小鼠肾-居民^CD8+T 细胞的分离，用于流细胞测量分析

CD8+T细胞在不同的组织中具有独特的特征，是非粘膜和非淋巴组织的关键例子。要充分了解T细胞生物学，必须直接描述肾居民细胞的特征。在这里，我们将演示我们分离肾居民CD8+T细胞的方便方法，以容纳随后的流动细胞学分析。

这种方法可以深入了解感染后产生的效应器和记忆CD8+T细胞的研究以及自身免疫反应。手术将由我实验室的研究科学家马超宇博士进行。首先将生物素抗CD8 alpha抗体稀释至PBS中每毫升15微克，确保每只小鼠有足够的200微升。

注射前，用架空热灯加热小鼠的尾静脉 5 到 10 分钟，以扩张。将200微升的预稀释抗体混合物抽入28量胰岛素注射器中，通过上下移动活塞去除任何气泡。弯曲针头，在针头和注射器之间形成150度角，斜向上，使针头平行于尾静脉。

用啮齿动物抑制鼠标，用70%乙醇喷洒尾巴，使静脉清晰可见。用非显性手的拇指和中指将尾巴放在端端，然后将食指放在注射部位下方。用主导性手将针头平行插入静脉，向心脏方向插入，并缓慢注射200微升抗体。

取出针头并轻轻压缩注射部位，直到出血停止。对鼠标进行安乐死后，用剪刀解剖肾脏，将其转移到1.5毫升的微型离心管中。将样品留在冰上，直到进一步处理。

在每个井中用三毫升的消化液准备六孔板，每只鼠标使用一孔，并将其储存在冰上。在每个样品管中加入300微升的消化液，用直弹簧剪刀将肾脏样品切碎。使用消化液将切碎的肾脏样本转移到六孔板。

在37摄氏度下用轻轻摇动孵育样品45分钟，然后用三毫升注射器的柱塞法兰使组织均匀化，然后转移到15毫升锥形管中。将样品在 500 倍 g 和 4 摄氏度下旋转 5 分钟。取出上一提液，用10%FCS将颗粒重新用三毫升的RPMI中重新暂停。

在 500 倍 g 和 4 摄氏度下旋转样品 5 分钟，然后取出上总因物，然后用 5 毫升 44% 密度梯度介质和 RPMI 混合物重新填充细胞颗粒。将含有三毫升67%密度梯度介质和PBS的三毫升移液器的尖端直接放在每个管的底部，然后慢慢释放溶液，使重溶液在底部形成一个独特的层。在减少油门和制动设置的情况下，以 900 次 g 旋转样品 20 分钟，然后小心地将管子从离心机中拆下，而不会干扰层。

在不接触淋巴细胞层的情况下，用转移移液器去除顶层，将淋巴细胞层转移到新的 15 毫升管中。用 PBS 和 5%FCS 填充管子，然后缓慢反转管四到六次。在 500 倍 G 和 4 摄氏度下离心样品 5 分钟后，取出上经剂，用 500 微升完整的 RPMI 介质重新暂停细胞颗粒。

细胞现在已准备好流动细胞测量染色。即使在密度离心-中继淋巴细胞富集之后，在最终产品中看到大部分非淋巴细胞也是很常见的。然而，在获得活淋巴细胞后，CD8+T淋巴细胞很容易识别。

正如预期的那样，只有血管外CD8+T细胞有效获得组织驻留记忆T细胞表型，如CD69的上调节和Ly6C的降低调节。与受感染的小鼠相比，从位于SPF设施的年轻天真小鼠身上分离出的绝大多数CD8+T细胞都标有CD8α抗体，因此属于血管内。这项技术大大加快了对密集血管器官组织居民免疫细胞的培养。