Name: Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Lernen Sie die Synthese fluoreszenzmarkierter Liposomen und deren zelluläre Aufnahme in vivo mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen für Arzneistofftransport und Zellbiologie.

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Die Autoren bedanken sich bei Michael Solga und dem Rest des Kernpersonals der Durchflusszytometrie für die Bereitstellung von Schulungen und Dienstleistungen im Bereich der Durchflusszytometrie. Die Autoren danken auch Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye und Prasad Srikakulapu für ihre Unterstützung bei der Liposomenpräparation (SSKD, DKB), der Gewebeentnahme (MAM, JCG) und der Durchflusszytometrie-Färbung und Probengewinnung (AU, PS, CM). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 und R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 und T32 HL007284 unterstützt.

<ol><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+from+concept+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).</li>
<li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 286(2015).</li>
<li>Osinski, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liposomal+delivery+of+PPAR%CE%B1%2F%CE%B3+dual+agonist+tesaglitazar+in+a+model+of+obesity+enriches+macrophage+targeting+and+limits+liver+and+kidney+drug+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">In vivo liposomal delivery of PPARα/γ dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects.</a> Theranostics. 10 (2), (2020).</li>
<li>Bauknight, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+thorough+tissue+and+cellular+level+characterization+of+targeted+drugs+in+the+evaluation+of+pharmacodynamic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects.</a> PLoS ONE. 14 (11), (2019).</li>
<li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+A+Fundamental+Process+in+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity.</a> BioMed Research International. , (2017).</li>
<li>He, H., Ghosh, S., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicines+for+dysfunctional+macrophage-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases.</a> Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).</li>
<li>Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+the+mononuclear+phagocyte+system%3A+pharmacokinetics+and+applications+for+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases.</a> Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).</li>
<li>Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liposome+size+on+the+circulation+time+and+intraorgan+distribution+of+amphipathic+poly%28ethylene+glycol%29-containing+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes.</a> BBA - Biomembranes. , (1994).</li>
<li>Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+investigating+in+vivo+fate+of+nanoliposomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).</li>
<li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+whole+body+biodistribution+of+fluorescent-labeled+agents+by+non-invasive+tomographic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging.</a> PLoS One. 6 (6), 20594(2011).</li>
<li>Larmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence-mediated+tomography+for+quantification+of+urokinase+receptor-dependent+leukocyte+trafficking+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation.</a> Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clodronate+liposomes+improve+metabolic+profile+and+reduce+visceral+adipose+macrophage+content+in+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice.</a> PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).</li>
<li>Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+clodronate+liposomes+eliminates+visceral+adipose+macrophages+and+blocks+high-fat+diet-induced+weight+gain+and+development+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance.</a> The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).</li>
<li>Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-obesity+and+anti-inflammatory+effects+of+macrophage-targeted+interleukin-10-conjugated+liposomes+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice.</a> Biomaterials. 110, 81-88 (2016).</li>
<li>Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+an+active+and+passive+targeting+to+tumor+and+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Nakhlband, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combating+atherosclerosis+with+targeted+nanomedicines%3A+Recent+advances+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22BioImpacts%22%5BJournal%5D)">Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective.</a> BioImpacts. , (2018).</li>
<li>Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+targeted+nanotherapeutic+approach+for+obesity+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment.</a> International Journal of Nanomedicine. , (2018).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> Journal of Cell Biology. , (1986).</li>
<li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarren%2C+JSA+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22">Journal of visualized experiments : JoVE</a>. , (2019).</li>
<li>Dasa, S. S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plectin-targeted+liposomes+enhance+the+therapeutic+efficacy+of+a+PARP+inhibitor+in+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer.</a> Theranostics. , (2018).</li>
<li>Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-mediated+recruitment+of+NK+cells+is+a+critical+host+defense+mechanism+in+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2003).</li>
<li>Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jirón Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digestion+of+the+murine+liver+for+a+flow+cytometric+analysis+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e58621(2019).</li>
<li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation research. , (2019).</li>
<li>O'Brien, C. A., Harris, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier beschreiben wir ein dreiteiliges Protokoll zur (i) Herstellung von Liposomen, die mit einem fluoreszierenden Lipidfarbstoff markiert und mit einem Antidiabetikum, Tesaglitazar, beladen sind, (ii) Verabreichung von Liposomen an eine Maus durch retroorbitale Injektion und (iii) Ernte, Verarbeitung und Färbung von Geweben, um die Liposomenaufnahme auf zellulärer Ebene durch Durchflusszytometrie nachzuweisen. Dieses Protokoll überprüft die Herstellung von ca. 150-μm-Liposomen und die Beurteilung der Aufnahme in Fettgewebe, Blut und Milz. Die Liposomenpräparation ist skalierbar, wird meist bei Raumtemperatur durchgeführt und nutzt die Umkehrphasenverdampfung, um die Wirkstoffbeladung und die Entfernung organischer Lösungsmittel zu maximieren. Mit diesem Protokoll können bis zu 2 mg/ml Tesaglitazar-Konzentration in der gereinigten Liposomenprobe erreicht werden. Die hergestellten Liposomen können in HEPES-Puffer bei 4 °C über ein Jahr gelagert werden. Unserer Erfahrung nach zeigten sie eine minimale Variation der mittleren Partikelgröße. Weniger als 10 % des Verlusts des Wirkstoffgehalts wurden spektrophotometrisch nachgewiesen, nachdem die Ultrafiltration die Liposomen vom externen Arzneimittel mit einem 10 kDa Zentrifugalfilter getrennt hatte.
Bei der Herstellung von Liposomen sind einige wichtige Schritte und Faktoren zu berücksichtigen. Zunächst ist die Reihenfolge der Protokollschritte wichtig und muss eingehalten werden. Zweitens muss der pH-Wert der Lösung, die beim Laden von Tesaglitazar verwendet wird, bei 7,4 gehalten werden, um die Löslichkeit und effektive Beladung zu maximieren. Drittens stellt die ordnungsgemäße Montage von Geräten und Filtern sicher, dass die Leistung jedes Schritts die richtige Größe und Reinheit aufweist. Wenn beispielsweise 100- und 200-nm-Filter nicht richtig montiert werden, kann dies zu einer heterogeneren und falsch dimensionierten Charge von Liposomen führen. Viertens ist eine vollständige Entfernung von Ca-Acetat vor dem Beladen des Medikaments erforderlich, um den Transfer von Tesaglitazar in die Liposomen zu maximieren. Um die vollständige Entfernung von Ca-Acetat zu testen, verwenden Sie eine Hochgeschwindigkeitssedimentation, um die Liposomen zu entfernen, und messen Sie dann den Ca-Acetat-Gehalt in der nicht-liposomalen Lösung. Fünftens ist es wichtig, die Masse aller Materialien, die der Liposomenpräparation bei jedem Schritt zugesetzt werden, zu wiegen und aufzuzeichnen. Dadurch wird sichergestellt, dass die richtigen Konzentrationen berechnet werden können und die erforderlichen Materialverhältnisse eingehalten werden. Wenn die Technik nicht ordnungsgemäß ausgeführt wird, kann es zu einem unerwünschten Maß an Heterogenität kommen. Es ist wichtig, diesen Parameter mit DLS und anderen Ansätzen wie der Elektronenmikroskopie gründlich zu überprüfen. Um die Homogenität zu verbessern, sollten Sie die ausgewählte Filtergröße anpassen oder zwei Filter stapeln.
Darüber hinaus ist es von entscheidender Bedeutung, dass Kontrollen und ein Antikörperpanel für die Durchflusszytometrie geplant und optimiert werden, bevor dieses Protokoll vollständig durchgeführt wird (Tabelle 1, Tabelle 3). Antikörper sollten getestet werden, um sicherzustellen, dass die richtigen Konzentrationen für die Färbung verwendet werden und dass die Überlappung zwischen den Fluorophoren minimal ist. Auch die Anregung und Emission des bei der Liposomenpräparation verwendeten Farbstoffs muss bei der Plattenplanung berücksichtigt werden. In unseren Ergebnissen haben wir DiD verwendet, das eine ähnliche Anregung und Emission wie Fluorophore wie Allophycocyanin (APC) und AlexaFluor 647 aufweist. Daher haben wir in unserem Antikörper-Panel keine Antikörper ausgewählt, die an diese Fluorophore konjugiert sind. Darüber hinaus sind Isotypkontrollen in diesem Protokoll nicht enthalten. Dies liegt daran, dass es sich bei den für dieses Protokoll ausgewählten Antikörpern um gut validierte, kommerziell erhältliche Antikörper handelt. Wenn Sie jedoch daran interessiert sind, einen Antikörper zu verwenden, der zuvor nicht optimiert wurde, sollten Sie in Betracht ziehen, den Antikörper vor der Durchführung des vollständigen Experiments gegen eine Isotypkontrolle an den interessierenden Geweben zu testen.
Während dieses Protokoll zeigt, wie das Blut, die Milz, das Leistenfettgewebe und das Nebenhodenfettgewebe aus der Maus nach der Behandlung extrahiert und verarbeitet werden, kann dieser allgemeine Ansatz auf andere Gewebe angewendet werden. Abhängig vom interessierenden Gewebe müssen die Verarbeitungs- und Verdauungsprotokolle möglicherweise geändert werden, wie für die folgenden Gewebe veröffentlicht: Lunge21, Leber22, Peritonealhöhle 3, Knochenmark 3,23, Gehirn 24.
Eine wichtige Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Aufnahme nur zu einem Zeitpunkt pro Tier bewertet werden kann. Daher kann es vorteilhaft sein, dieses Protokoll mit anderen nicht-invasiven bildgebenden Verfahren zu koppeln oder entsprechend zu planen, um ausreichende Ressourcen für die Durchführung der Beurteilung sicherzustellen. Der Zeitpunkt der Zellaufnahme und der Zellumsatz sind wichtige Faktoren, die es zu berücksichtigen gilt: Liposomen zirkulieren in den ersten 24 Stunden durch den Körper und je nach Lebensdauer der Zellen, die Liposomen aufnehmen, oder wie sie auf die Aufnahme reagieren, kann es zum Zelltod oder zu einer weiteren Phagozytose kommen. Unsere vorherige Studie zeigte Veränderungen in den Populationsmerkmalen von DiD+- Populationen zu verschiedenen Zeitpunkten3. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Aufnahme zu früheren Zeitpunkten oder Zeitpunkten, die für die Biologie des interessierenden Mechanismus am relevantesten sind, zu bewerten. Während mit diesem Protokoll die Quantifizierung der Zellaufnahme im gesamten Gewebe durchgeführt werden kann, kann die Durchflusszytometrie keine Gewebelokalisation aufdecken. Die Kopplung dieses Ansatzes mit histologischen Methoden kann helfen, diese Einschränkung zu überwinden.
Im Allgemeinen ergänzt dieses Protokoll bestehende Methoden wie Histologie und Ganzkörperfluoreszenzbildgebung. Mit den kontinuierlichen Fortschritten bei den Instrumenten und Methoden der Durchflusszytometrie wird die Entwicklung größerer Panels für immer spezifischere Zellpopulationen möglich werden. Wir schlagen vor, dieses Protokoll zusätzlich zu den oben genannten Methoden zu verwenden, da dies die Bewertung der zellulären Aufnahme verbessert und auch die Möglichkeit bietet, die durch die Durchflusszytometrie beobachteten Ergebnisse zu validieren. Sollte sich beispielsweise herausstellen, dass ein Großteil der Partikel im Fettgewebe von Makrophagen durch Durchflusszytometrie aufgenommen wurde. Die Immunfluoreszenz eines zusätzlichen Aliquots desselben Fettgewebes konnte gespeichert, fixiert, geschnitten und für Makrophagenmarker gefärbt werden, um zu überprüfen, ob der Zelltyp tatsächlich Liposomen aufnimmt. Dieser Ansatz sollte die durchgeführten Assays zur Bioverteilung von Nanopartikeln präzisieren: Validierung des zellspezifischen Targetings, Quantifizierung der zellulären Aufnahme, Identifizierung der Off-Target-Aufnahme und hoffentlich Bereitstellung von Informationen zur Erstellung mechanistischer Hypothesen für beobachtete therapeutische Ergebnisse. Dieses Protokoll kann auch für zukünftige Studien mit verschiedenen Liposomen angepasst werden, um die Aufnahme in anderen Geweben zu untersuchen und neue Verbindungen im Zusammenhang mit Fettleibigkeit und Stoffwechselstörungen oder anderen Krankheiten zu testen, bei denen die Verabreichung von Nanopartikeln eine praktikable therapeutische Option ist.

Da das Interesse an der Entwicklung von Therapien mit Nanopartikeln wächst, müssen die Methoden zur Vorbereitung und Bewertung der Partikelverteilung und -aufnahme weiter vorangetrieben, erweitert und für die Forschungsgemeinschaft zugänglich gemacht werden 1,2. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die genauen Zelltypen zu bewerten, die Liposomen in vivo nach einer Behandlung mit DiD-markierten Liposomen aufnahmen, die mit Tesaglitazar, einem Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor (PPAR)-α/γ-Agonistenbeladen waren 3,4. In diesen Studien konnten wir beurteilen, welche Zelltypen direkt von der liposomalen Tesaglitazar-Behandlung betroffen waren, die Wirksamkeit von Targeting-Einheiten und Hypothesen aufstellen, um die von uns beobachteten Behandlungsergebnisse zu erklären. Darüber hinaus deuten etablierte biologische Funktionen in einer Vielzahl von Zelltypen darauf hin, dass phagozytische Zellen wie Makrophagen, dendritische Zellen und leberspezifische Kupffer-Zellen den größten Teil der Liposomen einnehmen 5,6,7. Mit Hilfe dieses Protokolls konnten wir zeigen, dass auch nicht-klassische Fresszellen Liposomen 3,4 aufnehmen können.
Dieses Protokoll stellt eine optimierte Methode zur Solubilisierung von Tesaglitazar dar, die Herstellung von Liposomen durch Umkehrphasenverdampfung und die Verwendung von Calciumacetat als Lockstoff für die entfernte Wirkstoffbeladung. Die vorgestellten Methoden sind für viele Labore zugänglich und es fehlen schwer zu beschaffende Materialien und Schritte, die hohe Temperaturen erfordern. Das Protokoll erzeugt Liposomen in einer Größe, die für eine erhöhte Durchblutung in vivooptimal ist 8. Darüber hinaus wurden, wie von Su et al. zusammengefasst, bisher Methoden zur Bewertung der In-vivo-Liposomenverteilung und der Gewebeaufnahme untersucht und eingehend getestet9. Methoden der Positronen-Emissions-Tomographie (PET), der Magnetresonanztomographie (MRT) und der Fluoreszenz-Molekulartomographie (FMT) werden eingesetzt, um die gewebespezifische Bioverteilung und -aufnahme zuquantifizieren 9,10,11. Obwohl diese Methoden optimiert wurden, um die Detektion in vivo zu maximieren, fehlt ihnen immer noch die Fähigkeit, die Liposomenaufnahme in vivo mit zellulärer Auflösung zu quantifizieren. Das hier vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, diesen Bedarf durch den Einsatz der Durchflusszytometrie zu erfüllen. Schließlich wurde für dieses Protokoll die zelluläre Aufnahme auf wenige Gewebe einschließlich Fettgewebe eingegrenzt. Es gibt eine wachsende Zahl von Literatur, die das Potenzial der Verwendung von Nanopartikeln zur Durchführung von Therapien im Zusammenhang mit Fettleibigkeit, Stoffwechselstörungen und Entzündungen untersucht 12,13,14,15,16,17. Daher hielten wir es für wichtig, ein Protokoll mit effektiven Methoden zur Verarbeitung und Analyse von Fettgewebe zu teilen – eines der Gewebe, das bei diesen Pathologien eine wichtige Rolle spielt.

<table><tbody><tr><td>1-mL-Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10-ml-Spritze</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>25-Gauge-Nadel, steril für retroorbitale Injektion</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27-Gauge-Nadel, steril für retroorbitale Injektion</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Klon RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Klon AFS98</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD11b PerCP Cy5.5 Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Klon M1/70</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD11c APC ef780 Antikörper</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Klon N418</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Klon 1D3</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD3 FITC Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Klon 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Klon 390</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Klon 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-Maus F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Klon BM8</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Entsalzung Spin-Säule</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Zeba Spin-Säule</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynamische Lichtstreuung, Nicomp 370</td><td>Partikelgrößenmesssystem, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX & PERM Cell Permeabilization Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Mullschwämme</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Liposomenextruder</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic Gleitmittel</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz Steriles</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16% w/v aq. Soln., methanolfrei</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenfläschchen zum Zerkleinern</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Rotationsverdampfer</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Wärmetherapiepumpe und -pad</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Schienengeätzte Polycarbonat-Membranen</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore Hydrophile Polycarbonat-Membranen</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS-System</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung, verabreichung und bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten liposomen

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Es besteht ein wachsendes Interesse an der Verwendung von Liposomen zur Verabreichung von Verbindungen in vivo, insbesondere für gezielte Behandlungsansätze. Abhängig von der Liposomenformulierung können Liposomen bevorzugt von verschiedenen Zelltypen im Körper aufgenommen werden. Dies kann die Wirksamkeit des therapeutischen Partikels beeinflussen, da das Fortschreiten verschiedener Krankheiten gewebe- und zelltypspezifisch ist. In diesem Protokoll stellen wir eine Methode zur Synthese und Fluoreszenzmarkierung von Liposomen unter Verwendung von DSPC, Cholesterin und PEG-2000 DSPE und dem Lipidfarbstoff DiD als Fluoreszenzmarkierung vor. Dieses Protokoll stellt auch einen Ansatz für die Abgabe von Liposomen in vivo und die Bewertung der zellspezifischen Aufnahme von Liposomen mittels Durchflusszytometrie vor. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die Zelltypen zu bestimmen, die Liposomen aufnehmen, und die Verteilung und den Anteil der Liposomenaufnahme über Zelltypen und Gewebe hinweg zu quantifizieren. Obwohl in diesem Protokoll nicht erwähnt, werden zusätzliche Assays wie Immunfluoreszenz und Einzelzell-Fluoreszenzbildgebung auf einem Zytometer alle Befunde oder Schlussfolgerungen verstärken, da sie die Beurteilung der intrazellulären Färbung ermöglichen. Möglicherweise müssen die Protokolle auch angepasst werden, je nachdem, welche(s) Gewebe(s) von Interesse sind.

Herstellung von Liposomen
Die hier veröffentlichten Ergebnisse ähneln denen unserer zuvor veröffentlichten Arbeit 3,4,20. Unter Verwendung des hier vorgestellten Protokolls erwarten wir, Liposomen mit einer Größe von etwa 150 bis 160 nm herzustellen. DLS zeigt einen durchschnittlichen Liposomendurchmesser von 163,2 nm und ein Zetapotential von -19,2 mV (Abbildung 1A). Die kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zeigt zirkuläre Liposomen (Abbildung 1B) und das DLS-Diagramm zeigt eine relativ kleine Standardabweichung vom durchschnittlichen Durchmesser (Abbildung 1C).
Eine positive Liposomenbindung erfordert eine PBS-behandelte Kontrolle
Frühere Studien unserer Gruppe, die dieses Protokoll verwendeten, untersuchten, welche Zellsubpopulationen in Fett-SVF, Milz und Blut nach einer Woche In-vivo-Verabreichung an Liposomen gebundenwaren 3,4. Mit einer PBS-behandelten Maus wurden Peritonealhöhle und Milzzellen mit demselben Antikörperpanel gefärbt, das auch bei Proben von mit Liposomen behandelten Mäusen verwendet wurde. Das Gewebe wurde nach einer Woche Behandlung entnommen (Abbildung 2A). Die Proben der PBS-behandelten Maus dienten als DiD-FMO, mit dem positive DiD-Gates erzeugt werden konnten (Abbildung 2B,C). Ein positives Gate kann mit einem DiD-positiven Signal erzeugt werden, aber Proben ohne DiD-Signal müssen auch verwendet werden, um zu überprüfen, ob das positive Gate keine DiD-negativen Samples enthält.
Titrationen sind erforderlich, um Fluoreszenzsignale zu optimieren
Vor der Durchführung eines vollständigen Experiments müssen verschiedene Bedingungen optimiert werden, einschließlich der Konzentration von fluoreszenzkonjugierten Antikörpern, die während der Zellfärbung verwendet werden, und von Lipidfarbstoffen, die bei der Liposomenherstellung verwendet werden. Durchflusszytometer haben eine obere Nachweisgrenze für die Fluoreszenzintensität, so dass zu viel Farbstoff, der in die Liposomen eingearbeitet ist, zu nicht quantifizierbaren DiD-Signalen in Proben führt, die durch das Zytometer laufen. Darüber hinaus kann eine zu hohe Menge an DiD in den Liposomen zu einem hohen Maß an unspezifischem Farbstofftransfer führen, was die Ergebnisse der zellulären Aufnahme verzerren könnte. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse eines Experiments, bei dem die Konzentrationen von Lipidfarbstoff titriert wurden, um die Konzentration zu ermitteln, die ein optimales Signal innerhalb des Nachweisbereichs des verwendeten Durchflusszytometers erzeugen würde. Dies wurde an den Geweben durchgeführt, die für das abschließende Experiment von Interesse waren: Blut (Abbildung 3A), Leistenfett-SVF (Abbildung 3B) und Nebenhoden-Fett-SVF (Abbildung 3C). Die für den Test ausgewählten Konzentrationen betrugen 10 mg DiD (hoch, rot), 1 mg DiD (mittel, blau) oder 0,1 mg DiD (niedrig, grau) pro 1 ml Liposomen. Die höchste Konzentration, die in den Liposomen verwendet wurde, war zu hoch und übertraf in allen drei Geweben den quantifizierbaren Bereich des Zytometers (Abbildung 3A\u2012C, rot). Die niedrigste DiD-Konzentration zeigte ein gewisses Signal (Abbildung 3 A\u2012C, grau), aber eine deutliche Population außerhalb der PBS-behandelten Zellen (Abbildung 3A\u2012C, schwarz) wurde nicht beobachtet. Bei der Quantifizierung zeigte das arithmetische Mittel des DiD-MFI für jedes Gewebe und jede Konzentration eine klare Unterscheidung zwischen PBS-Kontrollen und der mittleren DiD-Konzentration (Abbildung 3D). Daher wählten wir, wie im Protokoll angegeben, die mittlere Konzentration (Abbildung 3, blau) für unsere Liposomenpräparation aus.
Die Verwendung eines Multi-Antikörper-Panels ermöglicht die Identifizierung der Liposomenaufnahme durch verschiedene Zellsubpopulationen
Unter Verwendung des in Tabelle 3 beschriebenen Panels wurden die Zellen mit Antikörpern gegen Marker für a-Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen, dendritische Zellen, Monozyten und Endothelzellen gefärbt (Abbildung 4). Für jeden Gewebetyp sind leicht unterschiedliche Gating-Strategien erforderlich, aber in jedem können die meisten der gleichen Zelltypen identifiziert werden. Einige Ausnahmen sind Endothelzellen, die normalerweise nicht im Blut vorkommen, und Monozyten, die typischerweise häufiger im Blut vorkommen als andere Gewebe. Sobald die Populationen identifiziert sind, kann die Gesamtgröße jeder Zellpopulation und die Häufigkeit, mit der sie DiD+ sind, quantifiziert werden. Weitere Berechnungen können durchgeführt werden, um die DiD+-Population zu charakterisieren: Wie viel Prozent der DiD+-Zellen sind Makrophagen, Endothelzellen usw. Bitte beachten Sie, dass dies Beispiele für Gating-Strategien sind, aber nicht die einzige Möglichkeit, die Proben zu analysieren. Die Analyse wird durch das ausgewählte Panel und das/die verfügbare(n) Durchflusszytometer(n) bestimmt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Abbildung 1: Beispielhafte Eigenschaften von präparierten Liposomen. (A) Die Größe und das Zetapotenzial wurden wie oben beschrieben gemessen und in tabellarischer Form angegeben. Jeder Parameter wird als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. (B) Kryo-EM wurde verwendet, um die präparierten Liposomen abzubilden. Der weiße Maßstabsbalken ist 50 nm lang. (C) DLS wurde verwendet, um ein Histogramm des Durchmessers der Liposomen in dieser Präparation zu erstellen. Diese Abbildung wurde von Osinski et al.3 übernommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative DiD-Färbung von PBS- oder Liposomen-behandelten Mäusen. (A) Experimentelles Schema für PBS- und Liposomenbehandlungen. PBS oder Liposomen wurden innerhalb einer Woche dreimal injiziert. Das Gewebe wurde am 8. Tag der Behandlung entnommen. (B, C) Repräsentative Flussdiagramme zeigen eine positive DiD-Färbung bei mit Liposomen behandelten (C), aber nicht mit PBS behandelten (B) Mäusen. FSC, Vorwärtsstreuung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Abbildung 3: Titration von DiD in Liposomen. Liposomen wurden mit drei verschiedenen DiD-Konzentrationen präpariert und Mäusen injiziert. Grau zeigt die niedrige Konzentration bei 0,1 mg DiD pro 1 ml Liposomen an, Blau zeigt die mittlere Konzentration bei 1 mg DiD/ml Liposomen an und Rot zeigt die hohe Konzentration bei 10 mg DiD/ml Liposomen an. Als Negativkontrolle wurde eine PBS-behandelte Maus verwendet (schwarz). Blut (A, Kreis), Leistenfett (B, Triange) und Nebenhodenfett (C, Quadrat) wurden 24 Stunden nach der Injektion entnommen und verarbeitet, um eine einzellige Suspension zu isolieren. Diese Proben wurden auf einem Durchflusszytometer auf das Niveau des nachweisbaren DiD gebracht. Gewebespezifische Histogramme mit Überlagerungen jeder Behandlungsgruppe werden präsentiert, um die Fluoreszenzintensität pro Konzentration (A\u2012C) zu demonstrieren. Das arithmetische Mittel von DiD wurde ebenfalls für jedes Gewebe und jede Konzentration quantifiziert und aufgetragen (D). SSC = seitliche Streuung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative durchflusszytometrische Analyse von Zellsubpopulationen in adipöser SVF, Blut und Milz. (A\u2012C) Schematische Darstellung der Gating-Strategie zur Identifizierung von Zelluntergruppen und DiD+- Zellen in adipösem SVF (A), Milz (B) und Blut (C). Abkürzungen: FSC = Vorwärtsstreuung; LD = lebend/tot; L-DCs = lymphatische dendritische Zellen; M-DCs = myeloische dendritische Zellen; SSC = seitliche Streuung. Diese Abbildung wurde von Osinski et al.3 übernommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Steuerung</td>
			<td>Zweck</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Maus, die mit PBS oder Kochsalzlösung behandelt wurde</td>
			<td>Verwenden Sie die Zellen dieser Maus für die folgenden Durchflusszytometrie-Kontrollen:</td>
		</tr><tr><td>1. Ungefärbte Zellen</td>
		</tr><tr><td>2. Lebende/tote Einzelfärbung</td>
		</tr><tr><td>3. Zellen, die mit dem vollständigen Panel gefärbt wurden, denen jedoch die Liposomenfluoreszenz fehlt, um ein positives Liposomensignal während der Analyse zu bestimmen</td>
		</tr><tr><td>Diese/diese Maus/Mäuse werden auch verwendet, um festzustellen, ob Liposomen in vivo irgendwelche Effekte haben, da Sie in Ihrem Experiment eine Nicht-Liposomenkontrolle haben.</td>
		</tr><tr><td>Entladene Liposomen</td>
			<td>Wenn Sie eine Verbindung in Ihre Liposomen laden, sollte ein Teil Ihrer Liposomencharge ohne die Verbindung synthetisiert werden. Dies erklärt allein die In-vivo-Effekte der Liposomen.</td>
		</tr><tr><td>DiD allein</td>
			<td>Da DiD auch von zellulären Membranen aufgenommen werden kann, hilft die Zuweisung einiger Mäuse, um freien Farbstoff in einer Menge zu erhalten, die der in den Liposomen enthaltenen Menge entspricht, die Hintergrundfärbung der Membran zu berücksichtigen.</td>
		</tr><tr><td>Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO)</td>
			<td>Dabei handelt es sich um Zellen, die mit allen bis auf einen der Antikörper in Ihrem Panel gefärbt sind. Wie # 3 im obigen Kasten hilft dies bei der Bestimmung eines wirklich positiven Signals für diesen Antikörper während der Analyse</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Steuerelemente, die in diesem Protokoll verwendet werden sollen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lösung</td>
			<td>Komponenten</td>
			<td>Ungefähres Volumen, das pro Stapel/Maus benötigt wird</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Liposomen-Präparation</td>
		</tr><tr><td>Calciumacetat</td>
			<td>1 M Calciumacetat inH2O</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>HEPES-Puffer</td>
			<td>10 mM HEPES in H2O, pH 7,4</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar in HEPES</td>
			<td>in 10 mM HEPES</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Gewebeentnahme, -verarbeitung und -färbung</td>
		</tr><tr><td>Phosphatgepufferte Lösung (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mMKH2PO4in destilliertemH2O</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr><tr><td>PBS-Heparin</td>
			<td>0,1 mM Heparin in PBS</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>HEPES-Puffer</td>
			<td>20 mM HEPES in PBS</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>Aufschluss-Puffer</td>
			<td>2 mg/ml Kollagenase Typ I in HEPES-Puffer</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>AKC-Lysepuffer</td>
			<td>0,158 M NH3Cl, 10 mMKHCO3, 0,1 mMNa2EDTA in ddH 2 O, pH7,2</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>FACS-Puffer</td>
			<td>1 % BSA, 0,05 % NaN3 in PBS</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>Fc-Block (verdünnt)</td>
			<td>1:50 Fc-Block im FACS-Puffer</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Fixierungs-Puffer</td>
			<td>2% Paraformaldehyd in PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Lösungen zur Vorbereitung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Ein</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Extrazelluläre Färbung (2x Antikörper-Mix)</td>
		</tr><tr><td>Antigen</td>
			<td>Fluorophor</td>
			<td>Ab-Volumen pro 100 μL Test</td>
			<td>Benötigtes Gesamtvolumen:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Spalte C x 1,2 x Gesamt # Proben</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μl/Test) x (1,2) x (# Proben)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/Test) x (1,2) x (# Proben)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/Test) x (1,2) x (# Proben)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/Test) x (1,2) x (# Proben)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>etc...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Um Ihre Antikörpermischung zu erstellen, kombinieren Sie die in Spalte D berechneten Antikörper mit FACS-Puffer oder Brilliant Violet Staining Buffer* zu einem Endvolumen von (50 μl x 1,2 x Gesamt # Proben)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Lebend-/Totfärbung (1x)</td>
		</tr><tr><td>Lebend/tot</td>
			<td>Fluorophor</td>
			<td>L/D-Volumen pro 200 μL-Test</td>
			<td>Benötigtes Gesamtvolumen:</td>
		</tr><tr><td>Lebend/tot</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Spalte C x 1,2 x Gesamt # Proben</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Intrazelluläre Färbung (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antigen</td>
			<td>Fluorophor</td>
			<td>Ab-Volumen pro 50 μl Test</td>
			<td>Benötigtes Gesamtvolumen:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Spalte C x 1,2 x Gesamt # Proben</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Brilliant Violet Färbepuffer sollte verwendet werden, wenn mehr als ein Antikörper, der mit einem Brilliant Violet Fluorophor konjugiert ist, in Ihrem Panel verwendet wird.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Beispiel-Antikörper-Panel und Berechnungen von Färbemischungen, die für die Fließfärbung verwendet werden sollen.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, fluoreszenzmarkierte Liposomen zu synthetisieren und die Durchflusszytometrie zu verwenden, um die In-vivo-Lokalisation von Liposomen auf zellulärer Ebene zu identifizieren.

Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Unser Protokoll verbindet eine zugängliche Methode zur Aufbereitung von Tesaglitazar-beladenen Liposomen mit einem gründlichen Ansatz zur Beurteilung der Liposomenaufnahme auf zellulärer Ebene. Diese Technik bietet eine unvoreingenommene Methode zur Beurteilung der Aufnahme von fluoreszenzmarkierten Liposomen, die bei niedrigen Temperaturen und mit leicht zu beschaffenden Geräten hergestellt werden. Um fluoreszenzmarkierte Liposomen herzustellen, die mit Calciumacetat und Tesaglitazar beladen sind, verwenden Sie zunächst eine Sonde von einem halben Zoll, um eine Etherchloroformlösung von Lipiden durch Ultraschall für 30 Sekunden bei Raumtemperatur, 20 Kilohertz und 50 % Leistung zu emulgieren.Übertragen Sie die homogenisierte Wasser- und Ölemulsionslösung sofort in einen Rotationsverdampfer mit einem speziellen Adapter, einem Nanometer-Manometer und einem Druckregelventil und schließen Sie den Verdampfer an eine Vakuumleitung an. Um die organischen Lösungsmittel zu entfernen, stellen Sie die Drehzahl auf 100 Umdrehungen pro Minute und das Vakuum auf 0,5 Atmosphären ein. Nachdem sich ein Gel gebildet hat und verschwunden ist, erhöhen Sie das Vakuum auf 0,9 Atmosphären und filtrieren Sie die wässrige Liposomendispersion durch einen 200-Nanometer-Gießpolycarbonatfilter in einem Liposomenextruder, der mit zwei gasdichten Spritzen ausgestattet ist, mehrmals hin und her.Nachdem Sie die Größenverteilung durch dynamische Lichtstreuung überprüft haben, verwenden Sie eine zwei Milliliter Spin-Säule, um nicht eingeschlossene Tesaglitazar von den Liposomen zu entfernen, und verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die eingeschlossene Wirkstoffkonzentration zu bestimmen. Geben Sie dann nicht mehr als 500 Mikroliter Liposomenprobe in das Trockensäulen-Gelbett. Um die Liposomen durch retroorbitale Injektion zu verabreichen, drücken Sie sanft auf die Haut über und unter dem freiliegenden Auge, um das Auge über die Gesichtsebene zu heben.Führen Sie dann vorsichtig die Spitze der Nadel am vorderen Augenwinkel ein, achten Sie darauf, dass sich die Nadel unter der Kugel befindet, ohne sie zu berühren, und injizieren Sie die Liposomen langsam in den retroorbitalen Raum. Um die Blutprobe zu entnehmen, wird am entsprechenden experimentellen Endpunkt vorsichtig ein Hautschnitt am Rand des kaudalen Endes des Brustkorbs der Maus vorgenommen und eine einen Zentimeter lange gerade Linie in Richtung des Kopfes des Tieres geschnitten, bis die Brustmuskeln freiliegen. Machen Sie an der ersten Schnittstelle zwei kleine Schnitte senkrecht zur Linie in Richtung Kopf und schneiden Sie vorsichtig den Brustmuskel auf einer Seite des Brustkorbs im exponierten Bereich weg, um einen besseren Zugang und eine bessere Visualisierung der Nadeleinstichstelle zu ermöglichen.Führen Sie die Nadel zwischen der dritten und vierten Rippe ein, halten Sie sie so nah wie möglich an der Mittellinie des Brustkorbs und ziehen Sie die Spritze vorsichtig nach oben, um mit der Blutentnahme zu beginnen. Wenn so viel Volumen wie möglich gesammelt wurde, überführen Sie das Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 10 Mikrolitern 0,5 molar EDTA auf Eis. Um das leistengewebliche Pad von jeder Seite der Maus zu extrahieren, verwenden Sie eine Pinzette, um die Peritonealmembran auf der rechten Seite zu halten, und die zweite Pinzette, um den Hautrand über der Peritonealmembran auf der anderen Seite zu halten.Ziehen Sie die Haut vorsichtig von der Membran weg, um die Schichten voneinander zu trennen. Stecken Sie den äußeren Rand der Haut fest, um besser auf das Fettdepot zugreifen zu können, und lokalisieren Sie das Leistenfettdepot entlang der Haut. Und lokalisieren Sie den Leistenlymphknoten in der Mitte des Fettdepots mit Pinzette und Schere, um den Lymphknoten nach Bedarf zu entfernen.Nachdem der Lymphknoten entfernt wurde, fassen Sie mit der Pinzette vorsichtig das Ende des Fettdepots, das dem fixierten Punkt am nächsten liegt, und beginnen Sie, kleine Schnitte an der Bindemembran zwischen Fettgewebe und Haut zu machen. Heben Sie das Fettgewebe von der Haut ab, während Sie Schnitte machen, um einen besseren Zugang zur Membran zu erhalten, und legen Sie das Depot in ein Polyethylenfläschchen mit HEPES-Puffer auf Eis. Um die Nebenhoden-Fettdepots aus dem kaudalen Ende der Bauchhöhle zu extrahieren, ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das erste Nebenhoden-Fettdepot aus dem dorsalen Ende der Maus und lokalisieren Sie die Nebenhoden und Samenleiter, die an diesem Depot befestigt sind.Schneiden Sie dann vorsichtig zwischen dem Fettdepot und den Nebenhoden und Samenleitern, um das Fettgewebe von den anderen Geweben zu trennen, und legen Sie das Depo in ein Polyethylenfläschchen mit HEPES-Puffer auf Eis. Wenn alle Gewebe entnommen sind, zerkleinern Sie die Fettgewebsproben mit einer bis zwei Scheren in 0,5 Millimeter große Gewebefragmente. Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter mit zwei Milligramm Kollagenasepuffer pro Milliliter in die Fläschchen mit Fettgewebestücken und stellen Sie die Fläschchen 30 bis 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 150 Umdrehungen pro Minute in einen Schüttelinkubator.Nach 30 Minuten verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um die Proben mehrmals zu zerreiben. Wenn die Gewebestücke noch zu groß sind, um sie leicht zu pipettieren zu können, geben Sie die Proben für weitere 15 Minuten in den Inkubator zurück. Sobald die Proben vollständig aufgeschlossen sind, zerkleinern Sie die Fragmente weitere 10 Mal, um die Bildung einer Einzelzellsuspension sicherzustellen, und seihen Sie jede Probe durch einzelne 70-Mikrometer-Filter in ein 50-Milliliter-Röhrchen pro Probe.Spülen Sie jede Datei mit fünf Millilitern FACS-Puffer, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln, und filtern Sie jede Wäsche in das entsprechende Fläschchen mit der Zellprobe auf Eis. Wenn alle Proben filtriert wurden, werden die Zellen durch Zentrifugation entnommen und der Adipozytenüberstand aus den Proben aspiriert. Als nächstes aspirieren Sie die Überstände vorsichtig, lassen Sie die Pellets der stromalen Gefäßfraktion intakt, und resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter FACS-Puffer pro Röhrchen.Anschließend werden die Suspensionen in neue 1,5- oder 1,7-Milliliter-Röhrchen auf Eis überführt, bis sie mit Hilfe von Standardprotokollen durchflusszytometrisch analysiert werden. Die dynamische Lichtstreuung zeigt einen durchschnittlichen Liposomendurchmesser von 163,2 Nanometern und ein Zetapotential von minus 19,2 Millivolt. Die kryogene elektronenmikroskopische Bildgebung zeigt kreisförmige Liposomen mit einer relativ kleinen Standardabweichung, die aus dem durch dynamische Lichtstreuung gemessenen durchschnittlichen Durchmesser ermittelt wird.Die durchflusszytometrische Analyse von Proben von PBS-behandelten Mäusen kann als DiD-Fluoreszenz abzüglich einer Kontrolle verwendet werden, mit der DiD-positive Gates erstellt werden können. Wie in dieser repräsentativen Analyse gezeigt, ist eine Liposomenbeladungskonzentration von 10 Milligramm pro Milliliter DiD zu hoch und überschreitet den quantifizierbaren Bereich des Zytometers in allen drei getesteten Geweben. Eine Konzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter zeigt ein gewisses Signal, aber eine klare Population jenseits der PBS-behandelten Zellen wird nicht beobachtet.Daher wird die Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter, die eine klare Unterscheidung zur PBS-Kontrolle darstellt, aber dennoch vom Analysator ablesbar ist, für den Einsatz bei der Liposomenherstellung empfohlen. Für jeden Gewebetyp sind leicht unterschiedliche Gating-Strategien erforderlich, aber die meisten der gleichen Zelltypen können in jedem identifiziert werden. Sobald spezifische Populationen von Interesse identifiziert sind, können die Gesamtgröße jeder Zellpopulation und die Häufigkeit, mit der sie DiD-positiv sind, quantifiziert werden.Die Vorbereitung von Reagenzien und Geräten und die Antizipation der Ergebnisse für jeden Schritt ist von entscheidender Bedeutung. Unerwartete Ergebnisse zu Beginn können zukünftige Ergebnisse ruinieren. Histologische Methoden können verwendet werden, um die Lokalisierung von Liposomen im gesamten Gewebe zu beurteilen, während die bildgebende Durchflusszytometrie verwendet werden kann, um die Liposomeninternalisierung pro Zelle zu überprüfen.

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Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen (Video) | JoVE Journal

Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen

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