Visualisierung der Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäben auf der Zellmembran mit Single Nanoparticle Darkfield-Mikroskopie

Unser Protokoll verwendet eine Einzelpartikel-Prüfanalyse, um die Dynamik der Position und der Ausrichtung zu überwachen und charakterisiert die Diffusion von goldenen Nanostäben auf Zellmembranen. Mit dieser Methode können sowohl die translationale als auch die Rotationsdynamik von goldenen Nanostäben erhalten und die Dynamik umfassend analysiert und präsentiert werden. Dieses Protokoll hat das Potenzial, für die Untersuchung anderer Arten komplexer biologischer Systeme verwendet zu werden.

Beginnen Sie mit dem Verbrennen eines Ethanol-Getauchtglasdeckels auf der Flamme und legen Sie den Deckelin in eine 35 mal 10 Millimeter große Zellkulturschale, die zwei Milliliter Zellkulturmedium ohne Phenolrot enthält. Fügen Sie 50 Mikroliter der zellgefederten Federung von Interesse auf den Deckelrutsch und schütteln Sie die Schale sanft hin und her und links und rechts, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie die Schale für ca. 12 Stunden in den Zellkultur-Inkubator, bis die Zellen 20 bis 40 % Konfluenz erreichen, bevor Sie 20 Mikroliter CTAB-beschichtete Gold-Nanostäbe in die Schale geben.

Nach sanftem Schütteln, um die Nanostäbe gleichmäßig über die Schale zu verteilen, legen Sie das Gericht für fünf Minuten in eine befeuchtete Atmosphäre. Am Ende der Inkubation 100 Mikroliter Überstand langsam von der Schale in die Nut einer Glasrutsche geben und die Deckslipzellenseite vorsichtig auf die Gleitnut legen, dann den Rand des Deckels mit Nagellack versiegeln und den Nagellack trocknen lassen, bevor er den Schlitten auf die Dunkelfeld-Mikroskopbühne legt. Legen Sie für die Einzelpartikelverfolgung durch Dunkelfeldmikroskopie einen Tropfen Öl auf den Öl-Dunkelfeldkondensator und drehen Sie den Knopf, bis der Kondensator die Glasrutsche kontaktiert.

Legen Sie einen Tropfen Öl auf die Oberseite des Deckglases und drehen Sie den Fokussierknopf, bis das 60X Öl-Tauchziel das Öl berührt. Schalten Sie die Lichtquelle ein, und drehen Sie den Fokussierknopf leicht, um die Bildebene zu fokussieren. Klicken Sie dann auf das Kamerasymbol in der Mikroskopsoftware, um eine Sample-Streubildzeitserie mit der Farb-CMOS-Kamera aufzuzeichnen und das Bild im TIFF-Format zu speichern.

Um eine einzelne Langzeitflugbahn zu extrahieren, öffnen Sie das Bild in ImageJ, und klicken Sie auf Bild, Typ und 8-Bit, um das Bild aus dem RGB-Modus in den 8-Bit-Modus zu konvertieren. Um den Kontrast anzupassen, klicken Sie auf Bild, passen Sie den Helligkeitskontrast an und legen Sie die Parameter fest. Wählen Sie ein Zielpartikel aus, und verwenden Sie Steuerung X, um den Hintergrund der Zeitreihen abzuschneiden.

Klicken Sie auf Plugins, Partikel-Tracker-Klassiker und Partikel-Tracker, um das Partikelerkennungs- und Partikelverknüpfungsfenster zu öffnen und den Radius auf sechs, den Cutoff auf Null und das Perzentil auf 0,01 % festzulegen, den Linkbereich auf 10 und die Verschiebung auf 10 und klicken Sie auf OK, um das Partikeltracker-Ergebnisfenster zu öffnen, um die Ergebnisse anzuzeigen. Klicken Sie auf Visualisierung aller Flugbahnen, um die generierten Flugbahnen zu überprüfen. Wenn die von der Software generierte Flugbahn und die Bewegungsbahn der Gold-Nanostäbe übereinstimmen, klicken Sie auf Vollständigen Bericht speichern, um die Ergebnisse zu speichern.

Wenn die von der Software generierte Flugbahn nicht mit der bewegten Flugbahn der Gold-Nanostäbe übereinstimmt, klicken Sie auf Relink-Partikel, um die erkannten Partikel mit unterschiedlichen Verbindungsbereichs- und Perzentilparametern neu zu verknüpfen. Um die mittlere Pixelkoordinate der Gold-Nanostange in jedem Frame gemäß der XY-Koordinate zu finden, verwenden Sie die xy-Koordination. m-Funktion.

Um eine Matrix mit drei mal drei Pixeln zu begrenzen, extrahieren Sie die neun Streuintensitätswerte der roten oder grünen Kanäle und berechnen Sie einen Durchschnittswert, verwenden Sie die rgextraction. m-Funktion. Verwenden Sie dann das Polarwinkel.

m-Funktion zur Berechnung der Polarwinkel mit der Dual-Channel-Differentialmethode. Um dynamische Parameter mithilfe der Formeln in der Tabelle zu berechnen, führen Sie die beiden Analyseskripts aus. Legen Sie für die visuelle Analyse der Flugbahn die X-Koordinate als X, die Y-Koordinate als Y und die Zeit als Y fest, klicken Sie dann auf Plot, Streuung und Farbzuordnung, legen Sie die Diagrammparameter fest, und fügen Sie die Farbleiste hinzu.

Um mittlere quadratische Verschiebungszeitintervallzahlen zu generieren, legen Sie das Zeitintervall als X und die mittlere quadratische Verschiebung als Y.Click-Diagramm, Streuung, Analyse, Anpassung, nichtlineare Kurvenanpassung und öffnen den Dialog fest, und legen Sie die Diagrammparameter fest. Legen Sie für die statistische Analyse mit mehreren Partikeln die dynamischen Parameter von Interesse als Y fest, und klicken Sie auf Plot und Histogramm. Doppelklicken Sie auf das Histogramm, um die Divisionsgröße oder die Anzahl der Divisionen festzulegen, und klicken Sie auf Anwenden.

Fügen Sie dann eine Spalte hinzu, und legen Sie die Diagrammparameter fest. Legen Sie für eine Zeitreihenanalyse die Zeit als X und die Zeitreihenparameter als Y.Click-Plot, Multi-Bereich und Stack fest. Wählen Sie im Popupfenster Zeile und OK aus. Legen Sie dann die Parameter für das Diagramm fest.

Das Längsplasmonische Maximum von 40 mal 85 Nanometern CTAB beschichtete Gold-Nanostäbe beträgt ca. 650 Nanometer und die Querresonanz beträgt 520 Nanometer. Die Streuintensität der CTAB-beschichteten Gold-Nanostäbe auf U87-Zellmembranen zeigt eine typische Gaußsche Verteilung mit einer schmalen Breite, die mit der von CTAB beschichteten Gold-Nanostäben auf Glas übereinstimmt, was darauf hinweist, dass CTAB-beschichtete Gold-Nanostäbe, die in diesem Experiment verfolgt wurden, gut monodisperse sind. Wie dargestellt, können mehr als 500 CTAB-beschichtete Gold-Nanostab-Trajektorien durch Dunkelfeldmikroskopie verfolgt und in Weitbereichsdiffusionsbahnen und begrenzte Diffusionsbahnen unterteilt werden.

Der Kreiselradius aller 500 Flugbahnen in dieser repräsentativen Analyse zeigte eine kleine Werteverteilung mit einem mittleren Kreiselradius von 0,5 Mikrometern und die maximale Verschiebung war bei kleinen Werten stärker verteilt. Wie in dieser Ensemblezeitdurchschnittliche mittlere Quadratverschiebungsanalyse gezeigt, diffundieren die CTAB-beschichteten Gold-Nanostäbe normalerweise mit einem Alpha von etwa einem. Die Dichteverteilung des Diffusionskoeffizienten und des Alphaaus allen Bahnen zeigt jedoch, dass die Dynamik der Gold-Nanostäbe eine heterogene Verteilung mit Superdiffusions-, Brownian- und Subdiffusionsbewegungen aufweist.

Darüber hinaus können einzelne partikelstatistische Analysen und Parameteranalysen für Zeitreihen verwendet werden, um zwei repräsentative, langfristig begrenzte und sich bewegende Bahnen zu charakterisieren. Es ist notwendig, eine einzige neuartige Interpretation der Daten aus der Einzelnen-Partikel-Tracking-Analyse zu resamieren und zu extrahieren, da es in der Regel einige schwierige Kompromisse zu machen gibt.