtert Conpokal die Fluoreszenz-Kolokalisierung mit mechanischer Charakterisierung. Der Hauptvorteil der Conpokal-Technik ist die nahezu gleichzeitige Doppelmikroskopie.
Confocal untersucht zytoskelettale und andere zelluläre Prozesse vor und nach AFM-Sondierung, die bereichsspezifische mechanische Eigenschaften liefert. Diese Technik ist im bereich der Mechanobiologie wirkungsvoll, da beispielsweise Gehirnzellen unter physiologischen Bedingungen untersucht werden können, um elektrische Impulse und Krafttransaktionen zu untersuchen. Bevor Sie mit der Analyse beginnen, wählen Sie einen geeigneten AFM-Ausleger für die gewünschte Datenerfassung aus und verwenden Sie Handschuhe, die AFM-Chip-Montagestufe, eine Pinzette und einen kleinen Schraubendreher, um den Chip in den Glasblock zu montieren.
Legen Sie den AFM-Chip vorsichtig auf die Mitte des Glasblocks. Der Ausleger plus ein sehr kleiner Teil des AFM-Chips sollte sich im sichtbaren, nicht-undurchsichtigen Teil des Glasblocks befinden. Verwenden Sie den Schraubendreher, um die Schraube festzuziehen, bis der Chip an den Glasblock geschraubt ist, und verwenden Sie eine Linse, um zu überprüfen, ob der Chip richtig ausgerichtet ist.
Wenn der Chip richtig ausgerichtet ist, legen Sie den Glasstein in die richtige Ausrichtung in den AFM-Kopf und verriegeln Sie den Glasstein. Nachdem Sie den Boden der Kalibrierschale mittels Hellfeldmikroskopie lokalisiert haben, verwenden Sie das AFM-System Z Schrittmotor-Bedienfeld, um den AFM-Ausleger 2000 Mikrometer über die Probe zu bewegen. Mit hellen Feldbeleuchtung und dem Z Schrittmotor-Bedienfeld, senken Sie langsam den AFM-Chip auf den Boden der Glasschale in Schritten von 100 bis 200 Mikrometer, um zu vermeiden, dass die AFM-Spitze in die Petrischale stürzt.
Suchen Sie die manuellen Mikrometer, die X Y steuern oder in einfacher Bewegung des AFM-Kopfes auf der Instrumentenplattform. Wenn der Schatten des AFM-Auslegers dunkler wird und die Form schärfer wird, verwenden Sie die manuellen Mikrometer, um den AFM-Kopf zu korrigieren und die Position des AFM-Auslegers im Sichtfeld anzupassen. Zu diesem Zeitpunkt müssen die Nachsuchtabellen möglicherweise angepasst werden.
Achten Sie darauf, dass ein Schatten in der Ansicht der Mikroskopsoftware angezeigt wird, was darauf hinweist, dass die AFM-Spitze näher an den Boden der Schale rückt. Fahren Sie mit kleinen Schritten fort, um die AFM-Spitze zu senken, bis die Spitze größtenteils im Fokus steht. Wenn sich der Laser in Position befindet, positionieren Sie den Laser mit den Laserausrichtungszifferblättern auf der Rückseite der Stelle, an der sich die AFM-Spitze auf dem Ausleger befindet.
Das Laserausrichtungspanel sollte ein Summensignal größer als Null Volt anzeigen. Bewegen Sie den Laser, einen kleinen Abstand in alle Richtungen auf dem AFM Ausleger, bis die maximale Summe Signal erreicht wird, während an der AFM-Spitze zu bleiben. Sobald die Laserposition eingestellt ist, verwenden Sie die manuell gesteuerten Durchbiegungszifferblätter, um die vertikale und seitliche Durchbiegung auf Null zu schalten.
Verwenden Sie die vertikalen und seitlichen Umlenkknöpfe, um den Detektor so auszurichten, dass das Ziel zentriert ist und im Laserausrichtungspanel keine vertikale oder seitliche Durchbiegung beobachtet wird. Öffnen Sie das Kalibrierungsfenster, und geben Sie alle spezifischen Informationen für Experimente ein. Ersetzen Sie den Laserlichtfilter.
Schalten Sie vor der Kalibrierung die konfokale Mikroskop-Lichtquelle aus und schließen Sie das AFM-Gehäuse, um mögliche Geräusche aus dem Raumlicht oder Vibrationen zu dämpfen. Drücken Sie die Kalibrierungstaste, damit das System die Spitze automatisch kalibrieren kann. Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, werden die Steifigkeit des Auslegers und seine Empfindlichkeit im Kalibrierungsfenster angezeigt.
Verwenden Sie dann die Schaltfläche Automated Approach Command, um die Spitze auf den Boden der Probenschale zu senken und die Größe des Hautbereichs, die Auflösung, den Sollwert, die Z-Länge und die Pixelzeit festzulegen, bevor Sie die Wiedergabetaste drücken, um mit dem Scannen zu beginnen. Für konfokale Mikroskop-Bildgebung in der Mikroskop-Software, aktivieren Sie die konfokalen Fähigkeiten und wählen Sie die Laserlinien geeignet für die Farbstoffe, die verwendet wurden, um die Proben zu färben. Wählen Sie eine oder mehrere Laserlinien aus, um diese Features in der Probe zu erregen und abzubilden, und legen Sie die Verstärkung auf einen Wert fest, der die Fluoreszenz der Probe optimiert, aber die Rauschmenge begrenzt.
Passen Sie die Laserleistung an, um gesättigte Pixel zu vermeiden und gleichzeitig den Dynamikbereich zu maximieren, und legen Sie die Lochgröße auf eine Flächeneinheit fest, um die Auflösung für den optischen Schnitt zu maximieren. Passen Sie bei Bedarf die Werte basierend auf der Stichprobenhelligkeit an. Um die Pixelverweilzeit einzustellen, beginnen Sie mit etwa zwei Mikrosekunden Verweilzeit, und passen Sie sich an, um die Sample-Helligkeit nach Bedarf widerzuspiegeln.
Um die Pixelgröße für das ausgewählte Ziel auszuwählen, lassen Sie das Instrument die Pixelgröße über die Nyquist-Optionsschaltfläche und die ausgewählte Anzahl von Pixeln im Bild berechnen. Wählen Sie als Nächstes die Option Scannen aus, und beginnen Sie mit der Datenerfassung. Verwenden Sie den Fokusknopf, um die Fokusebene zu suchen, die die Samples-Features in ihrer klarsten Form darstellt, die Schaltfläche Scannen zum Starten der Datenerfassung und die Capture-Schaltfläche zum Erfassen eines zweidimensionalen Bildes.
Reduzieren Sie die Flächengröße des Scans, umumhüllen Sie die Flächengröße, indem Sie das Bedienfeld verwenden, das die Pixelgröße über die Option Nyquist steuert, umhüllt nur eine einzelne Zelle. Aktivieren Sie das Sammelwerkzeug und verwenden Sie eine Option von unten nach oben, wobei nur die Laserlinie, die ein Feature in der Probe am deutlichsten beleuchtet, die Start- und Endebenen für die zu messende Lautstärke mithilfe des vorgeschlagenen Abstands zwischen den Ebenen festlegen kann. Benennen Sie die Datei, und speichern Sie sie im zugeordneten Ordner.
Wenn wir die Probendicke priori kennen, wählen Sie alternativ die hellste, schärfste und mittlere Ebene aus, indem Sie den Fokus anpassen, um das Volumen zu definieren, und legen Sie die Oberseite so fest, dass die Probendicke über der mittleren Ebene und die Unterseite die Dicke unterhalb der mittleren Ebene aufweist, und wählen Sie dann die entsprechende Schrittgröße aus. Führen Sie die Erfassung aus, indem Sie die Schaltfläche Jetzt ausführen drücken. Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, speichern Sie die Datei im entsprechenden Ordner.
Tragen Sie am Ende des Experiments Handschuhe, während Sie den Glasstein entfernen, und legen Sie ihn in die Montagestation. Verwenden Sie Pinzette mit Gummigriffen, um den AFM-Chip vorsichtig zu entfernen und die verwendete Spitze wieder in die Position der Aufbewahrungsbox zu legen, die außerhalb des Zugriffs ausgerichtet ist, um anzuzeigen, dass sie verwendet wurde. Für zukünftige Referenzen, beachten Sie, welche Spitze im Experiment verwendet wurde.
Hier wird ein repräsentativer AFM-Scan über eine lebende HEK-Zelle gezeigt. Die Höhe für diese spezielle HEK-Zelle betrug etwa 10 Mikrometer, wie der Linienscan zeigt. Hier kann ein Beispiel für einen schlechten Scan aufgrund einer unsachgemäßen AFM-Tippwahl beobachtet werden.
In diesem Bild tauchten schwarze Pixel an der Spitze der Zelle auf, was darauf hindeutet, dass die AFM PA-Zone aufgrund einer großen Zellenhöhe a-range war. Das Ende des AFM-Auslegers erscheint auch im Bild, da der Spitzenversatz mit einer unzureichenden Spitzenhöhe im Vergleich zur Zellhöhe kombiniert ist. Diese Artefakte im AFM-Bild weisen darauf hin, dass ein anderer AFM-Tipp zum Abbilden der Zelle hätte ausgewählt werden müssen.
Drei farblich konfokale Bildgebung kann durchgeführt werden. Zum Beispiel, um den Zellkern, Mikrotubuli und lipophile Membran zu visualisieren. Die Analyse der Spitzeneinzüge in Kombination mit dem nanomechanischen Modell ermöglicht die Erzeugung einer Modulkarte der Oberfläche.
Hier wird eine entsprechende 3D-Projektion des laserkonfokalen Z-Stacks gezeigt. AFM-Scans und gemessene Modulkarten können auch für Mikroben erworben werden, wie in dieser repräsentativen Analyse von Streptococcus mutans Bakterium beobachtet. Wie sich gezeigt hat, kann mit AFM eine bessere Auflösung in dieser Größenordnung erreicht werden als mit der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie.
Die Klebekraftzuordnung ist eine Technik, die durch Conpokal durchgeführt wird, um molekulare Wechselwirkungen zu visualisieren. Zum Beispiel, um die Modulation von Zelloberflächenmolekülen zu untersuchen, um Bindungskinetik zu beobachten. Conpokal leitet einen neuen Weg zur Erforschung von Strukturfunktionsbeziehungen in der medizinischen Mikrobiologie ein.
Zum Beispiel, physikalische und chemische Ereignisse und die Peptidoglykan-Schicht, kann mit Antibiotikaresistenz verbunden werden.
Übersicht
Die Conpokal-Technik integriert Konfokal- und Atomkraftmikroskopie und ermöglicht die nahezu gleichzeitige Bildgebung und mechanische Charakterisierung lebender biologischer Proben. Diese Methode verbessert das Studium zellulärer Prozesse, indem sie detaillierte Einblicke in mechanische Eigenschaften neben der Fluoreszenzbildgebung bietet.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsgebiet
- Mechanobiologie
- Zelluläre Bildgebung
- Biophysikalische Charakterisierung
Hintergrund
- Conpokal kombiniert zwei leistungsstarke Mikroskopietechniken.
- Es ermöglicht Fluoreszenzko-Lokalisierung mit mechanischer Charakterisierung.
- Diese Technik ist besonders nützlich für die Untersuchung von Gehirnzellen unter physiologischen Bedingungen.
- Es erlaubt Forschern, elektrische Impulse und Krafttransaktionen in lebenden Zellen zu untersuchen.
Zweck der Studie
- Ein Protokoll für die Conpokal-Technik bereitzustellen.
- Die Vorteile der Dual-Mikroskopie in der biologischen Forschung zu demonstrieren.
- Das Verständnis von zellulärer Mechanik und Prozessen zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Auswahl und Montage von AFM-Cantilevern.
- Kalibrierung des AFM-Systems.
- Einrichtung und Optimierung der Konfokalbildgebung.
- Verfahren zur Datenerfassung und -analyse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Integration von Konfokal- und AFM-Bildgebung.
- Demonstration der mechanischen Eigenschaftskartierung lebender Zellen.
- Verbessertes Verständnis des zellulären Verhaltens unter mechanischer Belastung.
- Bereitstellung eines detaillierten Protokolls für die Reproduzierbarkeit in der Forschung.
Schlussfolgerungen
- Die Conpokal-Technik ist ein wertvolles Werkzeug in der Mechanobiologie.
- Sie ermöglicht eine umfassende Analyse der zellulären Mechanik und Prozesse.
- Diese Methode kann zu neuen Erkenntnissen in der biologischen Forschung führen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Conpokal enables near simultaneous confocal imaging and atomic force microscopy, providing co-localized mechanical and fluorescence data from live cells. This dual-modality approach supports mechanistic de-risking in target validation by linking subcellular structures to nanoscale mechanical properties such as elastic modulus and adhesion. The technique enhances predictive confidence in preclinical models by enabling direct correlation of cytoskeletal dynamics with force transmission in physiologically relevant conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating cytoskeletal organization with localized mechanical responses in live cells.
- Operational Value: Enables area-specific mechanical property mapping (e.g., elastic modulus, adhesion) alongside subcellular fluorescence signals.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by revealing how molecular perturbations affect cellular mechanophenotypes under near-physiological conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated live-cell systems for quantitative nanomechanical readouts that complement fluorescence-based assays.
- Operational Value: Standardizes probe-sample interaction through calibrated AFM cantilever selection and controlled indentation parameters.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across cell types (e.g., HEK cells, Streptococcus mutans) for consistent mechanical phenotyping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links nanoscale mechanical maps (e.g., modulus, adhesion) to subcellular components via fluorescence co-localization, supporting biomarker alignment in mechanobiology.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal assessment of cellular responses to mechanical or chemical perturbations in live microbiological samples.
- Risk-Adjusted Advancement: Identifies structural-functional relationships (e.g., peptidoglycan layer changes linked to antibiotic resistance) that inform go/no-go decisions in antimicrobial development.
Pipeline & Workflow Integration
Conpokal fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing orthogonal mechanical and imaging data from the same cellular region.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how cytoskeletal drugs or genetic edits alter local stiffness and adhesion in live cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative nanomechanical outputs (e.g., force maps, modulus distributions) when AFM parameters are standardized and calibrated.
- Analytics: Generates co-localized datasets where mechanical properties are directly overlaid with confocal signals (e.g., tubulin, nucleus, membrane) for multiparametric analysis.
- Translational Research: Connects nanomechanical phenotypes to disease-relevant systems (e.g., microbial biofilms, neuronal cultures) only when supported by parallel fluorescence readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable core facility capability for mechanophenotyping across diverse live-cell models without requiring sample fixation or fixation-induced artifacts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking fluorescence-identified structures to quantified mechanical properties at subcellular resolution.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized AFM tip calibration, laser alignment, and deflection zeroing prior to data acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, multi-parametric evidence of target engagement effects on cellular mechanics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to normalize pathological mechanophenotypes in disease-relevant live-cell models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in both confocal microscopy and atomic force microscopy, including probe selection and laser safety.
- Dependent on instrumentation capable of near-simultaneous modality integration, including synchronized scanning stages and dual-detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of indentation parameters (set point, Z length, pixel time) for reproducible mechanical mapping across labs.
- Requires adaptation of AFM cantilever stiffness and tip geometry to match sample topography (e.g., avoiding tip-offset artifacts in high-height cells like HEK).
- Practical limitation: Accurate mechanical mapping depends on proper tip-sample contact and avoidance of artifacts from insufficient tip height or PA zone saturation, as demonstrated in failed scans.
