Name: Silizium-Nanodrähte und optische Stimulation für Untersuchungen der intra- und interzellulären elektrischen Kopplung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Erfahren Sie die optische Bio-Modulation von Zellen mit Silizium-Nanodrähten für präzise intrazelluläre Stimulation. Diese Methode ermöglicht hochauflösende bioelektrische Untersuchungen von Herzzellen und Gehirnzellen in vitro sowie in 3D-Ex-vivo-Geweben.

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Diese Arbeit wird vom Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503) unterstützt.

Um die Einhaltung ethischer Standards zu gewährleisten, wurden alle tiertierischen Verfahren im Zusammenhang mit der Isolierung von Kardiomyozyten aus Nagetierherzen zuerst vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Chicago genehmigt. Darüber hinaus wurden alle Tierversuche in vollständiger Übereinstimmung mit Anleitung der University of Chicago IACUC durchgeführt.
1. Herstellung von Zell-SiNWs-Hybriden
<ol><li>Isolieren Sie primäre Kardiomyozyten (CMs) mit einem kommerziellen Kit nach den Richtlinien des Herstellers.</li>
	<li>Bereiten Sie komplettes DMEM für die primäre Zellisolation vor, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 1% L-Glutamin.</li>
	<li>Um Myofibroblast (MFs) von der MFs-CMs Suspension zu isolieren, die isolierten Zellen auf eine Gewebekulturschale (Zellen isoliert von 2 Herzen ab Schritt 1.1. pro 100 mm Schale) für 1 h vorzublenden. Da CMs eine Fibronectin- oder Kollagen-behandelte Oberfläche benötigen, um haften zu können, werden nur MFs an der Gewebekulturoberfläche befestigt.</li>
	<li>Aspirieren Sie die angereicherte CMs-Zellsuspension. Diese CMs können für heterozelluläre Kopplungsexperimente verwendet werden, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Spülen Sie die MFs mit DMEM, um alle verbleibenden CMs aus dem MFs-Gericht zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie den MFs ein frisches Kulturmedium hinzu und lassen Sie sie sich vermehren, bis sie zu 80 % (2-4 Tage) konfluent sind. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag.</li>
	<li>Wenn die Zellen bereit sind (80% konfluent), bereiten Sie SiNWs für den hybridisierenden Schritt unten vor (Schritt 1.7). HINWEIS: Viele Arten von SiNWs können dafür verwendet werden. In diesem Experiment wurden SiNWs verwendet, die durch chemische Dampfabscheidung (CVD) mit einer Core-Shell p-i-n-Knotenkonfiguration angebaut wurden, wie zuvorbeschrieben 16. Während des CVD-Wachstums werden die SiNWs auf einem Siliziumwafersubstrat angebaut und schließlich als Siliziumchips mit SiNWs abgedeckt.</li>
	<li>Schneiden Sie einen 3 mm x 3 mm Chip aus einem Wafer mit CVD gewachsenen SiNWs mit einem Diamantschreiber. Verwenden Sie scharfe Zangen, um den Wafer zu behandeln und die Oberfläche zu minimieren, die mit den Zangen berührt wird, da dies die SiNWs brechen kann.</li>
	<li>Sterilisieren Sie den Chip, indem Sie ihn mit 70% Ethanol spülen und das Ethanol 30 min unter UV-Licht in einer biosafety laminaren Durchflusshaube trocknen lassen.</li>
	<li>Übertragen Sie den Chip in ein steriles Mikrozentrifugenrohr und spülen Sie überschüssiges Ethanol mit vollständigen Kulturmedien.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Kulturmedien hinzu und beschallen Sie den Chip im Beschallungsbad für 1-10 min. Die Medien sollten trüb werden, wenn SiNWs in die Medien veröffentlicht werden. HINWEIS: Beschallungszeit und -leistung sollten für verschiedene Beschallungsgeräte oder verschiedene Zellen optimiert werden, da kürzere Dauern und geringere Kräfte längere SiNWs ergeben.</li>
	<li>Fügen Sie die SiNWs Suspension in 5 ml Kulturmedien ein und säen Sie sie mit MFs auf die 100 mm Gewebekulturschale. Lassen Sie die SiNWs 4 h verinnerlichen und spülen Sie die überschüssigen SiNWs mit Medien 5x ab. Erlauben Sie teilweise internalisierten SiNWs, die Internalisierung abzuschließen, indem sie vor der Verwendung weitere 1 H sitzen. HINWEIS: Verschiedene Zelltypen können unterschiedliche SiNWs-Konzentration und/oder Verinnerungszeiten erfordern.</li>
	<li>Bereiten Sie Kollagen-Beschichtungslösung durch Verdünnen von Kollagen-Stammlösung (3 mg/ml) mit steriler 20 mM Essigsäure im Verhältnis 1:50 vor. 0,5 ml Beschichtungslösung zu einer 35 mm Glasbodenschale geben und 1 h in 37 °C sitzen lassen. Entfernen Sie die Lösung und spülen Sie die Schale mit sterilem PBS.</li>
	<li>Ernte der Zell-SiNWs-Hybriden, indem Sie die Zellen mit 3 ml Trypsin für 2 min bei 37 °C behandeln. Fügen Sie 10 ml Kulturmedien hinzu und spülen Sie die Hybriden kräftig durch Pipettieren. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min vorsichtig bei 200 x g, um eine Beschädigung der Zellen mit den internalisierten SiNWs zu vermeiden. Entfernen Sie überschüssige Medien, suspendieren Sie Zellen mit 1 ml Medien und säen Sie sie auf die kollagen behandelte Glasbodenschale. HINWEIS: Die Hybriden können allein gesät werden, um die intrazelluläre oder interzelluläre Kopplung zu untersuchen, oder mit CMs, um die heterozelluläre Kopplung in vitro zu untersuchen.</li>
	<li>Führen Sie eine abschließende Überprüfung der SiNW-Internalisierung durch, indem Sie das Cytosol (Calcein-AM, 4 M) und die Membran (Membranmarker, 2 m) 30 min bei 37 °C beschriften und die Zelle mittels konfokaler Mikroskopie abbilden. Da SiNWs stark reflektierend sind, kann reflektiertes Licht anstelle von Fluoreszenz verwendet werden, um sie zu visualisieren.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Zellen für intra- und interzelluläre Untersuchungen
<ol><li>Vorbereiten der Kollagenbeschichtungslösung wie in 1.12</li>
	<li>Für die intrazelluläre elektrische Stimulation, Kultur-Hybriden mit geringer Sädichte. Verwenden Sie ein Standardhämozytometer, um Zellen aus Abschnitt 1.11 zu zählen. und Säen Sie 50.000 Zellen auf einer 35 mm Glasbodenschale in Kulturmedien. Für interzelluläre Untersuchungen verwenden Sie höhere Zelldichten (500.000 Zellen pro Schale). Für die interzelluläre Kopplung zwischen CMs und MFs werden die Hybriden mit frisch isolierten CMs kokulturiert.</li>
	<li>Lassen Sie Zellen über Nacht anbringen, bevor Sie optische Stimulationsexperimente durchführen. Für interzelluläre Untersuchungen 48 h bei 37 °C für die Zellen erlauben, interzelluläre Spaltverbindungen auszudrücken, bevor das Experiment durchgeführt wird.</li>
	<li>Bereiten Sie kalziumempfindliche Farbstoff-Lösung (kann in -20 °C gehalten werden) durch Zugabe von 50 l DMSO zu 50 g Fluo-4 AM. Bereiten Sie die Färbelösung vor, indem Sie 1 l Farbstoff in 1 ml DMEM verdünnen.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Zellen und fügen Sie 1 ml Färbelösung hinzu. Farbstoff 20-30 min bei 37 °C in Zellen verinnerlichen lassen. Den Farbstoff ansaugen und zweimal mit sterilem PBS abspülen.</li>
	<li>Schließlich 1 ml vorgewärmtphenolrot-freie DMEM Media hinzufügen und die intrazelluläre Fluo-4 für 30 min bei 37 °C entestert werden lassen.</li>
	<li>Übertragen Sie Zellen zum Mikroskop zur Bildgebung und Stimulation.</li>
</ol>3. Optische Bildgebung und Stimulation
<ol><li>Vorheizen eines befeuchteten Mikroinkubators auf 37 °C und Blasenluft-CO2-Gemisch (95:5).</li>
	<li>Verwenden Sie ein Mikroskop mit einer kollimierten Laserlinie, die in den Lichtpfad für die Kalzium-Bildgebung und optische Stimulation gekoppelt ist. HINWEIS: Ein Raster-Konfokalmikroskop ist aufgrund seiner Punktstimulationsfähigkeiten die einfachste Option. Dieses Verfahren kann jedoch mit jedem Standardfloreszenzmikroskop durchgeführt werden, indem ein kollimierter Laserstrahl mit einem Strahlsplitter in den unendlichen Raum des Lichtpfades gekoppelt wird. Jedes Mikroskopobjektiv ist so konzipiert, dass ein kollimierter Laser, der durch ihn geleitet wird, auf einen beugungsbegrenzten Laserfleck an der Brennebene fokussiert wird. Die Laserwellenlänge sollte in der Nähe des Anregungslichts sein, so dass sie vom dichroitischen Spiegel reflektiert und vom Anregungsfilter übergeben wird.</li>
	<li>Visualisieren Sie die SiNWs und bestimmen Sie die Stimulationsstelle mithilfe von Hellfeldmikroskopie, durchlichtem Licht oder reflektierendem Licht. Konfigurieren Sie dann den Lichtpfad in den Fluoreszenzmodus, während Sie den Stimulationspunkt an der vordefinierten Position des SiNW beibehalten.</li>
	<li>Validieren Sie die optimale Stimulationsleistung und Pulslänge für jede SiNW-Größe und jeden Zelltyp, um photothermische Schäden an stimulierten Zellen zu minimieren. Führen Sie für ein typisches Stimulationsprotokoll eine 2-10 s Baseline-Aufzeichnung der intrazellulären Calciumaktivität durch. Wenden Sie dann einen einzelnen Laserpuls von 1-10 mW Leistung und 1-10 ms Dauer (entsprechend 30-300 kW/mm2) an, um den SiNW zu stimulieren, und zeichnen Sie die resultierende Kalziumwelle für weitere 2-10 s auf. HINWEIS: Es ist wichtig, die optische Leistung und Pulslänge für jede SiNW-Größe und -Zellen zu optimieren. Dies ist notwendig, um photothermische Schäden an den stimulierten Zellen zu minimieren.</li>
	<li>Übertragen Sie ggf. die aufgenommenen Filme der optischen Stimulation zur weiteren Analyse.</li>
</ol>4. Videoverarbeitung
<ol><li>Visualisieren Sie Änderungen der Fluo-4-Fluoreszenz mithilfe desfür ImageJ18verfügbaren Makros "dF über F", das die Änderung der Fluoreszenzanzahl für jedes Pixel berechnet und durch den Durchschnittswert der Ruhebasislinie normalisiert. Konvertieren Sie die Ausgabe (Gleitkommaformat) zur weiteren Verarbeitung in 8 Bit.</li>
	<li>Verarbeiten Sie den dF/F-Film weiter mit dem selektiven Medianfilter "Ausreißerentfernen ", der in ImageJ verfügbar ist. Definieren Sie Parameter, um Pixel zu entfernen, deren Wert mehr als 10 über dem Medianwert in einem Radius von 2 Pixeln liegt, und ersetzen Sie diesen Pixelwert durch den Median.</li>
	<li>Berechnen Sie den optischen Fluss in jedem Frame über den Lucas-Kanade-Algorithmus, wie er in der Matlab Computer Vision Toolbox implementiert ist. Die Ausgabe dieser Funktion war ein Vektorfeld, das die x- und y-Komponenten des optischen Flusses an jedem Punkt in jedem Bild enthielt (Code ist in Der Zusatzdatei 1verfügbar). ANMERKUNG: Der mittlere optische Fluss innerhalb einer Zelle, <->, entspricht der Entwicklung des Kalziumflusses innerhalb einer Zelle. Das Differential des optischen Flusses, s<> liefert den Zeitpunkt, an dem die Calciumsignalisierung aktiviert wurde, indem ermittelt wird, wo das Signal maximiert wurde. Darüber hinaus korreliert die maximale Größe von s<> mit der Geschwindigkeit, mit der die Kalziumwellenfront durch die Zelle fortschreitet.</li>
	<li>Berechnen Sie die interzelluläre Geschwindigkeit der Kalziumübertragung gemäß der folgenden Gleichung. vCa2+ = rij / ( tmax,j wobei tmax,j und tmax,i die Zeiten der Aktivierung für die Zellen j bzw. i sind, und rij ist der Abstand zwischen den Schwerpunkten der Zellen.</li>
</ol>

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<li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir haben hier eine einfache Möglichkeit zur intrazellulären elektrischen Stimulation von Zellen demonstriert. In dieser Demo haben wir MFs verwendet, die mit SiNWs vorhybridisiert und dann mit CMs kokultiviert wurden. Im Allgemeinen haben die meisten sich vermehrenden Zellen die Tendenz, SiNWs zu internalisieren, was die Verwendung dieser Methode mit vielen anderen Zelltypen ermöglicht. Darüber hinaus haben wir zwar die intrazelluläre Stimulation von Zellen demonstriert, aber die gleichen Prinzipien können verwendet wer...

Alle biologischen Organismen nutzen Elektrizität in Form von Ionen, um das zelluläre Verhalten zu regulieren. Zellmembranen enthalten verschiedene Arten spezifischer Ionenkanäle, die den passiven und aktiven Transport von Ionen ermöglichen. Diese Ionen steuern die Funktionen von erregbaren Zellen, wie neuronale Aktivität und Skelett und Herzmuskelkontraktilität. Jedoch, Bioelektrizität spielt auch eine wichtige Rolle in nicht-erregbaren Zellen, die viele zelluläre Funktionen wie Zellproliferation1,Neuroimmunität2,3,4und Stammzelldifferenzierung5.
In den letzten Jahrzehnten hat der Bereich der Bioelektrizität ein wachsendes Interesse geweckt, was zur Entwicklung zahlreicher Technologien für bioelektronische Schnittstellen beigetragen hat. Mikroelektroden-Patchpipetten sind der Goldstandard der intrazellulären Aufzeichnung und Stimulation6. Bei dieser Methode wird eine Glaspipette unter bestimmten Bedingungen gezogen, um eine scharfe Kante mit einer Porengröße von wenigen Mikrometern zu bilden. Diese Pipette ist mit einem Puffer gefüllt und die Pipette ermöglicht den direkten Kontakt des Puffers mit dem intrazellulären Volumen. Daraus ergibt sich eine bioelektrische Schnittstelle, die extrem hohe Signal-Rausch-Verhältnisse, eine präzise Steuerung der zellulären elektrischen Aktivität und eine extrem hohe zeitliche Auflösung liefert. Obwohl diese Methode ein extrem leistungsfähiges Werkzeug ist, das vor kurzem auf eine Nanopipettenkonfiguration7herunterskaliert wurde, ist es mit mehreren wichtigen technischen Einschränkungen verbunden. Der Zytosolverdünnungseffekt8sowie mechanische Vibrationen beschränkt seinen Nutzen auf kurzfristige Verhöre und erfordert teure Spezialausrüstung und ein hohes Maß an technischem Geschick. Darüber hinaus begrenzt seine Sperrigkeit die Anzahl der Zellen, die gleichzeitig aufgezeichnet oder stimuliert werden können, und aufgrund seiner Invasivität kann es während eines Experiments nicht neu konfiguriert werden. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Mikroelektroden-Arrays entwickelt, aber die Größe der Elektroden begrenzt die räumliche Auflösung sowie den intrazellulären Zugang. Nanoelektroden-Arrays ermöglichen intrazelluläre Aufzeichnung und Stimulation, erfordern aber eine abrasive Elektroporation, um auf das Zytosol9,10zugreifen zu können. Darüber hinaus sind alle diese Methoden substratgebunden und daher auf In-vitro-Zellkulturen oder auf externe oberflächliche Zellen beschränkt, ohne Zugang zu Zellen, die sich in einem dreidimensionalen (3D) Gewebe befinden.
Optogenetik11 ist weit verbreitet, um diese 3D- und In-vivo-Beschränkungen zu beheben. Optogenetische Methoden basieren jedoch auf den Störungen von lichtaktivierten Plasmamembran-Ionenkanälen, die an der Plasmamembran verteilt werden, wodurch die räumliche 3D-Auflösung12 und intrazelluläre Fähigkeiten begrenzt werden.
Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Silizium-Nanodrähte (SiNWs) verwendet werden können, um intrazelluläre bioelektrische Verhöre mit submikronräumlicher Auflösung mit verschiedenen nicht erregbaren Zellen durchzuführen, nämlich Herzmyofibroblasten und Oligodendrozyten13. Darüber hinaus verwendeten wir diese SiNWs, um ex-vivo zellspezifische Verhöre innerhalb eines 3D-Herzgewebes durchzuführen, um zu untersuchen, wie Herzzellen in vivo14elektrisch koppeln. Ein großer Vorteil dieser Methode ist ihre Einfachheit; es erfordert keine genetische Veränderung oder sperrige Instrumentierung. Viele Zellen verinnerlichen spontan fotoresponsive SiNWs ohne Beschallung oder Elektroporation15. Darüber hinaus entfliehen sie spontan der endosomalen Verkapselung und bilden eine nahtlose Integration mit den Zytosolen und intrazellulären Organellen13,15. Diese Zell-SiNWs-Verbundwerkstoffe, sogenannte Zell-Silizium-Hybride, besitzen die dynamische, weiche und vielseitige Natur der ursprünglichen Zelle sowie die optoelektrischen Fähigkeiten der SiNWs. Nach der Hybridisierung kann der Zell-SiNW-Hybrid mit Standard-Gewebekulturtechniken geerntet und für verschiedene Anwendungen wie intrazelluläre bioelektrische Stimulation verwendet werden; Untersuchung der interzellulären bioelektrischen Kopplung in vitro; und für in vivo zellspezifische Verhöre. Da eine effektive Stimulation eine Kolokalisierung von hohen optischen Leistungsdichten und SiNWs erfordert, kann man sowohl in 2D als auch in 3D eine hohe räumliche Auflösung erzielen. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die Methodik sowie wie die Ergebnisse analysiert werden können. Der Schwerpunkt liegt auf der intra- und interzellulären Untersuchung in vitro, aber die in vivo Umsetzung dieser Methode kann direkt für viele andere biologische Szenarien genutzt werden.

<table><tbody><tr><td>35 mm Glasbodenschalen</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr><tr><td>3i Marianas Spinning Disk Confocal</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Orange Plasmamembran Stain</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, Rattenschwanz</td><td>Gibco</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Deluxe Diamond Scribing Pen</td><td>Ted Pella</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat, kein Glutamin</td><td>Gibco</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, wasserfreies</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Standard Gewebekulturschalen</td><td>Falcon</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, zertifiziert, hitzeinaktiviert,</td> <td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin Menschliches Protein, Plasma</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 112xx Serie Erweiterter Ultraschallreiniger</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB11201</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, zelldurchlässig</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM Medien</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>OKO volle Klimakontrollkammer (konstant Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO2)</td><td>OKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Primary Cardiomycyte Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>88281</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

silizium-nanodrähte und optische stimulation für untersuchungen der intra- und interzellulären elektrischen kopplung

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Myofibroblasten können spontan Silizium-Nanodrähte (SiNWs) verinnerlichen und sind damit ein attraktives Ziel für bioelektronische Anwendungen. Diese Zell-Silizium-Hybride bieten bleifreie optische Modulationsfunktionen mit minimaler Störung des normalen Zellverhaltens. Die optischen Fähigkeiten werden durch die photothermischen und photoelektrischen Eigenschaften von SiNWs ermittelt. Diese Hybriden können mit Standard-Gewebekulturtechniken geerntet und dann auf verschiedene biologische Szenarien angewendet werden. Wir zeigen hier, wie diese Hybriden verwendet werden können, um die elektrische Kopplung von Herzzellen zu untersuchen und zu vergleichen, wie Myofibroblasten miteinander oder mit Kardiomyozyten verzahnt werden. Dieser Prozess kann ohne spezielle Ausrüstung jenseits eines Fluoreszenzmikroskops mit gekoppelter Laserlinie durchgeführt werden. Gezeigt wird auch die Verwendung einer maßgeschneiderten MATLAB-Routine, die die Quantifizierung der Kalziumvermehrung innerhalb und zwischen den verschiedenen Zellen in der Kultur ermöglicht. Myofibroblasten haben nachweislich eine langsamere elektrische Reaktion als Kardiomyozyten. Darüber hinaus zeigt die myofibroblast-interzelluläre Ausbreitung etwas langsamere, wenn auch vergleichbare Geschwindigkeiten mit ihren intrazellulären Geschwindigkeiten, was auf eine passive Ausbreitung durch Spaltknoten oder Nanoröhren hindeutet. Diese Technik ist sehr anpassungsfähig und kann leicht auf andere zelluläre Arenen angewendet werden, sowohl für In-vitro-, als auch in vivo- oder ex vivo-Untersuchungen.

Die Fähigkeit dieser Methode, einen direkten Zugang zum intrazellulären Zytosol zu ermöglichen, hängt von der spontanen Internalisierung des SiNW in die Zellen ab. Obwohl SiNWs einer spontanen Internalisierung in viele Zelltypen15unterzogen werden, werden einige Zellen, wie Kardiomyozyten und Neuronen, die SiNWs benötigen, um ihre Internalisierung zu ermöglichen19. In diesem Protokoll beschreiben wir den Internalisierungsprozess von p-i-n SiNWs mit 200-300 nm Durchmesser un...

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Silizium-Nanodrähten für die intrazelluläre optische Biomodulation von Zellen in einer einfachen und einfach durchzuführenden Methode. Die Technik ist sehr anpassungsfähig an verschiedene Zelltypen und kann sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Anwendungen eingesetzt werden.

Silizium-Nanodrähte und optische Stimulation für Untersuchungen der intra- und interzellulären elektrischen Kopplung

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Diese Technik ermöglicht intrazelluläre bioelektrische Verhöre mit extrem hoher räumlicher Auflösung und Zellspezifität nur mit standardoptischer Mikroskopie. Diese Methode erleichtert die Stimulation und elektrische Abfrage von Zellen und bestimmten Positionen innerhalb der Zellen und kann sowohl in vitro als auch in 3D-Ex-vivo-Gewebepräparaten durchgeführt werden. Diese Technik ermöglicht die bioelektronische Untersuchung vieler zellulärer Arenen wie Herz- oder Gehirnzellen sowie die elektrische Kommunikation zwischen all unseren nicht erregbaren Zellen.Um Myofibroblasten von einer Myofibroblasten-Kardiomyozytensuspension zu isolieren, verfestigen Sie die isolierten Zellen für eine Stunde auf eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale, da Kardiomyozyten eine fasergebundene und behandelte Oberfläche benötigen, um haften zu können. Am Ende der Inkubation, sammeln Sie die angereicherte Kardiomyozyten mit Überstand für nachgeschaltete Co-Kultur. Spülen Sie die Myofibroblasten mit DMEM, um alle verbleibenden Kardiomyozyten zu beseitigen und die Zellen mit frischem Kulturmedium zu füttern, bevor weitere zwei bis vier Tage inkubiert werden.Wenn die Zellen 80 % Konfluenz erreichen, verwenden Sie einen Diamantschreiber, um einen drei mal drei Millimeter großen Chip aus einem Wafer mit chemischen Dampfabscheidungs-Silizium-Nanodrähten zu schneiden. Und verwenden Sie scharfe Zangen, um die Chips in 70% Ethanol zu spülen. Nach dem Spülen die Chips 30 Minuten unter ultraviolettem Licht in einer biosicherheitslaminiaren Durchflusshaube lufttrocknen, bevor die Chips in ein steriles Mikrozentrifugenrohr übertragen werden.Verwenden Sie ein komplettes Zellkulturmedium Spülen, um alle verbleibenden Ethanol zu entfernen, bevor Sie die Chips in einem Milliliter frischem Kulturmedium in einem Beschallungsbad für ein bis 10 Minuten beschallen. Der Überstand sollte trüb werden, wenn die Nanodrähte freigesetzt werden. Mischen Sie die Silizium-Nanodrahtsuspension in fünf Milliliter frisches Kulturmedium und säen Sie die Nanodrahtlösung auf die Schale von Myofibroblasten.Nach vier Stunden im Zellkultur-Inkubator spülen Sie das Gericht fünfmal mit frischem Kulturmedium ab, um nicht internalisierte Nanodrähte zu entfernen und die Zellen für eine weitere Stunde zu bebrüten, damit alle teilweise verinnerlichten Nanodrähte vollständig integriert werden können. Als nächstes 500 Mikroliter frisch zubereitete Kollagenbeschichtungslösung zu einer 35 Millimeter Glasbodenschale hinzufügen. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 Grad Celsius spülen Sie die Schale mit sterilem PBS ab und ernten sie die Silizium-Nanodraht-Myofibroblast-Hybriden mit drei Milliliter Trypsin zwei Minuten bei 37 Grad Celsius.Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit 10 Milliliter Kulturmedium, spülen Sie kräftig durch Pipettieren und zentrieren Sie nicht über 200 G, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden. Dann die Hybridzellpellets in einem Milliliter frischem Medium wieder aufhängen und die Zellen auf der kollagenbeschichteten Glasbodenschale säen. Um die Verinnerlichung des Nanodrahtes zu überprüfen, beschriften Sie die Zellen gemäß den Standardprotokollen mit fluoreszierendem Zytosol und Membranfarbstoffen, und verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um die Zellen abzubilden.Da Silizium-Nanodrähte stark reflektierend sind, kann reflektiertes Licht anstelle von Fluoreszenz für ihre Visualisierung verwendet werden. Um eine Myofibroblast-Silizium-Nanodraht-Hybrid-Kardiomyozyten-Kokultur einzurichten, säen Sie die entsprechende Anzahl jedes Zelltyps auf eine kollagenbeschichtete Glasbodenschale. Und kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden, damit die Zellen interzelluläre Spaltverbindungen bilden können.Ersetzen Sie am Tag des Experiments den Kulturüberstand durch einen Milliliter Kulturmedium, ergänzt durch frisch zubereiteten kalziumempfindlichen Farbstoff, für eine 20-30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Platte zweimal mit sterilem PBS waschen, bevor Sie die Zellen mit einem Milliliter vorgewärmtem phenolrot-freiem DMEM behandeln. Dann lassen Sie den intrazellulären Kalziumfarbstoff 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius entestert werden, bevor sie Grundbilder aufnehmen.Vor der optischen Bildgebung und Stimulation einen befeuchteten Mikro-Inkubator auf einem Mikroskop mit einer kollimierten Laserlinie, die in den Lichtpfad gekoppelt ist, für die Kalzium-Bildgebung und optische Stimulation auf 37 Grad Celsius und ein 5%Blasen-Ära-Kohlendioxidgemisch vorheizen. Wenn das Mikroskop bereit ist, legen Sie die Myofibroblast-Hybrid-Kardiomyozyten-Kokultur in den Mikro-Inkubator und visualisieren Sie die Nanodrähte durch Hellfeldmikroskopie, um eine geeignete Stimulationsstelle zu lokalisieren. Wenn ein Standort identifiziert wurde, konfigurieren Sie den Lichtpfad in den Fluoreszenzmodus um, wobei Sie den Stimulationspunkt an der vordefinierten Position des Nanodrahtes beibehalten und die optimale Stimulationsleistung und Pulslänge für jede Silizium-Nanodrahtgröße und jeden Zelltyp validieren.Erwerben Sie eine zwei- bis zehnsekunden lange Aufzeichnung der intrazellulären Ausgangsaktivität, bevor Sie den Nanodraht mit einem einzigen Laserpuls von einem bis zehn Melowatt Leistung und einer Dauer von ein bis zehn Millisekunden stimulieren und die resultierende Kalziumwelle für weitere zwei bis zehn Sekunden aufzeichnen. Übertragen Sie am Ende des Experiments die aufgenommenen Filme der optischen Stimulation zur zusätzlichen Analyse an das entsprechende Softwareprogramm. Mit Standardphasenkontrastoptiken lassen sich Konfluenzzellen durch Lichtmikroskopie leicht betrachten.Silizium-Nanodrähte sind jedoch kaum sichtbar, so dass ihre Standorte mit dieser Methode nicht definiert werden können. Die Überlagerung von Licht- und Dunkelfeldbildern ermöglicht jedoch die Visualisierung der Kernanordnung der lichtreflektierenden Silizium-Nanodrähte. Die konfokale Mikroskopie kann verwendet werden, um fluoreszierende Marker-gefärbte Zytosol- und Plasmamembranen zu visualisieren, wodurch die intrazelluläre Position der Silizium-Nanodrähte deutlicher wird.Mit Hilfe der Standardmikroskopie kann ein helles Feldbild erhalten werden, um die Position des zu stimulierenden Silizium-Nanodrahtes zu identifizieren. Ein kurzes Basisvideo der spontan schlagenden Kardiomyozyten und der ruhenden Myofibroblasten kann dann erworben werden. Nach der Stimulation kann die Kalziumausbreitung innerhalb der Kokultur aufgezeichnet werden.Die Zeit, zu der die verschiedenen Zellen angeregt werden, kann durch den Punkt bestimmt werden, an dem die Veränderung des durchschnittlichen optischen Flusses ihr Maximum erreicht. Der optische Fluss kann dann berechnet werden, um bei der Identifizierung des Zeitpunkts der Aktivierung innerhalb jeder Zellregion zu helfen. Die intrazellulären Geschwindigkeiten können für jede Zelle mit Khaimah-Graphen bestimmt werden, wobei die Steigung der Linie die Umkehrung der intrazellulären Ausbreitungsgeschwindigkeit darstellt.Hier kann beispielsweise eine Zusammenfassung der verschiedenen inter- und intrazellulären Geschwindigkeiten beobachtet werden, die für die Zellinteraktionen innerhalb einer einzelnen Kokultur gemessen wurden. Diese Methode kann für In-vivo-Studien verwendet werden, indem die Zell-Silizium-Hybride direkt in das Gewebe injiziert werden und 3D-Ex-vivo-Präparate verwendet werden, um das in vivo elektrische Unternehmen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Protokoll zeigt, wie Spannungs-sensitiven Farbstoffen optische Erfassung der elektrischen Aktivität ermöglichen aus intakten neuronalen Netzen wie dem Plexus des Meerschweinchens enterale Nervensystem, mit einer einstellbaren Auflösung reicht von Einzel-Zellen zu multi-ganglionären Schaltung.

Optische Erfassung der elektrischen Aktivität in Guinea-pig Enteric Networks mit spannungsabhängigen Farbstoffen

Adult-geboren Neuronen exprimiert ChR2 kann in Scheiben elektrophysiologischen Vorbereitungen manipuliert werden, um ihren Beitrag zur Funktion des olfaktorischen neuronale Schaltkreise zu untersuchen.

Mit Affordable LED Arrays für Photo-Stimulation von Neuronen

Wir beschreiben Methoden zur großflächigen Erfassung von mehreren Einzelgeräten und lokalen Bereich Potential in Nagetieren verhalten mit Silizium-Sonden. Antrieb Fertigung, Sonde Befestigung an der Antriebs-und Sonde Implantation Prozesse sind in ausreichender Details für eine einfache Replikation dargestellt.

Großflächige Aufnahme von Neuronen durch Movable Silicon Probes in Behaving Nagetiere

Dieses Video demonstriert die Verwendung eines extrazellulären Matrix-beschichteten Mikrofluidik-Chips zur Unterscheidung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen oder NPCs durch elektrische Stimulation. Nach der Aussaat und dem Anhaften an der beschichteten Region wachsen NPCs, und die Anwendung eines Gleichstroms löst ihre Differenzierung in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten aus.

Elektrostimulationsinduzierte Differenzierung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen

Infrarot Nervenstimulation als Alternative, eine elektrische Stimulation in einem Bereich von Nerven-Typen, einschließlich derjenigen mit auditorischen System zugeordnet vorgeschlagen. Dieses Protokoll wird ein Patch-Clamp-Verfahren zur Untersuchung des Mechanismus der Infrarot Nervenstimulation in einer Kultur von primären auditorischen Nervenzellen.

Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

Dieses Protokoll beschreibt, wie die vorübergehende Erwärmung, die mit der optischen Absorption von Goldnanostäbchen verbunden ist, genutzt werden kann, um die Differenzierung und intrazelluläre Kalziumaktivität in neuronalen Zellen zu stimulieren. Diese Ergebnisse eröffnen möglicherweise neue Anwendungen in neuronalen Prothesen und Grundlagenstudien in den Neurowissenschaften.

Gold-Nanostäbchenunterstützte optische Stimulation von Nervenzellen

Es wird ein Verfahren zur Stimulation der elektrischen Aktivität von in-vitro-Zellkulturen mit sichtbarem Licht beschrieben, das auf der Verwendung organischer halbleitender Polymere basiert.

Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Neuronale Kulturen sind ein gutes Modell für die Untersuchung Schwellen Hirnstimulation Techniken über ihre Wirkung auf die einzelnen Neuronen oder einer Population von Neuronen. Dargestellt hier sind verschiedene Verfahren zur Stimulation von gemusterten neuronalen Kulturen durch ein elektrisches Feld erzeugt wird direkt durch Badelektroden oder induziert durch ein zeitlich veränderliches Magnetfeld.

Externe Anregung von Neuronen mittels elektrische und magnetische Felder in One- und Zweidimensionale Kulturen

Hier stellen wir das Herstellungsverfahren eines Optrode-Systems mit optischen Fasern für die Lichtabgabe und einem Elektrodenarray für die neuronale Aufzeichnung vor. In-vivo-Experimente mit transgenen Mäusen, die Kanalrhodopsin-2 exprimieren, zeigen die Machbarkeit des Systems für die gleichzeitige optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung.

Optroden-Array zur simultanen optogenetischen Modulation und elektrischen neuronalen Aufzeichnung

Die Steuerung von Herzzellen und -gewebe mit Licht ermöglicht eine berührungslose Stimulation, wodurch der natürliche Zustand und die Funktion der Zellen erhalten bleiben, was sie zu einem wertvollen Ansatz sowohl für die Grundlagenforschung als auch für therapeutische Anwendungen macht.

Ein kardiales mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Ca2+ -Ausbreitung durch nicht-genetische optische Stimulation

Dieses Protokoll beschreibt fortschrittliche Materialherstellungs- und ex vivo-Methoden am Rattenherzen für optische und elektrische bidirektionale Bioschnittstellen, die eine präzise Herzstimulation, Aufzeichnung und Infarktmodellierung für die bioelektronische Forschung ermöglichen.

Bidirektionale elektrische und optoelektronische Grenzflächen in gesunden und ischämischen ex vivo Rattenherzen

Erfahren Sie die optische Bio-Modulation von Zellen mit Silizium-Nanodrähten für präzise intrazelluläre Stimulation. Diese Methode ermöglicht hochauflösende bioelektrische Untersuchungen von Herzzellen und Gehirnzellen in vitro sowie in 3D-Ex-vivo-Geweben.

Silizium-Nanodrähte und optische Stimulation für Untersuchungen der intra- und interzellulären elektrischen Kopplung

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