Planarian Scrunching als quantitatives Behavioral Readout für Noxious Stimuli Sensing

Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, das planarische Verhalten und die diesem Verhalten zugrunde liegenden sec-Mechanismen zu klären, indem quantitative Verhaltensanalysen mit molekularen und chemischen Störungen kombiniert werden. Diese Technik ist leicht zugänglich für alle Qualifikationsstufen, da sie keine fortschrittlichen Instrumente oder spezielle Software benötigt, um quantitative Verhaltensauslesungen von frei beweglichen Planariern zu erhalten. Scrunching kann verwendet werden, um Ausnahme bei Planariern zu studieren, und dient als empfindlicher Endpunkt für Assay, Störung der Funktion des Nervensystems durch Xenobiotika und Krankheit verursacht.

Beginnen Sie, indem Sie ein dimmbares LED-Panel auf eine flache Oberfläche legen, die einen gleichmäßigen weißen Hintergrund bietet und als einstellbare Lichtquelle verwendet werden kann, um einen angemessenen Kontrast zu erhalten. Legen Sie eine 100-Millimeter-Petrischale-Arena auf das LED-Panel. Montieren Sie eine Kamera auf einem Ringständer über der Arena und passen Sie ihre Position, Höhe und Fokus bei Bedarf so an, dass die gesamte Arena innerhalb des Sichtfeldes zentriert ist und im Fokus steht.

Füllen Sie die Arena mit ca. 25 Millilitern des entsprechenden Belichtungsmediums, um maximale Lautstärke zu haben, schalten Sie das LED-Panel ein und schalten Sie alle anderen Lichtquellen aus, die sich negativ auf die Aufnahmequalität auswirken können. Lassen Sie einen Planarier in der Mitte der Arena mit einer Transferpipette. Übertragen Sie beim Testen einer chemischen Lösung den Planarier mit möglichst wenig planarem Wasser, so dass sich die Konzentration der Chemikalie nicht wesentlich verändert.

Beginnen Sie mit der Aufzeichnung von Daten als Bildsequenzen in einem nativen Fidschi-Format. Zeichnen Sie für Gleitversuche ein bis zwei Minuten Gleitverhalten auf, für Scrunching- oder Peristallistenexperimente, zeichnen Sie lange genug auf, um mindestens drei aufeinander folgende Schwingungen in einer geraden Linie zu erfassen. Beenden Sie die Aufzeichnung, sobald das Experiment abgeschlossen ist.

Wenn der Planarier die Grenze der Arena erreicht, ohne das Beendigungskriterium zu erfüllen, pipette den Planarier zurück in die Mitte der Arena. Öffnen Sie die Unformatbildsequenz für ein Experiment in Fidschi, konvertieren Sie sie in acht Bit und verwenden Sie das Pfeilwerkzeug oder den Schieberegler am unteren Rand des Bildstapels, um durch die Bildsequenz zu schwenken. Um einen Zeitraum und eine Interessenregion zu extrahieren, zeichnen Sie eine Region von Interesse, die den vollständigen Pfad eines Planariers mit dem Rechteckwerkzeug umfasst.

Rechtsklick auf den Bildstapel und wählen Sie Duplikate, aktivieren Sie das Kontrollkästchen, wo doppelte Stapel. Geben Sie den ersten und letzten Frame der Interessensfolge ein und klicken Sie auf "Okay". Für Gleitversuche extrahieren Sie eine Zeit des Gleitens, in der der Planarier mindestens das Doppelte seiner Körperlänge für Scrunching- oder Peristallistenexperimente bewegt.

Extrahieren Sie eine Instanz, wenn der Planarier mindestens drei aufeinander folgende und vollständige Körperschwingungen in einer geraden Linie durchläuft. Wenden Sie einen Schwellenwert auf den duplizierten Bildstapel an, um das Bild zu binarisieren und den Planarier aus dem Hintergrund zu extrahieren, passen Sie die Schiebeleisten so an, dass der gesamte Planarier rot hervorgehoben wird. Die genauen Werte hängen von der Bildqualität ab.

Lassen Sie die Felder für dunklen Hintergrund, Stapel histogramm und setzen Sie den Bereich nicht unaktiviert zurück. Führen Sie einen Bildlauf durch den Bildstapel durch, um einen guten Schwellenwertbereich sicherzustellen, und klicken Sie dann auf Anwenden. Legen Sie im Konvertierungsstapel in das binäre Fenster die Methode auf Standard und den Hintergrund auf light fest.

Deaktivieren Sie alle Kontrollkästchen in diesem Fenster, und klicken Sie dann auf "Okay". Ein binarisiertes Bild mit einem schwarzen Planarier auf weißem Hintergrund wird angezeigt. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Planarier in allen Frames der Bildsequenz sichtbar ist.

Legen Sie Messungen fest, indem Sie auf Analysieren klicken und Messungen festlegen. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen für Fläche, Massemitte, Stapelposition und Passung der Ellipse, und klicken Sie dann auf "Okay". Wählen Sie den offenen Bildstapel aus, und wählen Sie Analysieren und Analysieren von Partikeln aus.

Wählen Sie im Fenster Partikel analysieren die Option Anzeigen und Masken aus, um einen neuen Stapel zu öffnen, der alle Objekte anzeigt, die mit den ausgewählten Parametern erkannt wurden. Legen Sie einen Größenfilter fest, um unerwünschte Geräusche zu entfernen, indem Sie den ungefähren Bereich des Planariers eingeben. Aktivieren Sie dann die Kontrollkästchen, um Ergebnisse anzuzeigen und Ergebnisse zu löschen, und klicken Sie auf "Okay".

Schwenken Sie durch den Maskenbildstapel mit dem Schieberegler am unteren Rand des Panels, um sicherzustellen, dass es kein Rauschen oder Rahmen ohne einen Planarier gibt. Speichern Sie die Daten im Ergebnisfenster mithilfe der Datei und speichern Sie als, fügen Sie dem Dateinamen die CSV-Erweiterung hinzu, um die Daten als durch Kommas getrennte Werte zu speichern. Sobald die Daten für den Image-Stack gespeichert sind, schließen Sie die entsprechenden Bildstapelergebnisse und maskieren Sie Fenster.

Um das Scrunching über die schädliche Temperatur zu induzieren, erhitzen Sie planares Wasser in einem Glasbecher auf 65 Grad Celsius auf einer Heißen Platte. Platzieren Sie einen Planarier in der Mitte der Arena, und warten Sie, bis er sich aufrecht orientiert und beginnt zu gleiten, dann beginnen Sie mit der Aufnahme. Verwenden Sie eine P 200 Pipette, um langsam und konsequent Pipette 100 Mikroliter des vorgeheizten planaren Wassers, Post-Rachen auf das Ende des Planariers zu induzieren.

Beenden Sie die Aufnahme, sobald das Scrunching beendet ist. Legen Sie den Planarier in einen Bergungsbehälter und tauschen Sie die Medien in der Petrischale mit frischem Raumtemperatur planarem Wasser, wenn Sie mehr Experimente durchführen. Um das Scrunching durch Amputation zu induzieren, überträgt einen Planarier in die Mitte der Arena und wartet, bis sich der Planarier aufrecht orientiert und beginnt zu gleiten.

Dann beginnen Sie mit der Aufnahme, amputieren Sie den Planarier mit einer sauberen Rasierklinge. Sicherstellen, dass die Schnittposition experimenteübergreifend konsistent ist. Beenden Sie die Aufnahme, sobald das vordere Stück aufgehört hat zu zerkleinern.

Entfernen Sie beide Teile, legen Sie sie in einen separaten Behälter und lassen Sie sie für sieben Tage regenerieren. Amputierte Planarier können nach ihrer Regenerierten wieder in den Heimcontainer eingegliedert werden. Dieses Protokoll wurde verwendet, um zu testen, ob in der Nähe von UV-Licht-Exposition, induziert Scrunching in S.mediterranea und D.japonica Planarians, während D.japonica Planarians scrunch, wenn in der Nähe von UV-Licht ausgesetzt, S.mediterranea Planarians entweder Schwanz dünner oder keine Reaktion zeigen.

Eine Quantifizierung der Scrunching-Parameter für die D.japonica Planarier, die mindestens drei aufeinander folgende gerade Scrunches aufwiesen, zeigt Eigenschaften, die Parameter für diese Art schrumpfen Im Gegensatz zu 250 mikromolaren Cinnamaldehyd unbekannten TRPA ein Agonist bei Mäusen, verursacht Scrunching und S.mediterranea. Während D.japonica Planarier eine Mischung aus schlangenartiger und oszillatorischer Bewegung zeigen, die durch gleitende oder kräftige Kopfdrehungen unterbrochen wird. Eine Quantifizierung der Proben mit mindestens drei aufeinanderfolgenden Schwingungen ergab für drei von vier Parametern deutlich niedrigere Werte, die für das Scrunching in D.japonica erwartet wurden, was darauf hindeutet, dass die beobachtete Oszillationsbewegung nicht schrumpft.

RNAi bestätigt die Scrunching- und Reaktionsart auf Diebamaldehyd-Exposition in S.mediterranea. Innerhalb von 180 Sekunden nach der Exposition in planarem Wasser, alle Kontrolle RNAi planarian scrunched. Im Vergleich zu keinem der SMTRPA ein RNAi Planarians zeigt, dass S.mediterranea Scrunching in Cinnamaldehyd erfordert SMTRPA ein.

Es ist wichtig, konsistent zu sein und wie die Tiere manipuliert werden, um Lärm zu reduzieren und die Reproduzierbarkeit bei den Verhaltensmessungen zu gewährleisten. Diese Projekte können um eine Analyse der Körperform erweitert werden, die die Identifizierung und Quantifizierung anderer planarischer Verhaltensweisen ermöglicht, die hier nicht erfasst werden.