Name: Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Erfahren Sie, wie das FEMI-Modell die Auswirkungen mütterlicher Entzündung auf die Darmentwicklung von Neugeborenen untersucht. Diese Methode simuliert sterile Chorioamnionitis ohne lebende Bakterien.

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Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health (DK097335 & T32AI007260) und der University of Iowa Stead Family Department of Pediatrics unterstützt.

Alle tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Iowa (Protocol #8041401) genehmigt. Alle Tiere wurden in einer Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) zugelassenem Vivarium an der Universität von Iowa untergebracht. Alle Mäuse waren Wildtyp-Stamm C57Bl/6J.
1. Etablierung von FEMI bei trächtigen Mäusen
<ol><li>LPS-Vorbereitung<ol>
<li>Verwenden Sie LPS aus Escherichia coli O55:B5 (Lagerkonzentration 2 mg/ml).</li>
		<li>LpS-Lagerkonzentration 1:100 mit steriler Saline für eine Arbeitskonzentration von 20 g/ml verdünnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mütterliche LPS-Injektion<ol>
<li>Injizieren Sie schwangere Muttern am Trächtigkeitstag e15. Dieser Zeitpunkt beträgt etwa 75% durch die murine Schwangerschaft, was dieses Modell entwicklungsähnlich dem frühen dritten Trimester von menschlichen Schwangerschaften macht, das ist, wenn die Mehrheit der Frühgeburten aufgrund von Chorioamnionitis auftreten.</li>
		<li>Wiegen Sie schwangere Mäuse unmittelbar vor der Injektion, um eine geeignete LPS-Dosierung zu bestimmen.</li>
		<li>Berechnen Sie die Dosis der Arbeitskonzentration nach folgender Formel: 5 l x Gramm Körpergewicht (gbw), für eine Gesamtdosis von LPS von 100 g/kg. Verwenden Sie für Kontrolltiere ein äquivalentes Volumen normaler Saline zur Injektion.</li>
		<li>Vortex LPS Lösung dreimal für 15 Sekunden auf hoch vor jeder Injektion.</li>
		<li>LPS-Volumen in eine 1 ml Spritze aufteilen.</li>
		<li>Halten Sie schwangere Maus mit Scruffing-Technik. Halten Sie in dorsaler Recumbency-Position und führen Sie die Injektion durch.<ol>
<li>Legen Sie eine 30 Gauge 8 mm Nadelabschrägung über dem rechten unteren Quadranten des Bauches (um Blase und Bauchgefäße zu vermeiden) in einem Winkel von 30 bis 201240° ein. Legen Sie etwa 1/4 bis 1/2 die Länge der Nadel ein.</li>
			<li>Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um vor der Injektion einen Unterdruck zu gewährleisten. Fahren Sie mit der Injektion fort, wenn ein Unterdruck vorliegt.</li>
			<li>Nach der Injektion, beobachten Sie Mäuse für ca. 30 min und kehren dann für den Rest der Schwangerschaft in Die Käfige zurück.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Lieferung und Pflege des Nachwuchses und Darmernte
<ol><li>Liefern Sie Welpen normalerweise über vaginale Lieferung bei e20. HINWEIS: Dieses Modell hat eine erwartete dosisabhängige fetale Verlustrate, die in Abbildung 1 zu sehen ist und in den folgenden Ergebnissen erläutert wird.</li>
	<li>Lassen Sie Welpen bei Müttern bleiben und erhalten Ad libitum Feeds.</li>
	<li>Am Tag der Ernte, typischerweise am 14. Tag (P14), werden Welpen durch Zervixdislokation in Übereinstimmung mit den Protokollen des Institutional Animal Care and Use Committee eingeschläfert.</li>
	<li>Mit Schere und Zange, machen einen vertikalen Schnitt nach unten die Mittellinie des Bauches, durch die Haut und Peritoneum, für die gesamte Länge des Bauches. Den Dünndarm mit der Schere vom Magen zum Cecum verbrauchen und das Mesentery mit Zangen entfernen.</li>
	<li>Isolieren und halten Sie die distalen 1/3 des Dünndarms (Abschnitt repräsentativ für menschliches Ileum), werfen sie den proximalen Dünndarm, das Cecum und den Dickdarm.</li>
	<li>Teilen Sie den Ileum-Anteil mit einer Schere in die Hälfte.</li>
	<li>Legen Sie die proximale Hälfte in eine RNA-Stabilisierungslösung für die spätere RNA-Quantifizierung.</li>
	<li>Legen Sie die distale Hälfte in 10% neutral gepuffertes Formalin für die Folienvorbereitung.</li>
</ol>3. Darmverletzung Scoring
<ol><li>Schnitt Paraffin eingebettet Gewebe in 5 'm dicke Scheiben und montieren auf Glasrutschen. HINWEIS: Wir senden die Proben an einen Histologiekern für Paraffineinbettung, Schnitt und Montage auf Dias.</li>
	<li>Deparaffinisieren Sie Dias nach Standardverfahren.</li>
	<li>Fleckenabschnitte mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardverfahren.</li>
	<li>Punkteabschnitte auf einer 3-Punkte-Skala für Darmverletzungen wie zuvor beschrieben42,43.<ol>
<li>Bewerten Sie mit Hilfe der Lichtmikroskopie die generalisierte Darmverletzung durch zwei getrennte blinde Forscher auf einer 3-Punkte-Skala, in der die Villusintegrität und die Trennung von der Kellermembran43 (Ergänzende Abbildung 1) bewertet werden. Darmverletzungen werden am besten bei 20-facher Vergrößerung und numerischer Blende 0,50 beurteilt.</li>
		<li>Weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu, um die normale Schleimhaut zu beschreiben.</li>
		<li>Weisen Sie eine Punktzahl von 1 beschreiben leichte Verletzungen, die die Entwicklung von subepithelialen Grünhagen Raum, Vakuolisierung oder subepitheliale Heben beschränkt auf die Lamina propria oder Spitzen von Villi umfasst.</li>
		<li>Weisen Sie eine Punktzahl von 2 zu, um schwere Verletzungen zu beschreiben, die durch epitheliale Hebung und Vakuolisierung von mehr als der Hälfte der Zotten-, Zottenverzerrung oder Schleimhautulzerung und Desintegration der Laminapropria angezeigt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Quantifizierung von Paneth- und Kelchenzellen
<ol><li>Nach der Deparaffinierung, Flecken diagletten von Gewebeabschnitten aus Schritt 2.8 mit Alcian Blue/Periodic Acid Schiff Fleck, um sowohl Kelchen und Paneth Zellen wie zuvor beschrieben44,45 nach den folgenden Schritten zu bezeichnen. HINWEIS: Während Alcian Blue/Periodic Acid Schiff Fleck ist nicht spezifisch für Paneth oder Kelche Zellen, unserer Erfahrung nach, blinde erfahrene Forscher haben gleichwertige zelluläre Quantifizierung mit diesem Fleck im Vergleich zu zellulären gezielten Antikörpern, mit deutlich weniger Hintergrundfärbung46.</li>
	<li>Deparaffinisieren, Flecken, und dehydrieren gleitet wie folgt.<ol>
<li>Zweimal 10 min in Xylol untertauchen. VORSICHT: Xylol sollte in einer Dunstabzugshaube verwendet werden.</li>
		<li>Spülen Sie mit 100% EtOH.</li>
		<li>Untertauchen Sie Dias in 100 % EtOH für 3 min, dann in 90% EtOH für 3 min, gefolgt von 70% EtOH für 3 min, und schließlich tauchen Dias in 50% EtOH für 3 min.</li>
		<li>Waschen Sie unter fließendem Leitungswasser für 5 min. VORSICHT: Zeigen Sie den Abschnitt vom fließenden Wasser weg, um den Verlust der Gewebeprobe zu verhindern.</li>
		<li>Filter Alcian blau Fleck Lösung mit einem Standard-Kaffeefilter.</li>
		<li>Fleck gleitet in Alcian blauen Fleck für 15 min und dann unter fließendem Leitungswasser für 2 min waschen.</li>
		<li>1 mg Periodensäure in 200 ml doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Untertauchen Sie Dias in dieser Lösung für 5 min. Dann unter fließendem Leitungswasser für 1 min waschen.</li>
		<li>Mit Schiff-Reagenz 10 min färben. Waschen Sie unter fließendem Leitungswasser für 5 min.</li>
		<li>Die Dias mit Hämatoxylin 1 min beflecken und dann 2 min unter fließendem Leitungswasser waschen.</li>
		<li>Untertauchen Sie sie in sauren Alkohol (1 ml Salzsäure gemischt in 99 ml von 70% EtOH) für 1 min.</li>
		<li>In Scotts Leitungswasser (0,1% Konzentration von NaHCO3 in Leitungswasser) für 1 min untertauchen und dann 1 min unter fließendem Leitungswasser waschen.</li>
		<li>Dehydrieren Sie die Dias.<ol>
<li>Tauchen Sie jede Rutsche 10 Mal in 70% EtOH, dann tauchen Sie 10 mal in 90% EtOH, und 10 mal in 100% EtOH.</li>
			<li>Untertauchen Sie diagleitet in 100% EtOH für 10 min, gefolgt von dem Tauchen zweimal in frisches Xylol für jeweils 3 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Legen Sie einen Tropfen Montagemedium auf das Exemplar und legen Sie einen Deckeldarüberabschlag darüber.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Goblet-Zellzählung<ol>
<li>Mit Hilfe der Lichtmikroskopie Kelchenzellen zählen (Ergänzende Abbildung 2). Für jedes Stück Darmgewebe zählen Sie die Anzahl der Kelchenzellen und 500 Epithelzellen und exprimieren Sie das Kelchenzellverhältnis als Verhältnis pro 100 Epithelzellen. Kelchzellen werden am besten bei 20-facher Vergrößerung und numerischer Blende 0,5 gezählt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paneth-Zellzählung<ol>
<li>Mit Hilfe der Lichtmikroskopie panegieren Sie Paneth-Zellen (Ergänzende Abbildung 2). Für jedes Stück Darmgewebe, Exprimieren als Verhältnis von Paneth-Zellen pro Darmkrypta. Zählen Sie 100 Darmkrypten pro Stück Darmgewebe. Paneth-Zellen werden am besten bei 20x-60x Vergrößerung und numerischer Blende 0.50-1.30 gezählt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Chorioamnionitis wirkt sich auf 2-u20124% der Laufzeit und 25-u201230% der Frühlieferungen8,9. Jedoch, die Auswirkungen der Chorioamnionitis kann lange nach der Geburt verlängern, da es gezeigt hat, dass signifikante Auswirkungen auf den Fötus und Neugeborenen10,11,12,13,14,<sup class="xref"...

Die Chorionmembranen spielen eine wesentliche Rolle bei der Hautschwangerschaft. Dazu gehören die Chorion und Amnion, die mehrere Funktionen erfüllen. Sie umgeben und schützen den Fötus, erleichtern die parakrine Signalisierung zwischen dem mütterlichen und dem fetalen Kompartiment1und erstellen lokale Rückkopplungsschleifen innerhalb der Chorionmembranen, die an der Initiierung der Parturition1beteiligt sein können. Das aktuelle Verständnis der Membranen deutet darauf hin, dass das Amnion eine strukturelle Barrierefunktion bietet, und die Chorion bietet einen immunologischen Puffer, der in erster Linie den sich entwickelnden Fötus vor dem mütterlichen Immunsystem schützt2. Entzündung dieser Membranen ist bekannt als Chorioamnionitis. Historisch gesehen wurde die Diagnose der klinischen Chorioamnionitis nach dem Vorhandensein von mütterlichem Fieber plus einem oder mehreren fetalen oder mütterlichen klinischen Befunden3,4gemacht. Obwohl diese Definition klinisch nützlich ist, hat ihre mangelnde Präzision die Chorioamnionitis-Forschung zu einer Herausforderung gemacht. Im Jahr 2015 definierte ein Experten-Panel-Workshop des Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development Chorioamnionitis als intrauterine Entzündung oder Infektion oder beides (Triple I)3. Diese Klärung ist wichtig, weil, während mikrobielle induzierte Infektion ist eine wichtige Ursache für Gebärmutter/Amnion-Entzündung, es tritt seltener als sterile Gebärmutter/Amniotische Entzündung5,6,7. Insgesamt bleibt die Chorioamnionitis ein erhebliches Problem der öffentlichen Gesundheit, wie sie in 2-u20124% der Laufzeitlieferungen und 25-u201230% der Frühlieferungen8,9gesehen wird.
Chorioamnionitis kann signifikante Auswirkungen auf den Fötus und Neugeborenen haben. Es ist in der Literatur gut dokumentiert, dass Chorioamnionitis mit einem erhöhten Risiko für viele der Morbiditäten der Frühreife verbunden ist, einschließlich bronchopulmonaler Dysplasie10, zerebrale weiße Materie Verletzung11, intraventrikuläre Blutung12, Retinopathie der Frühreife13, und sowohl vermutet und bestätigt früh einsetzte neonatale Sepsis14,15. Da wir an Verletzungs- und Reparaturmechanismen des unreifen Darmtraktes interessiert sind, ist es wichtig zu beachten, dass Chorioamnionitis auch mit der späteren Entwicklung der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC)15,16verbunden ist. NEC ist eine verheerende Magen-Darm-Erkrankung von Frühgeborenen, die zu einer dysregulierten Wirtsreaktion auf Entzündungen und anschließende Darmnekrose17führt. Jedes Jahr betrifft NEC über 4000 Säuglinge in den Vereinigten Staaten, und bis zu einem Drittel dieser Säuglinge sterben an der Krankheit18. Die Pathogenese von NEC beinhaltet wahrscheinlich eine Kombination von Darmunreife, Dysregulation des unreifen Immunsystems, Darmentzündung, und bakterielle Translokation19, die in einem letzten gemeinsamen Weg der Darmnekrose gipfelt. Wichtig ist, dass der Beginn von NEC oft Wochen nach der Geburt und eine mögliche Exposition gegenüber Chorioamnionitis auftritt, was die mechanistische Verbindung zwischen Chorioamnionitis und der anschließenden Entwicklung von NEC unklarmacht 20. Ein potenzieller Mechanismus, durch den Chorioamnionitis zur Pathophysiologie von NEC beitragen kann, ist durch Upregulation des mütterlichen Immunsystems, die anschließend eine starke fetale Entzündungsreaktion produziert, die normale fetale Entwicklungsmuster stören kann21,22,23.
Mehrere Säugetiermodelle der Chorioamnionitis existieren bei Nagetieren und Schafen24,25,26,27,28,29,30,31,32. Es liegen jedoch nur wenige Daten über die Entwicklung des Darmtraktes nach der ersten Neugeborenenperiode nach der Chorioamnionitis-induzierten fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung (FEMI) vor. Um den Zusammenhang zwischen FEMI und der anschließenden Entwicklung der Verletzung des unreifen Darmtraktes zu untersuchen, haben wir das Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte FEMI-Modell angepasst. Lipopolysaccharide sind ein wichtiger Bestandteil der extrazellulären Oberfläche auf gramnegativen Bakterien und sind ein starkes Stimulans des angeborenen Immunsystems mehrerer eukaryotischer Arten, einschließlich Menschen33. Die mütterliche LPS-Injektion führt zu einer sterilen entzündlichen Kaskade ohne die verwirrenden Wirkungen lebender Bakterien, und es ist ein etabliertes Modell für die Induktion der Frühgeburt34, sowie ein Modell der akuten Chorioamnionitis und des fetalen Entzündungsreaktionssyndroms (FIRS), das die schwerste Form der Chorioamnionitis24,35ist. Es hat sich auch gezeigt, dass sowohl zerebrale weiße und graue Materie Verletzung in einem Schaf Modell36 und ein murines Modell37,38,39,40induzieren. Unserer Kenntnis nach sind wir jedoch die ersten, die dieses Modell der Chorioamnionitis und FEMI verwenden, um seine Auswirkungen auf die Entwicklung des Magen-Darm-Traktes nach der Geburt zu untersuchen und einen möglichen mechanistischen Zusammenhang zwischen Chorioamnionitis und späterer Entwicklung von NEC41,42zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>10% neutrales gepuffertes Formalin</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue Stain</td><td>Neuling Versorgung</td><td>1003A</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl6/J Mäuse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin-Fleck</td><td>Leica</td><td>381562</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-U Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>2CE-MQVJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Periodische Säure</td><td>ACROS</td><td>H5106</td><td>CAS# 10450-59-9</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermofisher</td><td>Am7021</td><td></td></tr><tr><td>Schiff's Reagenz</td><td>Sigma</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Secor Imager 2400</td><td>Meso-Scale-Discovery (MSD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V-Plex-Assay</td><td>Meso-Scale-Discovery (MSD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol-Sigma-534056</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein murines modell der fetalen exposition gegenüber mütterlicher entzündung, um die auswirkungen der akuten chorioamnionitis auf die darmentwicklung von neugeborenen zu untersuchen

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis ist ein häufiges Ausfällmittel der Frühgeburt und ist mit vielen der Morbiditäten der Frühreife verbunden, einschließlich nekrotisierender Enterokolitis (NEC). Eine mechanistische Verbindung zwischen diesen beiden Bedingungen muss jedoch noch entdeckt werden. Wir haben ein murines Modell der Chorioamnionitis mit Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte fetale Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung (FEMI) angenommen. Dieses Modell von FEMI induziert eine sterile mütterliche, Plazenta und fetale entzündliche Kaskade, die auch in vielen Fällen der klinischen Chorioamnionitis vorhanden ist. Obwohl Es Modelle gibt, die lebende Bakterien nutzen und die Pathophysiologie einer aufsteigenden Infektion, die zu Einer Chorioamnionitis führt, genauer imitieren, können diese Methoden indirekte Auswirkungen auf die Entwicklung des unreifen Darmtraktes und das damit verbundene entwickelnde Mikrobiom verursachen. Mit diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass LPS-induzierte FEMI zu einer dosisabhängigen Zunahme des Schwangerschaftsverlusts und der Frühgeburt sowie zu einer Störung der normalen Darmentwicklung bei Nachkommen führt. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass FEMI darmverletzungen und Serumzytokine bei Nachkommen signifikant erhöht und gleichzeitig Die Kelch- und Panethzellen verringert, die beide eine erste Reihe angeborener Immunität gegen Darmentzündungen bieten. Obwohl ein ähnliches Modell der LPS-induzierten FEMI verwendet wurde, um die Assoziation zwischen Chorioamnionitis und nachfolgenden Anomalien des zentralen Nervensystems zu modellieren, ist dieses Protokoll unseres Wissens der erste Versuch, eine mechanistische Verbindung zwischen Chorioamnionitis und späteren Störungen in der Darmentwicklung als potenzielleverbindung zwischen Chorioamnionitis und NEC aufzuklären.

Die Exposition gegenüber FEMI am embryonalen Tag 15 führt zu einem dosisabhängigen Schwangerschaftsverlust und einer dosisabhängigen Rate der Frühzeitarbeit (Abbildung 1)42. Für die Experimente haben wir uns für eine LPS-Dosis von 100 g/kg entschieden, um Schwangerschaftsverlust und Frühreife (50% Verlust zwischen Frühreife und intrauterinem fetalem Tod) zu minimieren und gleichzeitig die Föten einer signifikanten entzündlichen Beleidigung auszusetzen.
<p class="j...

Wir entwickelten ein Modell der Chorioamnionitis, um die fetale Exposition gegenüber mütterlichen Entzündungen (FEMI) ohne Komplikationen lebender Organismen zu simulieren, um die Auswirkungen von FEMI auf die Entwicklung des Darmtraktes der Nachkommen zu untersuchen. Dies ermöglicht die Untersuchung der mechanistischen Ursachen für die Entwicklung von Darmverletzungen nach Chorioamnionitis.

Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Dieses FEMI-Protokoll ermöglicht es, Langzeitwirkungen auf Neugeborene zu untersuchen, nachdem der Fötus einer mütterlichen Entzündung ausgesetzt war. Dies ist besonders relevant für die Entwicklung einer nekrotisierenden Enterokolitis (NEC). Diese Technik ahmt die sterile Entzündung nach, die häufig bei Chorioamnionitis auftritt, und der Mangel an lebenden Bakterien kann verwirrende Auswirkungen auf den sich entwickelnden Darmtrakt und das Mikrobiom haben.Der wichtigste Schritt dieses Protokolls ist die LPS-Injektion zur Induktion von FEMI. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass eine angemessene LPS-Dosis angewendet wird und dass die Injektion bei der trächtigen Maus kein intraperitoneales Trauma verursacht. Beginnen Sie damit, die LPS-Brühe eins bis 100 mit steriler Kochsalzlösung zu verdünnen, um eine Arbeitskonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen.Injizieren Sie trächtige Hündinnen am Trächtigkeitstag E15. Wiegen Sie die Mäuse unmittelbar vor der Injektion, um die geeignete LPS-Dosierung zu bestimmen, wobei Sie bei Kontrolltieren ein äquivalentes Volumen normaler Kochsalzlösung verwenden. Wirbeln Sie die LPS-Lösung dreimal für 15 Sekunden auf hoher Stufe auf.Ziehen Sie es dann in eine Ein-Milliliter-Spritze auf. Verwenden Sie die Scrubfing-Technik, um die trächtige Maus festzuhalten und sie in der dorsalen Liegeposition zu halten. Führen Sie etwa ein Viertel bis die Hälfte einer 30-Gauge-Nadelabschrägung von acht Millimetern in einem Winkel von 30 bis 40 Grad über den rechten unteren Quadranten des Bauches ein.Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um einen Unterdruck zu gewährleisten. Fahren Sie dann mit der Injektion fort, wenn ein Unterdruck anliegt. Überwachen Sie die Mäuse etwa 30 Minuten lang und setzen Sie sie dann für den Rest der Trächtigkeit in Käfige zurück.Bringen Sie die Welpen per vaginaler Entbindung bei E20 zur Welt und lassen Sie sie bei den Müttern bleiben und ad libitum gefüttert werden. Entnehmen Sie den Darm am 14. Tag nach der Geburt. Verwenden Sie eine Schere und eine Pinzette, um einen vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie des Bauches durch die Haut und das Bauchfell über die gesamte Länge des Bauches zu machen.Exzidieren Sie den Dünndarm vom Magen bis zum Blinddarm und entfernen Sie das Mesenterium. Isolieren Sie das distale Drittel des Dünndarms und verwerfen Sie den proximalen Dünndarm, den Blinddarm und den Dickdarm. Teilen Sie den Ileum-Teil mit einer Schere in zwei Hälften.Legen Sie dann die proximale Hälfte in eine RNA-Stabilisierungslösung für die RNA-Quantifizierung und die distale Hälfte in 10 % neutral gepuffertes Formalin für die Objektträgervorbereitung. Schneiden Sie in Paraffin eingebettetes Gewebe in fünf Mikrometer dicke Scheiben und montieren Sie sie auf Objektträger. Entparaffinieren Sie die Objektträger und färben Sie die Schnitte dann mit Hämatoxylin und Eosin gemäß den Standardverfahren.Verwenden Sie die Lichtmikroskopie, um die generalisierte Darmschädigung durch zwei separate verblindete Untersucher auf einer Drei-Punkte-Skala zu beurteilen und die Zottenintegrität und die Trennung von der Basalmembran zu bewerten. Weisen Sie eine Punktzahl von Null zu, um die normale Schleimhaut zu beschreiben. Weisen Sie eine Punktzahl von eins zu, um eine leichte Verletzung zu beschreiben, die die Entwicklung des subepithelialen Gruenhagen-Raums, die Vakuolisierung oder das subepitheliale Lifting umfasst, das auf die Lamina propria oder die Zottenspitzen beschränkt ist.Weisen Sie eine Punktzahl von zwei zu, um schwere Verletzungen zu beschreiben, die durch epitheliale Straffung und Vakuolisierung von mehr als der Hälfte der Zotten, Zottenverzerrung oder Schleimhautgeschwüre und Zerfall der Lamina propria angezeigt werden. Tauchen Sie die Objektträger zweimal für 10 Minuten in Xylol. Spülen Sie sie dann mit 100% Ethanol ab.Tauchen Sie die Objektträger drei Minuten lang in 100 % Ethanol, 90 % Ethanol, 70 % Ethanol und 50 % Ethanol. Waschen Sie die Objektträger dann fünf Minuten lang unter fließendem Wasser mit dem Gesicht zum Wasser abgewandt, um einen Verlust der Gewebeprobe zu vermeiden. Filtrieren Sie die Alcian-Blaufleckenlösung mit einem Standard-Kaffeefilter und verwenden Sie ihn, um die Objektträger 15 Minuten lang zu färben.Waschen Sie sie dann zwei Minuten lang unter fließendem Leitungswasser. Verdünnen Sie ein Milligramm periodische Säure in 200 Millilitern doppelt destilliertem Wasser und tauchen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in diese Lösung. Nach einer einminütigen Wäsche unter fließendem Wasser färben Sie die Objektträger 10 Minuten lang mit dem Schiffsreagenz und waschen Sie sie erneut fünf Minuten lang.Anschließend färben Sie sie eine Minute lang mit Hämatoxylin und waschen Sie sie zwei Minuten lang mit Wasser. Tauchen Sie sie eine Minute lang in sauren Alkohol, dann eine Minute lang in Scotts Leitungswasser, gefolgt von einer Wäsche unter fließendem Leitungswasser für eine Minute. Um die Objektträger zu dehydrieren, tauchen Sie jeden Objektträger 10 Mal in 70 % Ethanol, 90 % Ethanol und dann 100 % Ethanol.Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in 100 % Ethanol und tauchen Sie sie anschließend zweimal für jeweils drei Minuten in frisches Xylol. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmittel auf die Probe und ein Deckglas darauf. Zählen Sie Becherzellen unter dem Mikroskop.Zählen Sie für jedes Stück Darmgewebe die Anzahl der Becherzellen und 500 Epithelzellen. Exprimieren Sie dann die Becherzellen im Verhältnis pro 100 Epithelzellen. Zählen Sie die Paneth-Zellen.Notieren Sie für jedes Stück Darmgewebe das Verhältnis der Paneth-Zellen pro Darmkrypta und zählen Sie 100 Darmkrypten für jedes Stück Darmgewebe. Die Exposition des Fötus gegenüber einer mütterlichen Entzündung (FEMI) am embryonalen Tag 15 führt zu einem dosisabhängigen Schwangerschaftsverlust und einer dosisabhängigen Rate von Frühgeburten. FEMI führt bei der Geburt und in der achten Lebenswoche zu einer signifikanten Darmschädigung.Diese Verletzung tritt auf, wenn keine zusätzlichen Reize für die Tiere vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass FEMI allein die normale Homöostase des neugeborenen murinen Darmtrakts stört. Die Anzahl der Mucin-produzierenden Becherzellen und der antimikrobiellen Peptid-produzierenden Paneth-Zellen im distalen Drittel des Dünndarmtraktes wurde quantifiziert. Es wurde festgestellt, dass FEMI im Vergleich zu Tieren ohne FEMI die normale Zusammensetzung des Darmepithels störte, indem es den Verlust beider Zelltypen induzierte.Um die Auswirkungen von FEMI auf die Entzündungsreaktion bei Neugeborenen zu untersuchen, wurde eine Vielzahl von Serum-Entzündungsmarkern quantifiziert, darunter Interleukin-1 beta, Interleukin-10, KCGRO und Interleukin-6, aus dem Serum von Jungtieren mit und ohne FEMI. FEMI erhöhte die Entzündungskaskade für alle Zytokine an P0 signifikant. Die Entzündungskaskade im späteren Alter unterschied sich je nach Zeitpunkt und Zytokin. Interessanterweise gab es ähnliche IL6-Spiegel bei P7 bis P28 in der FEMI- und der Scheingruppe.In der FEMI-Gruppe bei P56 waren die Spiegel jedoch signifikant höher, obwohl keine sekundäre Intervention erfolgte. Es ist wichtig, eine anfängliche LPS-Dosiskurve durchzuführen, da verschiedene LPS-Bestände unterschiedliche Potenzen haben können. Wir haben festgestellt, dass unsere neonatalen Ergebnisse von der Dosis von LPS abhängen, die zur Induktion von FEMI verwendet wird.

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Frühgeburten (Entbindung &lt; 37. Woche) sind ein dringendes globales Gesundheitsproblem mit suboptimalen Präventions- und Behandlungsmöglichkeiten. Wir stellen ein Mausmodell der aufsteigenden vaginalen bakteriellen Infektion induzierten Frühgeburt vor und skizzieren, wie die daraus resultierende neonatale Morbidität und Mortalität analysiert werden kann.

Modellierung von aufsteigenden vaginalen Infektionen, Frühgeburten und neonataler Morbidität bei Mäusen

Dieses Protokoll skizziert ein neonatales Mausmodell der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC) und die anschließende Isolierung von Immunzellen der Lamina propria aus dem neonatalen Dünndarm der Maus.

Ein neonatales Mausmodell der nekrotisierenden Enterokolitis und der Isolierung von Lamina propria für die Erstellung von Immunzellprofilen

Der Artikel bietet ein umfassendes Protokoll zur Erstellung eines mütterlichen Immunaktivierungsmodells (MIA), das die Auswirkungen früher Schwangerschafts-Entzündungen auf die Neuroentwicklung untersucht, einschließlich wichtiger Kennzahlen zur Gewährleistung von Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit.

Erzeugung des frühgestationalen mütterlichen Immunaktivierungsmodells zur Beurteilung pränataler Entzündungen auf die Neuroentwicklung

Erfahren Sie, wie das FEMI-Modell die Auswirkungen mütterlicher Entzündung auf die Darmentwicklung von Neugeborenen untersucht. Diese Methode simuliert sterile Chorioamnionitis ohne lebende Bakterien.

Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen (Video) | JoVE Journal

Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen

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