Eine Bioinformatik-Pipeline zur Untersuchung der molekularen Evolution und Genexpression mit RNA-seq
28. Mai 2021
Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Evolution und Expression von Kandidatengenen anhand von RNA-Sequenzierungsdaten zu untersuchen.
Dieses Protokoll beschreibt bioinformatische Schritte zur Untersuchung der molekularen Evolution und Expression von Kandidatengenen. Hier bieten wir gründliche Anweisungen, damit jeder mit minimaler bioinformatischer Erfahrung dieses Protokoll durchlaufen kann. Diese Pipeline kann auf jeden Organismus und jede Genfamilie angewendet werden.
Ein häufiges Problem bei der Bioinformatik ist das Versagen von Shell-Skripten. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, stellen Sie sicher, dass Sie über die aktuellste Software verfügen, lesen Sie die Fehlerdateien und lesen Sie das Handbuch sorgfältig. Melden Sie sich zunächst in einem Terminal oder PuTTY-Anwendungsfenster beim Computerclusterkonto an.
Laden Sie auf dem Terminal SRA Toolkit Version 2.8.1 mit Wget herunter und beenden Sie dann die Installation des Programms. Durchsuchen Sie NCBI nach der SRA-Zugangsnummer für die gewünschten Proben und erhalten Sie dann die RNA-Sequenzdaten im Terminalfenster. Rufen Sie zwei FASTQ-Dateien für den Dateityp mit gepaartem Ende ab.
Finden Sie das Referenzgenom online, falls vorhanden. Um eine Referenzassembly abzurufen, geben Sie wget in das Terminalfenster ein, und fügen Sie die Linkadresse ein. Falls verfügbar, kopieren Sie auch die GTF-Datei und die Protein-FASTA-Datei für das Referenzgenom.
Indizieren Sie das Genom, dann kartenlesen und berechnen Sie die Expression für jede Probe. Benennen Sie die Ergebnisdatei in etwas Beschreibendes um und generieren Sie eine Matrix aller Zählungen. Öffnen Sie ein Internetbrowserfenster und gehen Sie zu NCBI GenBank.
Geben Sie in der Suchleiste den Namen des interessierenden Gens und den Namen der eng verwandten Arten ein, die sequenziert wurden. Wählen Sie links neben der Suchleiste Protein aus, und klicken Sie dann auf Suchen. Extrahieren Sie die Sequenzen, indem Sie auf Senden an klicken, und wählen Sie dann Datei aus.
Wählen Sie unter Format die Option FASTA aus, und klicken Sie dann auf Datei erstellen. Verschieben Sie die FASTA-Datei der Homologe über ein lokales Terminalfenster oder FileZilla in den Computercluster. Als nächstes suchen Sie mit BLAST+ nach Kandidatengenen Erstellen Sie auf dem Computercluster eine BLAST-Datenbank aus dem Genom oder dem transkriptomüberseten Protein FASTA.
BLAST die homologen Gensequenzen von NCBI in die Datenbank der interessierenden Spezies und dann die Ausgabedatei mit dem Befehl mehr anzeigen. Kopieren Sie eindeutige Gen-IDs von der interessierenden Spezies in eine neue Textdatei. Extrahieren Sie die Sequenzen der Kandidatengene.
Um die Genannotation mit Reciprocal BLAST zu bestätigen, gehen Sie zum BLAST Local Alignment Search Tool, wählen Sie BLASTP aus, fügen Sie dann die Kandidatensequenzen ein, wählen Sie die nicht redundante Proteinsequenzdatenbank aus und klicken Sie auf BLAST. Öffnen Sie MEGA, klicken Sie auf Ausrichten, dann auf Build-Ausrichtung bearbeiten, wählen Sie Neue Ausrichtung erstellen und klicken Sie auf OK. Wählen Sie Protein aus. Wenn das Fenster Ausrichtung geöffnet wird, klicken Sie auf Bearbeiten.
Klicken Sie auf Sequenzen aus Datei einfügen und wählen Sie die FASTA mit Proteinsequenzen von Kandidatengenen und wahrscheinlichen Homologen aus. Wählen Sie Alle Sequenzen aus. Suchen Sie das Armsymbol und bewegen Sie den Mauszeiger darüber.
Es sollte sagen, dass Sequenzen mit dem Muskelalgorithmus ausgerichtet werden. Klicken Sie auf das Armsymbol und dann auf Protein ausrichten, um die Sequenzen auszurichten Parameter bearbeiten, oder klicken Sie auf OK, um Standardparameter zu verwenden. Dieses Protokoll wurde auf Gewebe von Hydra vulgaris angewendet, einem wirbellosen Süßwassertiere, das zum Stamm Cnidaria gehört.
Opsin-Gene wurden untersucht, um Einblicke in die Evolution der Augen und die Lichtdetektion bei Tieren zu erhalten. Sequenzen für Opsin-verwandte Gene von H.vulgaris und anderen Spezies wurden in eine FASTA-Datei aus der NCBI GenBank extrahiert. Die Opsin-Gene wurden in MEGA ausgerichtet, so dass es möglich war, Hydra-Opsine zu identifizieren, denen eine konservierte Lysin-Aminosäure fehlte, die notwendig war, um ein lichtempfindliches Molekül zu binden.
Ein Maximum-Likelihood-Baum wurde mit Opsin-Sequenzen von Hydra vulgaris und anderen Arten generiert. Die Phylogenie legt nahe, dass sich Opsin-Gene durch linienspezifische Duplikationen bei Nesseltieren und möglicherweise durch Tandemduplikation bei H.vulgaris entwickeln. Als nächstes wurde eine differentielle Expressionsanalyse in edgeR durchgeführt, um die absolute Expression von Opsin-Genen zu untersuchen.
Um festzustellen, ob ein oder mehrere Opsine im Hypostom oder Kopf hochreguliert sind, wurden paarweise Vergleiche von Hypostom mit der Körpersäule, der Knospenzone, dem Fuß und den Tentakeln durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass 1.774 Transkripte zwischen hypostom und Körpersäule unterschiedlich exprimiert wurden. Die Gene, die über mehrere Vergleiche hochreguliert wurden, wurden bestimmt und eine funktionelle Anreicherung in Blast2GO durchgeführt.
Schließlich wurde die absolute Expression von Opsin-Genen in verschiedenen Geweben während verschiedener Stadien der Knospung und während verschiedener Zeitpunkte der Regeneration untersucht. Die visuelle Inspektion der Ausrichtung und des Baums wird bestätigen, ob kandidatengene zur interessierende Familie gehören. Gene, die in der Reihenfolge zu unterschiedlich sind oder eine Gruppe außerhalb von allem anderen, sind wahrscheinlich Teil einer anderen Genfamilie.
Die Ergebnisse dieses Protokolls können als hypothesengenerierend angesehen werden. Diese Pipeline kann Kandidatengene hervorheben, die in zukünftigen Studien funktionell untersucht werden sollen. Nachdem wir die Hydra-Opsin-Expression untersucht haben, verwenden wir nun ähnliche Techniken, um verwandte Gene über Arten hinweg zu untersuchen, um Ähnlichkeiten und Funktionsunterschiede zu identifizieren.
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Übersicht
Dieses Protokoll untersucht die molekulare Evolution und Expression von Kandidatengenen unter Verwendung von RNA-Sequenzierungsdaten, wobei speziell Opsin-Gene in Hydra vulgaris im Fokus stehen. Die Studie zeigt eine bioinformatische Pipeline, die auf verschiedene Organismen angewendet werden kann.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Genexpressionsanalyse
- Molekulare Evolution
- Bioinformatik
Hintergrund
- Untersucht Kandidatengene, die für die Lichtdetektion und die Augenevolution relevant sind
- Verwendet das Süßwasser-Invertebrat Hydra vulgaris
- Nutzt NCBI-Ressourcen zur Beschaffung von Sequenzdaten
Verwendete Methoden
- Bioinformatik-Pipeline für die RNA-Sequenzierung
- Hydra vulgaris als biologisches System
- Werkzeuge wie BLAST, MEGA und edgeR für die Analyse
Hauptergebnisse
- Identifizierte Opsin-Gene, die durch linien-spezifische Duplikationen in den Cnidariern entstehen
- Gefundene differenzielle Expression von 1.774 Transkripten in verschiedenen Körperteilen
- Erstellung eines phylogenetischen Maximum-Likelihood-Baums der Opsin-Sequenzen
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll unterstreicht das Potenzial von Kandidatengenen für zukünftige funktionelle Studien
- Erweitert das Verständnis der Genentwicklung und -expression im Zusammenhang mit der Sinnesbiologie
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Diese Bioinformatik-Pipeline ermöglicht die systematische Untersuchung der Genfamilien-Evolution und -Expression und unterstützt die Zielvalidierung durch mechanistische Ent-Risikobewertung in der frühen Entdeckungsphase. Durch die Integration phylogenetischer Analysen mit der RNA-seq-Quantifizierung liefert sie eine vorhersagende Sicherheit zur Priorisierung von Kandidatengenen mit konservierten oder abweichenden Funktionen über verschiedene Arten hinweg. Der Ansatz unterstützt die Portfolio-Triage, indem er mechanistisch fundierte Hypothesen identifiziert, bevor Ressourcen für funktionelle Studien bereitgestellt werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem sie die Gen-Orthologie und evolutionären Beziehungen innerhalb von Zielgenfamilien klärt.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch vergleichende Expressionsprofilierung über verschiedene Gewebe und Entwicklungsstadien hinweg.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Identifizierung aussichtsreicher Kandidaten, indem sie Gene mit linien-spezifischen Expansionen und gewebeangereicherten Expressionsmustern hervorhebt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erstellt validierte Gen-Sets für nachgeschaltete Screenings, indem die Zugehörigkeit zur Genfamilie durch Sequenzalignierung und Baumtopologie bestätigt wird.
- Operationaler Wert: Erzeugt standardisierte Zählmatrizen aus RNA-seq-Daten und ermöglicht so reproduzierbare quantitative Ergebnisse für die Bereitschaft zu Assays.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform über verschiedene Organismen hinweg, indem konsistente BLAST-, Alignierungs- und phylogenetische Workflows angewendet werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Expressionsdaten aus der Entdeckungsphase mit präklinischen Modellen, indem konservierte Expressionsmuster in relevanten Geweben identifiziert werden.
- Biomarker-Abstimmung: Unterstützt die translationale Biomarker-Entdeckung durch differentielle Expressionsanalyse unter verschiedenen Bedingungen, beispielsweise Hypostom versus Körperkolonne bei Hydra.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Leitet Go/No-Go-Entscheidungen ein, indem Expressionsdynamiken während der Regenerations- und Knospungsphasen aufgezeigt werden, was auf funktionelle Relevanz hindeutet.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Zielidentifizierung bis hin zur Leadoptimierung und ermöglicht einen hypothesengesteuerten Fortschritt von der Sequenzanalyse bis zur funktionellen Priorisierung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Erstellung von Stammbäumen, die Duplikationsereignisse und Selektionsdruck auf interessierende Genfamilien aufzeigen.
- Screening: Stellt testtaugliche biologische Systeme bereit, indem normalisierte Expressionsmatrizen eine vergleichende Analyse der Genaktivität zwischen Proben ermöglichen.
- Analysen: Ermöglicht quantitative Messungen abhängiger Variablen mittels edgeR-basierter differentieller Expression und damit den statistischen Vergleich verschiedener Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem Gene identifiziert werden, die in sensorischen Systemen innerhalb der Metazoen konservierte Funktionen besitzen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare bioinformatische Kapazität zur Untersuchung beliebiger Genfamilien und verringert so redundante Entwicklungen von Analysepipelines über Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielstrukturauswahl, indem mechanistische Unklarheiten durch evolutionären und expressionsbezogenen Kontext reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch dokumentierte, schrittweise bioinformatische Verfahren, die über verschiedene Teams hinweg anwendbar sind.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem eine frühzeitige Risikominimierung von Zielstrukturen vor Investitionen in die experimentelle Validierung ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem Gene hervorgehoben werden, die eine starke evolutionäre Konservierung und gewebespezifische Induktion aufweisen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Bioinformatik, einschließlich Befehlszeilenwerkzeuge, Sequenzdatenbanken und phylogenetische Software.
- Hängt von dem Zugang zu einer geeigneten Recheninfrastruktur ab, um große RNA-Seq-Datensätze zu verarbeiten und Analysen mit BLAST, MEGA und edgeR durchzuführen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich Dateibenennung, Versionen des Referenzgenoms sowie Parametereinstellungen für die Sequenzalignierung und Baumkonstruktion.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Analyse-Pipeline auf Nicht-Modellorganismen mit unvollständigen Genomen oder Annotationen angewendet wird.
- Ist durch die Qualität und Vollständigkeit der Eingabedaten begrenzt, einschließlich der Tiefe der RNA-Seq-Daten und der Genauigkeit der Annotation des Referenzgenoms.
