Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen

Wir entwickelten ein Modell der Chorioamnionitis, um die fetale Exposition gegenüber mütterlichen Entzündungen (FEMI) ohne Komplikationen lebender Organismen zu simulieren, um die Auswirkungen von FEMI auf die Entwicklung des Darmtraktes der Nachkommen zu untersuchen. Dies ermöglicht die Untersuchung der mechanistischen Ursachen für die Entwicklung von Darmverletzungen nach Chorioamnionitis.

Dieses FEMI-Protokoll ermöglicht es, Langzeitwirkungen auf Neugeborene zu untersuchen, nachdem der Fötus einer mütterlichen Entzündung ausgesetzt war. Dies ist besonders relevant für die Entwicklung einer nekrotisierenden Enterokolitis (NEC). Diese Technik ahmt die sterile Entzündung nach, die häufig bei Chorioamnionitis auftritt, und der Mangel an lebenden Bakterien kann verwirrende Auswirkungen auf den sich entwickelnden Darmtrakt und das Mikrobiom haben.

Der wichtigste Schritt dieses Protokolls ist die LPS-Injektion zur Induktion von FEMI. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass eine angemessene LPS-Dosis angewendet wird und dass die Injektion bei der trächtigen Maus kein intraperitoneales Trauma verursacht. Beginnen Sie damit, die LPS-Brühe eins bis 100 mit steriler Kochsalzlösung zu verdünnen, um eine Arbeitskonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen.

Injizieren Sie trächtige Hündinnen am Trächtigkeitstag E15. Wiegen Sie die Mäuse unmittelbar vor der Injektion, um die geeignete LPS-Dosierung zu bestimmen, wobei Sie bei Kontrolltieren ein äquivalentes Volumen normaler Kochsalzlösung verwenden. Wirbeln Sie die LPS-Lösung dreimal für 15 Sekunden auf hoher Stufe auf.

Ziehen Sie es dann in eine Ein-Milliliter-Spritze auf. Verwenden Sie die Scrubfing-Technik, um die trächtige Maus festzuhalten und sie in der dorsalen Liegeposition zu halten. Führen Sie etwa ein Viertel bis die Hälfte einer 30-Gauge-Nadelabschrägung von acht Millimetern in einem Winkel von 30 bis 40 Grad über den rechten unteren Quadranten des Bauches ein.

Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um einen Unterdruck zu gewährleisten. Fahren Sie dann mit der Injektion fort, wenn ein Unterdruck anliegt. Überwachen Sie die Mäuse etwa 30 Minuten lang und setzen Sie sie dann für den Rest der Trächtigkeit in Käfige zurück.

Bringen Sie die Welpen per vaginaler Entbindung bei E20 zur Welt und lassen Sie sie bei den Müttern bleiben und ad libitum gefüttert werden. Entnehmen Sie den Darm am 14. Tag nach der Geburt. Verwenden Sie eine Schere und eine Pinzette, um einen vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie des Bauches durch die Haut und das Bauchfell über die gesamte Länge des Bauches zu machen.

Exzidieren Sie den Dünndarm vom Magen bis zum Blinddarm und entfernen Sie das Mesenterium. Isolieren Sie das distale Drittel des Dünndarms und verwerfen Sie den proximalen Dünndarm, den Blinddarm und den Dickdarm. Teilen Sie den Ileum-Teil mit einer Schere in zwei Hälften.

Legen Sie dann die proximale Hälfte in eine RNA-Stabilisierungslösung für die RNA-Quantifizierung und die distale Hälfte in 10 % neutral gepuffertes Formalin für die Objektträgervorbereitung. Schneiden Sie in Paraffin eingebettetes Gewebe in fünf Mikrometer dicke Scheiben und montieren Sie sie auf Objektträger. Entparaffinieren Sie die Objektträger und färben Sie die Schnitte dann mit Hämatoxylin und Eosin gemäß den Standardverfahren.

Verwenden Sie die Lichtmikroskopie, um die generalisierte Darmschädigung durch zwei separate verblindete Untersucher auf einer Drei-Punkte-Skala zu beurteilen und die Zottenintegrität und die Trennung von der Basalmembran zu bewerten. Weisen Sie eine Punktzahl von Null zu, um die normale Schleimhaut zu beschreiben. Weisen Sie eine Punktzahl von eins zu, um eine leichte Verletzung zu beschreiben, die die Entwicklung des subepithelialen Gruenhagen-Raums, die Vakuolisierung oder das subepitheliale Lifting umfasst, das auf die Lamina propria oder die Zottenspitzen beschränkt ist.

Weisen Sie eine Punktzahl von zwei zu, um schwere Verletzungen zu beschreiben, die durch epitheliale Straffung und Vakuolisierung von mehr als der Hälfte der Zotten, Zottenverzerrung oder Schleimhautgeschwüre und Zerfall der Lamina propria angezeigt werden. Tauchen Sie die Objektträger zweimal für 10 Minuten in Xylol. Spülen Sie sie dann mit 100% Ethanol ab.

Tauchen Sie die Objektträger drei Minuten lang in 100 % Ethanol, 90 % Ethanol, 70 % Ethanol und 50 % Ethanol. Waschen Sie die Objektträger dann fünf Minuten lang unter fließendem Wasser mit dem Gesicht zum Wasser abgewandt, um einen Verlust der Gewebeprobe zu vermeiden. Filtrieren Sie die Alcian-Blaufleckenlösung mit einem Standard-Kaffeefilter und verwenden Sie ihn, um die Objektträger 15 Minuten lang zu färben.

Waschen Sie sie dann zwei Minuten lang unter fließendem Leitungswasser. Verdünnen Sie ein Milligramm periodische Säure in 200 Millilitern doppelt destilliertem Wasser und tauchen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in diese Lösung. Nach einer einminütigen Wäsche unter fließendem Wasser färben Sie die Objektträger 10 Minuten lang mit dem Schiffsreagenz und waschen Sie sie erneut fünf Minuten lang.

Anschließend färben Sie sie eine Minute lang mit Hämatoxylin und waschen Sie sie zwei Minuten lang mit Wasser. Tauchen Sie sie eine Minute lang in sauren Alkohol, dann eine Minute lang in Scotts Leitungswasser, gefolgt von einer Wäsche unter fließendem Leitungswasser für eine Minute. Um die Objektträger zu dehydrieren, tauchen Sie jeden Objektträger 10 Mal in 70 % Ethanol, 90 % Ethanol und dann 100 % Ethanol.

Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in 100 % Ethanol und tauchen Sie sie anschließend zweimal für jeweils drei Minuten in frisches Xylol. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmittel auf die Probe und ein Deckglas darauf. Zählen Sie Becherzellen unter dem Mikroskop.

Zählen Sie für jedes Stück Darmgewebe die Anzahl der Becherzellen und 500 Epithelzellen. Exprimieren Sie dann die Becherzellen im Verhältnis pro 100 Epithelzellen. Zählen Sie die Paneth-Zellen.

Notieren Sie für jedes Stück Darmgewebe das Verhältnis der Paneth-Zellen pro Darmkrypta und zählen Sie 100 Darmkrypten für jedes Stück Darmgewebe. Die Exposition des Fötus gegenüber einer mütterlichen Entzündung (FEMI) am embryonalen Tag 15 führt zu einem dosisabhängigen Schwangerschaftsverlust und einer dosisabhängigen Rate von Frühgeburten. FEMI führt bei der Geburt und in der achten Lebenswoche zu einer signifikanten Darmschädigung.

Diese Verletzung tritt auf, wenn keine zusätzlichen Reize für die Tiere vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass FEMI allein die normale Homöostase des neugeborenen murinen Darmtrakts stört. Die Anzahl der Mucin-produzierenden Becherzellen und der antimikrobiellen Peptid-produzierenden Paneth-Zellen im distalen Drittel des Dünndarmtraktes wurde quantifiziert. Es wurde festgestellt, dass FEMI im Vergleich zu Tieren ohne FEMI die normale Zusammensetzung des Darmepithels störte, indem es den Verlust beider Zelltypen induzierte.

Um die Auswirkungen von FEMI auf die Entzündungsreaktion bei Neugeborenen zu untersuchen, wurde eine Vielzahl von Serum-Entzündungsmarkern quantifiziert, darunter Interleukin-1 beta, Interleukin-10, KCGRO und Interleukin-6, aus dem Serum von Jungtieren mit und ohne FEMI. FEMI erhöhte die Entzündungskaskade für alle Zytokine an P0 signifikant. Die Entzündungskaskade im späteren Alter unterschied sich je nach Zeitpunkt und Zytokin. Interessanterweise gab es ähnliche IL6-Spiegel bei P7 bis P28 in der FEMI- und der Scheingruppe.

In der FEMI-Gruppe bei P56 waren die Spiegel jedoch signifikant höher, obwohl keine sekundäre Intervention erfolgte. Es ist wichtig, eine anfängliche LPS-Dosiskurve durchzuführen, da verschiedene LPS-Bestände unterschiedliche Potenzen haben können. Wir haben festgestellt, dass unsere neonatalen Ergebnisse von der Dosis von LPS abhängen, die zur Induktion von FEMI verwendet wird.