Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

Dieses Protokoll enthält eine neuartige chemische Strategie zur Anhängung von therapeutischen Peptiden an metallische Oberflächen und hat das Potenzial, die Biokompatibilität einer vielzahl von metallischen Biomaterialien zu verbessern. Dies ist eine universelle und robuste Technik, um Peptide und therapeutische Proteine an die nackten Metalloberflächen von Bioimplantaten anzuhängen. Wir haben diese Technologie verwendet, um die Biokompatibilität von metallischen Stents durch anhängen CD47 Peptide zu verbessern, um die Entzündungsreaktionen zu verhindern, die durch Stenting ausgelöst werden.

Beginnen Sie mit dem Waschen der Edelstahlfolien-Coupons oder Mesh-Scheiben mit 2-Isopropanol in einem Shaker für fünf Minuten. Führen Sie diese Wäsche zweimal, dann waschen Sie die Proben zweimal mit Chloroform für 10 Minuten pro Wäsche. Die gereinigten Edelstahlproben 30 Minuten lang in einen Ofen bei 220 Grad Celsius stellen.

Die gebackenen Folien oder Netzscheiben in 0,5% wässrige Lösung von PABT eintauchen und eine Stunde lang in einem Shaker bebrüten. Waschen Sie die PABT-modifizierten Proben fünfmal mit entionisiertem destilliertem Wasser. Die Proben in eine neue Durchstechflasche übertragen und die Wässer wiederholen.

Behandeln Sie die Proben mit TCEP 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Shaker. Degas enstilliertes destilliertes Wasser in einem runden Bodenkolben mit einer Vakuumerzeugungsvorrichtung, wie z. B. einem Lyophilisator, und waschen Sie die Folien oder Netzscheiben fünfmal mit dem entgasten Wasser. Übertragen Sie die Proben in eine neue Durchstechflasche und wiederholen Sie die Wähdaten.

Bereiten Sie fünf Milliliter 1%PEI-PDT-Lösung vor, indem Sie 212,5 Mikroliter des Lagers PEI-PDT und 125 Mikroliter 0,4 Molnatriumacetat im entgasten Wasser verdünnen. Inkubieren Sie die gewaschenen Edelstahlproben mit 1%PEI-PDT. Ersetzen Sie Luft durch Argongas, versiegeln Sie die Fläschchen luftdicht und mischen Sie sie eine Stunde lang auf einem Shaker.

Gehen Sie sofort mit der Peptidkonjugation vor oder lagern Sie die Proben bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie ein Milligramm pro Milliliter humanes Peptid CD47 Vorrat Lösung durch Auflösen humanes Peptid CD47 Pulver in entgaste 50%essigsäure, dann bereiten Sie die Arbeitslösung durch Auflösen 500 Mikroliter des Bestands in 4,5 Milliliter entgasten PBS. Die gewaschenen PEI-PDT-beschichteten Proben mit der Arbeitslösung von Peptid CD47 bei Raumtemperatur mit Schütteln für eine Stunde inkubieren.

Waschen Sie nach Fertigstellung die Peptid-CD47-beschichteten Proben, wie im Textmanuskript beschrieben. Nach der Beschichtung der Metallfolien mit Peptid CD47 oder Rührpeptid, Viertelzoll-PVC-Rohre in drei 38 Zentimeter lange Stücke schneiden und bis zu acht unveränderte, verglaste Peptid- oder Peptid-CD47-modifizierte Metallfolien in drei verschiedene Röhren einsetzen. Sammeln Sie 30 Milliliter Blut von gesunden menschlichen Spendern frei von Anti-Thrombozyten-Medikamente, Vorbelastung der Spritze mit einem Milliliter 4%Natriumcitrat, um die Gerinnung des gesammelten Blutes zu verhindern.

Legen Sie 10 Milliliter Blut in jede Röhre mit einer 10-Milliliter-Spritze und verbinden Sie die Enden mit Metalladaptern. Legen Sie die blutgefüllten Schläuche auf die Räder des Chandler-Schlaufesgeräts und leiten Sie das Blut vier Stunden lang durch Raddrehung bei 37 Grad Celsius an den Metallfolien vorbei. Das Blut aus den Röhrchen abtropfen lassen und gemäß den IRB-Anforderungen entsorgen, dann die Schläuche mit einem Skalpell schneiden, um die Folien zu holen.

Bereiten Sie 2%glutaraldehydlösung vor, indem Sie die 70%-Lösung im Natriumkakodilatpuffer mit 0,1 Mol-Natriumchlorid verdünnen. Die Folien in der 2%glutaraldehyd-Lösung 15 Minuten lang inkubieren und bei vier Grad Celsius über Nacht lagern. Bevor Sie die Metallfolien analysieren, waschen Sie sie dreimal mit PBS.

Acht Milliliter PBS in einem 37 Grad Celsius Wasserbad erwärmen. Bereiten Sie 10 Millimolar CFDA Farbstoff-Stock-Lösung durch Hinzufügen von 90 Mikroliter DMSO zu einer CFDA-Flasche, dann bereiten Sie die Arbeitslösung durch Zugabe von 75 Mikroliter des Lagers CFDA zu den warmen PBS. Invertieren Sie das Rohr ein paar Mal, um es zu mischen und mit Aluminiumfolie zu bedecken.

Legen Sie jede Folie in einen Milliliter CFDA-Farbstoff in eine 24-Well-Platte. Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und bebrüten Sie die Platte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, waschen Sie die Folien dann dreimal in PBS und stellen Sie sie mit einem Fluoreszenzmikroskop ab. Die Konzentration des kovalent gebundenen TAMRA-konjugierten Peptids CD47 wurde quantifiziert, um die maximale Immobilisierungsdichte des Peptids auf der Metalloberfläche zu bestimmen.

Die maximale Peptidretention betrug ca. 180 Nanogramm pro Zentimeter im Quadrat, was mit einer Eingangskonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter erreicht wurde. Die Immobilisierung des tAMRA konjugierten Peptids CD47 auf den modifizierten Metalloberflächen wurde durch die Fluoreszenzmikroskopie weiter bestätigt, die eine gleichmäßige Fluoreszenz zeigte, die von der Oberfläche der mit TAMRA konjugierten Peptid-CD47-behandelten Netzscheiben emittiert wurde. Nur minimale Fluoreszenz wurde auf der Oberfläche der Kontrollnetze nachgewiesen, denen die Änderung fehlte, wodurch ein nicht spezifisch gebundenes TAMRA-konjugiertes Peptid CD47 als Hauptquelle der Fluoreszenz ausgeschlossen wurde.

Es wurde auch bestätigt, dass die Peptid CD47-beschichteten Oberflächen eine drastische Verringerung der blutübertragenen Zellanhaftung im Vergleich zu den rührmodifizierten und unveränderten Peptidkontrollen aufweisen. Monozyten, die aus rattenbuffy Coat-Zellen isoliert wurden, wurden auf blankem Metall und Peptid CD47-modifizierten Edelstahlfolien kultiviert. Eine 58%ige Dämpfung der akuten Monozytenanhaftung, ihre Umwandlung in Makrophagen und die Proliferation von Makrophagen wurde auf den funktionalisierten Oberflächen beobachtet.

Beim Versuch dieses Protokolls ist es sehr wichtig, die Schritte mit entgastem Wasser oder Reagenzien durchzuführen, die so schnell wie möglich durchgeführt werden müssen, und die Exposition gegenüber Sauerstoff zu minimieren. Unsere Technologie moduliert selektiv die zelluläre Interaktion mit Metalloberflächen und ein typischer Zelltyp-Identifikationstest, wie RT-PCR, Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz, sind mit dieser Technik kompatibel. Wenn diese Technologie für eine Reihe von bioaktiven Peptid entwickelt wurde, kann sie zur Erhöhung der Biokompatibilität an der Gewebematerialschnittstelle beitragen.