Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen

Unser Protokoll verbindet eine zugängliche Methode zur Aufbereitung von Tesaglitazar-beladenen Liposomen mit einem gründlichen Ansatz zur Beurteilung der Liposomenaufnahme auf zellulärer Ebene. Diese Technik bietet eine unvoreingenommene Methode zur Beurteilung der Aufnahme von fluoreszenzmarkierten Liposomen, die bei niedrigen Temperaturen und mit leicht zu beschaffenden Geräten hergestellt werden. Um fluoreszenzmarkierte Liposomen herzustellen, die mit Calciumacetat und Tesaglitazar beladen sind, verwenden Sie zunächst eine Sonde von einem halben Zoll, um eine Etherchloroformlösung von Lipiden durch Ultraschall für 30 Sekunden bei Raumtemperatur, 20 Kilohertz und 50 % Leistung zu emulgieren.

Übertragen Sie die homogenisierte Wasser- und Ölemulsionslösung sofort in einen Rotationsverdampfer mit einem speziellen Adapter, einem Nanometer-Manometer und einem Druckregelventil und schließen Sie den Verdampfer an eine Vakuumleitung an. Um die organischen Lösungsmittel zu entfernen, stellen Sie die Drehzahl auf 100 Umdrehungen pro Minute und das Vakuum auf 0,5 Atmosphären ein. Nachdem sich ein Gel gebildet hat und verschwunden ist, erhöhen Sie das Vakuum auf 0,9 Atmosphären und filtrieren Sie die wässrige Liposomendispersion durch einen 200-Nanometer-Gießpolycarbonatfilter in einem Liposomenextruder, der mit zwei gasdichten Spritzen ausgestattet ist, mehrmals hin und her.

Nachdem Sie die Größenverteilung durch dynamische Lichtstreuung überprüft haben, verwenden Sie eine zwei Milliliter Spin-Säule, um nicht eingeschlossene Tesaglitazar von den Liposomen zu entfernen, und verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die eingeschlossene Wirkstoffkonzentration zu bestimmen. Geben Sie dann nicht mehr als 500 Mikroliter Liposomenprobe in das Trockensäulen-Gelbett. Um die Liposomen durch retroorbitale Injektion zu verabreichen, drücken Sie sanft auf die Haut über und unter dem freiliegenden Auge, um das Auge über die Gesichtsebene zu heben.

Führen Sie dann vorsichtig die Spitze der Nadel am vorderen Augenwinkel ein, achten Sie darauf, dass sich die Nadel unter der Kugel befindet, ohne sie zu berühren, und injizieren Sie die Liposomen langsam in den retroorbitalen Raum. Um die Blutprobe zu entnehmen, wird am entsprechenden experimentellen Endpunkt vorsichtig ein Hautschnitt am Rand des kaudalen Endes des Brustkorbs der Maus vorgenommen und eine einen Zentimeter lange gerade Linie in Richtung des Kopfes des Tieres geschnitten, bis die Brustmuskeln freiliegen. Machen Sie an der ersten Schnittstelle zwei kleine Schnitte senkrecht zur Linie in Richtung Kopf und schneiden Sie vorsichtig den Brustmuskel auf einer Seite des Brustkorbs im exponierten Bereich weg, um einen besseren Zugang und eine bessere Visualisierung der Nadeleinstichstelle zu ermöglichen.

Führen Sie die Nadel zwischen der dritten und vierten Rippe ein, halten Sie sie so nah wie möglich an der Mittellinie des Brustkorbs und ziehen Sie die Spritze vorsichtig nach oben, um mit der Blutentnahme zu beginnen. Wenn so viel Volumen wie möglich gesammelt wurde, überführen Sie das Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 10 Mikrolitern 0,5 molar EDTA auf Eis. Um das leistengewebliche Pad von jeder Seite der Maus zu extrahieren, verwenden Sie eine Pinzette, um die Peritonealmembran auf der rechten Seite zu halten, und die zweite Pinzette, um den Hautrand über der Peritonealmembran auf der anderen Seite zu halten.

Ziehen Sie die Haut vorsichtig von der Membran weg, um die Schichten voneinander zu trennen. Stecken Sie den äußeren Rand der Haut fest, um besser auf das Fettdepot zugreifen zu können, und lokalisieren Sie das Leistenfettdepot entlang der Haut. Und lokalisieren Sie den Leistenlymphknoten in der Mitte des Fettdepots mit Pinzette und Schere, um den Lymphknoten nach Bedarf zu entfernen.

Nachdem der Lymphknoten entfernt wurde, fassen Sie mit der Pinzette vorsichtig das Ende des Fettdepots, das dem fixierten Punkt am nächsten liegt, und beginnen Sie, kleine Schnitte an der Bindemembran zwischen Fettgewebe und Haut zu machen. Heben Sie das Fettgewebe von der Haut ab, während Sie Schnitte machen, um einen besseren Zugang zur Membran zu erhalten, und legen Sie das Depot in ein Polyethylenfläschchen mit HEPES-Puffer auf Eis. Um die Nebenhoden-Fettdepots aus dem kaudalen Ende der Bauchhöhle zu extrahieren, ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das erste Nebenhoden-Fettdepot aus dem dorsalen Ende der Maus und lokalisieren Sie die Nebenhoden und Samenleiter, die an diesem Depot befestigt sind.

Schneiden Sie dann vorsichtig zwischen dem Fettdepot und den Nebenhoden und Samenleitern, um das Fettgewebe von den anderen Geweben zu trennen, und legen Sie das Depo in ein Polyethylenfläschchen mit HEPES-Puffer auf Eis. Wenn alle Gewebe entnommen sind, zerkleinern Sie die Fettgewebsproben mit einer bis zwei Scheren in 0,5 Millimeter große Gewebefragmente. Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter mit zwei Milligramm Kollagenasepuffer pro Milliliter in die Fläschchen mit Fettgewebestücken und stellen Sie die Fläschchen 30 bis 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 150 Umdrehungen pro Minute in einen Schüttelinkubator.

Nach 30 Minuten verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um die Proben mehrmals zu zerreiben. Wenn die Gewebestücke noch zu groß sind, um sie leicht zu pipettieren zu können, geben Sie die Proben für weitere 15 Minuten in den Inkubator zurück. Sobald die Proben vollständig aufgeschlossen sind, zerkleinern Sie die Fragmente weitere 10 Mal, um die Bildung einer Einzelzellsuspension sicherzustellen, und seihen Sie jede Probe durch einzelne 70-Mikrometer-Filter in ein 50-Milliliter-Röhrchen pro Probe.

Spülen Sie jede Datei mit fünf Millilitern FACS-Puffer, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln, und filtern Sie jede Wäsche in das entsprechende Fläschchen mit der Zellprobe auf Eis. Wenn alle Proben filtriert wurden, werden die Zellen durch Zentrifugation entnommen und der Adipozytenüberstand aus den Proben aspiriert. Als nächstes aspirieren Sie die Überstände vorsichtig, lassen Sie die Pellets der stromalen Gefäßfraktion intakt, und resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter FACS-Puffer pro Röhrchen.

Anschließend werden die Suspensionen in neue 1,5- oder 1,7-Milliliter-Röhrchen auf Eis überführt, bis sie mit Hilfe von Standardprotokollen durchflusszytometrisch analysiert werden. Die dynamische Lichtstreuung zeigt einen durchschnittlichen Liposomendurchmesser von 163,2 Nanometern und ein Zetapotential von minus 19,2 Millivolt. Die kryogene elektronenmikroskopische Bildgebung zeigt kreisförmige Liposomen mit einer relativ kleinen Standardabweichung, die aus dem durch dynamische Lichtstreuung gemessenen durchschnittlichen Durchmesser ermittelt wird.

Die durchflusszytometrische Analyse von Proben von PBS-behandelten Mäusen kann als DiD-Fluoreszenz abzüglich einer Kontrolle verwendet werden, mit der DiD-positive Gates erstellt werden können. Wie in dieser repräsentativen Analyse gezeigt, ist eine Liposomenbeladungskonzentration von 10 Milligramm pro Milliliter DiD zu hoch und überschreitet den quantifizierbaren Bereich des Zytometers in allen drei getesteten Geweben. Eine Konzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter zeigt ein gewisses Signal, aber eine klare Population jenseits der PBS-behandelten Zellen wird nicht beobachtet.

Daher wird die Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter, die eine klare Unterscheidung zur PBS-Kontrolle darstellt, aber dennoch vom Analysator ablesbar ist, für den Einsatz bei der Liposomenherstellung empfohlen. Für jeden Gewebetyp sind leicht unterschiedliche Gating-Strategien erforderlich, aber die meisten der gleichen Zelltypen können in jedem identifiziert werden. Sobald spezifische Populationen von Interesse identifiziert sind, können die Gesamtgröße jeder Zellpopulation und die Häufigkeit, mit der sie DiD-positiv sind, quantifiziert werden.

Die Vorbereitung von Reagenzien und Geräten und die Antizipation der Ergebnisse für jeden Schritt ist von entscheidender Bedeutung. Unerwartete Ergebnisse zu Beginn können zukünftige Ergebnisse ruinieren. Histologische Methoden können verwendet werden, um die Lokalisierung von Liposomen im gesamten Gewebe zu beurteilen, während die bildgebende Durchflusszytometrie verwendet werden kann, um die Liposomeninternalisierung pro Zelle zu überprüfen.