Name: Eine Bioinformatik-Pipeline zur Untersuchung der molekularen Evolution und Genexpression mit RNA-seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Erfahren Sie eine Bioinformatik-Pipeline zur Analyse molekularer Evolution und Genexpression mit RNA-seq. Diese Methode nutzt Hydra vulgaris und Tools wie BLAST, MEGA und edgeR für phylogenetische und differentielle Expressionsanalysen.

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Wir danken Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad und Aline G. Rangel für Rat und Anleitung bei der Integration einiger dieser Schritte in unseren Workflow. Wir danken auch Katherine Williams, Elisabeth Rebboah und Natasha Picciani für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Forschungsstipendium der George E. Hewitt Foundation for Medical an A.M.M unterstützt.

Dieses Protokoll folgt den Tierpflegerichtlinien von UC Irvine.
1. RNA-seq-Bibliotheksvorbereitung
<ol><li>Isolieren Sie RNA mit den folgenden Methoden.<ol>
<li>Sammeln Sie Proben. Soll RNA zu einem späteren Zeitpunkt extrahiert werden, die Probe flash einfrieren oder in RNA-Speicherlösung15 ( Materialtabelle )legen.</li>
		<li>Euthanisieren und sezieren Sie den Organismus, um Gewebe von Interesse zu trennen.</li>
		<li>Extrahieren Sie die Gesamt-RNA mit einem Extraktionskit und reinigen Sie die RNA mit einem RNA-Reinigungskit (Materialtabelle) HINWEIS: Es gibt Protokolle und Kits, die für verschiedene Arten und Gewebetypen besser funktionieren können16,17. Wir haben RNA aus verschiedenen Körpergeweben eines Schmetterlings18 und einer gallertartigen Hydra19 extrahiert (siehe Diskussion).</li>
		<li>Messen Sie die Konzentration und Qualität der RNA jeder Probe (Materialtabelle). Verwenden Sie Proben mit RNA-Integritätszahlen (RIN) von mehr als 8, idealerweise näher an 920, um cDNA-Bibliotheken zu erstellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erstellen Sie die cDNA-Bibliothek und -Sequenz wie folgt.<ol>
<li>Erstellen Sie cDNA-Bibliotheken gemäß der Bedienungsanleitung für die Bibliotheksvorbereitung (siehe Diskussion).</li>
		<li>Bestimmen Sie die cDNA-Konzentration und -Qualität (Materialtabelle).</li>
		<li>Multiplexen Sie die Bibliotheken und sequenzieren Sie sie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Zugreifen auf einen Computercluster
HINWEIS: Die RNA-seq-Analyse erfordert die Manipulation großer Dateien und wird am besten auf einem Computercluster durchgeführt (Materialtabelle).
<ol><li>Melden Sie sich beim Computerclusterkonto mit dem Befehl ssh username@clusterlocation in einem Terminal- (Mac) oder PuTTY-Anwendungsfenster (Windows) an.</li>
</ol>3. Erhalten Sie RNA-seq-Lesevorgänge
<ol><li>Erhalten Sie RNA-seq-Lesevorgänge von der Sequenzierungseinrichtung oder, bei Daten, die in einer Publikation generiert werden, von dem Datenrepositorium, in dem sie abgelegt wurden (3.2 oder 3.3).</li>
	<li>Gehen Sie wie folgt vor, um Daten aus Repositories wie ArrayExpress herunterzuladen:<ol>
<li>Durchsuchen Sie die Website mit der Zugangsnummer.</li>
		<li>Suchen Sie den Link zum Herunterladen der Daten, klicken Sie mit der linken Maustaste, und wählen Sie Link kopierenaus.</li>
		<li>Geben Sie im Terminalfenster wget ein, und wählen Sie Link einfügen aus, um die Daten zur Analyse in das Verzeichnis zu kopieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gehen Sie folgendermaßen vor, um NCBI Short Read Archive (SRA)-Daten herunterzuladen:<ol>
<li>Laden Sie auf dem Terminal SRA Toolkit v. 2.8.1 mit wget herunter. HINWEIS: Das Herunterladen und Installieren von Programmen auf dem Computercluster erfordert möglicherweise Root-Zugriff, wenden Sie sich an Ihren Computerclusteradministrator, wenn die Installation fehlschlägt.</li>
		<li>Beenden Sie die Installation des Programms, indem Sie tar -xvf $TARGZFILEeingeben.</li>
		<li>Suchen Sie NCBI nach der SRA-Beitrittsnummer für die Proben, die Sie herunterladen möchten, es sollte das Format SRRXXXXXX haben.</li>
		<li>Rufen Sie die RNA-seq-Daten ab, indem Sie [sratoolkit location]/bin/prefetch SRRXXXXXX im Terminalfenster eingeben.</li>
		<li>Für Paired-End-Dateien geben Sie [sratoolkit location]/bin/fastq-dump --split-files SRRXXXXXX ein, um zwei fastq-Dateien (SRRXXXXXX_1.FASTQ und SRRXXXXXX_2.FASTQ) zu erhalten. HINWEIS: Um eine Trinity de novo-Assembly zu erstellen, verwenden Sie den Befehl [sratoolkit location]/bin/fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-files SRRXXXXXX
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Trimmadapter und Lesevorgänge von geringer Qualität (optional)
<ol><li>Installieren oder laden Sie Trimmomatic21 v. 0.35 auf dem Rechencluster.</li>
	<li>Geben Sie in dem Verzeichnis, in dem sich die RNA-seq-Datendateien befinden, einen Befehl ein, der den Speicherort der trimmomatischen JAR-Datei, die FASTQ-Eingabedateien, die FASTQ-Ausgabedateien und optionale Parameter wie Leselänge und -qualität enthält. HINWEIS: Der Befehl variiert je nach roher und gewünschter Qualität und Länge der Lesevorgänge. Für Illumina 43 bp Lesevorgänge mit Nextera-Primern haben wir verwendet: java -jar /data/apps/trimmomatic/0.35/trimmomatic-0.35.jar PE $READ 1. FASTQ $READ 2. FASTQ paired_READ1. FASTQ unpaired_READ1. FASTQ paired_READ2. FASTQ unpaired_READ2. FASTQ ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEADING:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:17 MINLEN:30.
</li>
</ol>5. Referenzbaugruppe beziehen
<ol><li>Durchsuchen Sie google, EnsemblGenome und NCBI Genomes and Nucleotide TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) nach einem Referenzgenom oder einem zusammengesetzten Transkriptom für die interessierenden Arten (Abbildung 1). HINWEIS: Wenn ein Referenzgenom oder Transkriptom nicht verfügbar oder von geringer Qualität ist, fahren Sie mit SCHRITT 6 fort, um eine De-novo-Assemblierung zu erstellen.</li>
	<li>Wenn ein Referenzgenom oder ein zusammengesetztes Transkriptom vorhanden ist, laden Sie es als Fasta-Datei herunter, in die die Analyse gemäß den folgenden Schritten durchgeführt wird.<ol>
<li>Suchen Sie den Link, um das Genom herunterzuladen, klicken Sie mit der linken Maustaste und kopieren Sie den Link.</li>
		<li>Geben Sie im Terminalfenster wget ein und fügen Sie die Linkadresse ein. Falls verfügbar, kopieren Sie auch die GTF-Datei und die Protein-FASTA-Datei für das Referenzgenom.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Generieren Sie eine De-novo-Baugruppe (Alternative zu Schritt 5)
<ol><li>Kombinieren Sie die RNA-seq READ1- und READ2 fastq-Dateien für alle Proben, indem Sie cat *READ1 eingeben. FASTQ > $all_READ1. FASTQ und Katze *READ2. FASTQ > all_READ2. FASTQ im Terminalfenster.</li>
	<li>Installieren oder laden Sie Trinity22 v.2.8.5 auf dem Computercluster.</li>
	<li>Generieren und assemblieren Sie durch Eingabe auf dem Terminal: Trinity --seqType fq --max_memory 20G --left $all_READ1. FASTQ --right $all_READ2. FASTQ.
</li>
</ol>7. Karte liest sich zum Genom (7.1) oder de novo Transkriptom (7.2)
<ol><li>Die Karte liest das Referenzgenom mit STAR23 v. 2.6.0c und RSEM24 v. 1.3.0.<ol>
<li>Installieren oder laden Sie STAR v. 2.6.0c. und RSEM v. 1.3.0 an den Rechencluster.</li>
		<li>Indizieren Sie das Genom, indem Sie rsem-prepare-reference --gtf $GENOME eingeben. GTF --star -p 16 $GENOME. FASTA $OUTPUT.
</li>
		<li>Map liest und berechnet den Ausdruck für jede Stichprobe, indem rsem-calculate-expression -p 16 --star --paired-end $READ 1 eingegeben wird. FASTQ $READ 2. FASTQ $INDEX $OUTPUT.
</li>
		<li>Benennen Sie die Ergebnisdatei mit mv RSEM.genes.results $sample.genes.results in etwas Beschreibendes um.
</li>
		<li>Generieren Sie eine Matrix aller Zählungen, indem Sie rsem-generate-data-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUTeingeben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ordnen Sie RNA-seq mit RSEM und Bowtie der Trinity de novo-Assemblierung zu.<ol>
<li>Installieren oder laden Sie Trinity22 v.2.8.5, Bowtie25 v. 1.0.0 und RSEM v. 1.3.0.</li>
		<li>Map liest und berechnet ausdrucksbereit für jedes Beispiel, indem [trinity_location]/align_and_estimate_abundance.pl --prep-reference --transcripts $TRINITY. FASTA --seqType fq --left $READ 1. FASTQ --rechts $READ 2. FASTQ --est_method RSEM --aln_method Fliege --trinity_mode --output_dir $OUTPUT.
</li>
		<li>Benennen Sie die Ergebnisdatei mit mv RSEM.genes.results $sample.genes.results in etwas Beschreibendes um.
</li>
		<li>Generieren Sie eine Matrix aller Zählungen, indem Sie [trinity_location]/abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM *[genes/isoforms].results eingeben
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Gene von Interesse identifizieren
HINWEIS: Die folgenden Schritte können mit Nukleotid- oder Protein-FASTA-Dateien durchgeführt werden, funktionieren jedoch am besten und sind mit Proteinsequenzen einfacher. BLAST-Suchen mit Protein zu Protein liefern eher Ergebnisse, wenn zwischen verschiedenen Arten gesucht wird.
<ol><li>Für ein Referenzgenom verwenden Sie die Protein-FASTA-Datei aus STEP 5.2.2 oder siehe Ergänzende Materialien, um ein benutzerdefiniertes Genmerkmal GTF zu generieren.</li>
	<li>Für ein De-novo-Transkriptom erzeugen Sie ein Protein FASTA mit TransDecoder.<ol>
<li>Installieren oder laden Sie TransDecoder v. 5.5.0 auf dem Computer cluser.</li>
		<li>Suchen Sie den längsten offenen Leserahmen und die vorhergesagte Peptidsequenz, indem Sie [Transdecoder-Position]/TransDecoder.LongOrfs -t $TRINITY eingeben. FASTA.
</li>
	</ol></li>
	<li>Suche NCBI Genbank nach Homologen in eng verwandten Arten.<ol>
<li>Öffnen Sie ein Internetbrowserfenster und gehen Sie zu https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.</li>
		<li>Geben Sie in der Suchleiste den Namen des interessierenden Gens und den Namen eng verwandter Arten ein, die sequenziert wurden, oder Gattung oder Stamm. Wählen Sie links in der Suchleiste Protein aus und klicken Sie auf Suchen.</li>
		<li>Extrahieren Sie Sequenzen, indem Sie auf Senden an klicken und dann Datei auswählen. Wählen Sie unter Format die Option FASTA aus, und klicken Sie dann auf Datei erstellen.
</li>
		<li>Verschieben Sie die FASTA-Datei der Homologe auf den Computercluster, indem Sie scp $FASTA username@clusterlocation:/$DIR in einem lokalen Terminalfenster eingeben oder FileZilla verwenden, um Dateien von und zu Computer und Cluster zu übertragen.</li>
	</ol></li>
	<li>Suche nach Kandidatengenen mit BLAST+26.<ol>
<li>Installieren oder laden Sie BLAST+ v. 2.8.1 auf dem Computercluster.</li>
		<li>Erstellen Sie auf dem Computercluster eine BLAST-Datenbank aus dem genom- oder transkriptomüberseten Protein FASTA, indem Sie [BLAST+ location]/makeblastdb -in $PEP eingeben. FASTA -dbtype prot -out $OUTPUT
</li>
		<li>BLAST die homologen Gensequenzen von NCBI in die Datenbank der interessierenden Spezies, indem Sie [BLAST+ location]/blastp -db $DATABASE -query $FASTA -evalue 1e-10 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -out $OUTPUTeingeben.</li>
		<li>Zeigen Sie die Ausgabedatei mit dem Befehl morean. Kopieren Sie eindeutige Gen-IDs von der interessierenden Spezies in eine neue Textdatei.</li>
		<li>Extrahieren Sie die Sequenzen der Kandidatengene, indem Sie perl -ne 'if(/^>(\S+)/){$c=$i{$1}}$c?print:chomp;$i{$_}=1 if @ARGV' $gene_id.txt $PEP eingeben. FASTA > $OUTPUT.
</li>
	</ol></li>
	<li>Bestätigen Sie die Genannotation mit reziprokem BLAST.<ol>
<li>Gehen Sie im Internetbrowser zu https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.</li>
		<li>Wählen Sie tblastn, fügen Sie dann die Kandidatensequenzen ein, wählen Sie die Datenbank für nicht redundante Proteinsequenzen aus und klicken Sie auf BLAST.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifizieren Sie zusätzliche Gene, indem Sie alle Gene im Genom oder Transkriptom mit Gen-Ontologie-Begriffen (GO) kommentieren (siehe Diskussion).<ol>
<li>Übertragen Sie das Protein FASTA auf den lokalen Computer.</li>
		<li>Laden Sie Blast2GO27,28,29 v. 5.2 herunter und installieren Sie es auf dem lokalen Computer.</li>
		<li>Öffnen Sie Blast2GO, klicken Sie auf Datei, gehen Siezu Laden , gehen Sie zu Sequenzen laden, klicken Sie auf Fasta-Datei laden (fasta). Wählen Sie die FASTA-Datei aus und klicken Sie auf Laden.</li>
		<li>Klicken Sie auf Blast, wählen Sie NCBI Blastund klicken Sie auf Weiter. Parameter bearbeiten oder auf Weiterklicken, Parameter bearbeiten und auf Ausführen klicken, um die ähnlichste Genbeschreibung zu finden.</li>
		<li>Klicken Sie auf Mapping und dann auf Ausführen, um Gene Ontology-Anmerkungen nach ähnlichen Proteinen zu durchsuchen.</li>
		<li>Klicken Sie anschließend auf interpro, wählen Sie EMBL-EBI InterPround klicken Sie auf Weiter. Bearbeiten Sie Parameter, oder klicken Sie auf Weiterund dann auf Ausführen, um nach Signaturen bekannter Genfamilien und Domänen zu suchen.</li>
		<li>Exportieren Sie die Anmerkungen, indem Sie auf Dateiklicken , Exportierenauswählen , auf Tabelle exportierenklicken . Klicken Sie auf Durchsuchen, benennen Sie die Datei, klicken Sie auf Speichern, klicken Sie auf Exportieren.</li>
		<li>Durchsuchen Sie die Anmerkungstabelle nach INTERESSANTEN GO-Begriffen, um zusätzliche Kandidatengene zu identifizieren. Extrahieren Sie die Sequenzen aus der FASTA-Datei (STEP 8.4.5)</li>
	</ol></li>
</ol>9. Phylogenetische Bäume
<ol><li>Laden Sie MEGA30 v. 7.0.26 herunter und installieren Sie es auf Ihrem lokalen Computer.</li>
	<li>Öffnen Sie MEGA, klicken Sie auf Ausrichten, klicken Sie auf Ausrichtung bearbeiten/erstellen, wählen Sie Neue Ausrichtung erstellen, klicken Sie AUF OK, wählen Sie Protein.</li>
	<li>Wenn sich das Ausrichtungsfenster öffnet, klicken Sie auf Bearbeiten,klicken Sie auf Sequenzen aus Datei einfügen und wählen Sie die FASTA mit Proteinsequenzen von Kandidatengenen und wahrscheinlichen Homologen aus.</li>
	<li>Wählen Sie alle Sequenzen aus. Suchen Sie das Armsymbol und bewegen Sie den Mauszeiger darüber. Es sollte sagen, Align-Sequenzen mit dem MUSCLE31-Algorithmus. Klicken Sie auf das Armsymbol und dann auf Protein ausrichten, um die Sequenzen auszurichten. Bearbeiten Sie Parameter, oder klicken Sie auf OK, um sie mit standarden Parametern auszurichten.</li>
	<li>Überprüfen Sie visuell und nehmen Sie alle manuellen Änderungen vor, speichern Und schließen Sie das Ausrichtungsfenster.</li>
	<li>Klicken Sie im MEGA-Hauptfenster auf Modelle, klicken Sie auf Beste DNA/Protein-Modelle (ML) suchen, wählen Sie die Ausrichtungsdatei aus und wählen Sie entsprechende Parameter aus, wie zum Beispiel: Analyse: Modellauswahl (ML), zu verwendender Baum: Automatisch (Nachbar-Verbindender Baum), Statistische Methode: Maximale Wahrscheinlichkeit, Substitutionstyp: Aminosäure, Lücke / fehlende Datenbehandlung: Alle Standorte verwenden, Zweigstellenfilter: Keine.
</li>
	<li>Sobald das beste Modell für die Daten bestimmt ist, gehen Sie zum MEGA-Hauptfenster. Klicken Sie auf Phylogenie, klicken Sie auf Struktur mit maximaler Wahrscheinlichkeit erstellen/testen, und wählen Sie dann ggf. die Ausrichtung aus. Wählen Sie die entsprechenden Parameter für den Baum: Statistische Methode: Maximale Wahrscheinlichkeit, Test der Phylogenie: Bootstrap-Methode mit 100 Replikaten, Substitutionstyp: Aminosäure, Modell: LG mit Freqs. (+F), Raten zwischen Standorten: Gamma verteilt (G) mit 5 diskreten Gammakategorien, Gap/Missing Data Treatment: use all sites, ML heuristische Methode: Nearest-Neighbor-Interchange (NNI).
</li>
</ol>10. Visualisieren Sie die Genexpression mit TPM
<ol><li>Für Trinity gehen Sie auf dem Computercluster in das Verzeichnis, in dem abundance_estimates_to_matrix.pl ausgeführt wurde, und eine der Ausgaben sollte Matrix sein. TPM.not_cross_norm. Übertragen Sie diese Datei auf Ihren lokalen Computer. HINWEIS: Siehe Ergänzende Materialien für die Normalisierung von Kreuzproben.</li>
	<li>Für TPMs aus einer Genomanalyse führen Sie die folgenden Schritte aus.<ol>
<li>Wechseln Sie auf dem Computercluster zum RSEM-Installationsspeicherort. Kopieren Sie rsem-generate-data-matrix, indem Sie scp rsem-generate-data-matrix rsem-generate-TPM-matrix eingeben. Verwenden Sie nano, um die neue Datei zu bearbeiten und ändern Sie "my $offsite = 4" von 4 auf 5 für TPM, es sollte jetzt "my $offsite = 5" heißen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gehen Sie zu dem Verzeichnis, in dem sich die RSEM-Ausgabedateien .genes.results befinden, und verwenden Sie nun rsem-generate-TPM-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT, um eine TPM-Matrix zu generieren. Übertragen Sie die Ergebnisse auf einen lokalen Computer.</li>
	<li>Visualisieren Sie die Ergebnisse in ggplot2.<ol>
<li>Laden Sie R v. 4.0.0 und RStudio v. 1.2.1335 auf einen lokalen Computer herunter.</li>
		<li>Öffnen Sie RStudio auf der rechten Seite des Bildschirms, gehen Sie zur Registerkarte Pakete und klicken Sie auf Installieren. Geben Sie ggplot2 ein und klicken Sie auf Installieren.</li>
		<li>Lesen Sie im R-Skriptfenster die TPM-Tabelle durch Eingabe von data<-read.table("$tpm.txt",header = T)
</li>
		<li>Geben Sie für Balkendiagramme ähnlich Abbildung 4 etwas Ähnliches ein: p<- ggplot() + geom_bar(aes(y=TPM, x=Symbol, fill=Tissue), data=data, stat="identity") fill<-c("#d7191c","#fdae61", "#ffffbf", "#abd9e9", "#2c7bb6") p<-p+scale_fill_manual(werte=füllung) p + theme(axis.text.x = element_text(angle = 90))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, einen Überblick über die Schritte zur Charakterisierung einer Genfamilie unter Verwendung von RNA-seq-Daten zu geben. Diese Methoden haben sich für eine Vielzahl von Arten und Datensätzen4,34,35bewährt. Die hier etablierte Pipeline wurde vereinfacht und sollte einfach genug sein, um von einem Anfänger in der Bioinformatik verfolgt zu werden. Die Bedeutung des Protokolls besteht darin, d...

Fortschritte in sequenzierenden Technologien haben die Sequenzierung von Genomen und Transkriptomen von Nicht-Modellorganismen erleichtert. Neben der erhöhten Machbarkeit der Sequenzierung von DNA und RNA aus vielen Organismen ist eine Fülle von Daten öffentlich verfügbar, um Gene von Interesse zu untersuchen. Der Zweck dieses Protokolls ist es, bioinformatische Schritte zur Untersuchung der molekularen Evolution und Expression von Genen bereitzustellen, die eine wichtige Rolle im interessierender Organismus spielen können.
Die Untersuchung der Evolution eines Gens oder einer Genfamilie kann Einblicke in die Evolution biologischer Systeme geben. Mitglieder einer Genfamilie werden typischerweise durch die Identifizierung konservatorischer Motive oder homologe Gensequenzen bestimmt. Die Evolution der Genfamilie wurde bisher mit Genomen von entfernt verwandten Modellorganismen untersucht1. Eine Einschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass nicht klar ist, wie sich diese Genfamilien in eng verwandten Arten entwickeln und welche Rolle unterschiedliche Umweltselektive Belastungen spielen. In dieses Protokoll schließen wir eine Suche nach Homologen in eng verwandten Arten ein. Durch die Erzeugung einer Phylogenie auf Stammebene können wir Trends in der Evolution der Genfamilie wie konservierte Gene oder linienspezifische Duplikationen feststellen. Auf dieser Ebene können wir auch untersuchen, ob Gene Orthologe oder Paraloge sind. Während viele Homologe wahrscheinlich ähnlich zueinander funktionieren, ist dies nicht unbedingt der Fall2. Die Einbeziehung phylogenetischer Bäume in diese Studien ist wichtig, um festzustellen, ob diese homologen Gene Orthologe sind oder nicht. In Eukaryoten behalten viele Orthologe ähnliche Funktionen innerhalb der Zelle, wie die Fähigkeit von Säugetierproteinen zeigt, die Funktion von Hefeorthologenwiederherzustellen 3. Es gibt jedoch Fälle, in denen ein nicht-orthologes Gen eine charakterisierte Funktion4ausführt.
Phylogenetische Bäume beginnen, Beziehungen zwischen Genen und Arten abzugrenzen, aber die Funktion kann nicht allein auf der Grundlage genetischer Beziehungen zugeordnet werden. Genexpressionsstudien in Kombination mit funktionellen Annotationen und Anreicherungsanalysen bieten eine starke Unterstützung für die Genfunktion. Fälle, in denen die Genexpression quantifiziert und über Individuen oder Gewebetypen hinweg verglichen werden kann, können mehr über die potenzielle Funktion aussagekräftig sein. Das folgende Protokoll folgt Methoden, die bei der Untersuchung von Opsin-Genen in Hydra vulgaris7verwendet werden, aber sie können auf jede Spezies und jede Genfamilie angewendet werden. Die Ergebnisse solcher Studien bilden die Grundlage für die weitere Untersuchung der Genfunktion und Gennetzwerke in Nicht-Modellorganismen. Als Beispiel gibt die Untersuchung der Phylogenie von Opsinen, die Proteine sind, die die Phototransduktionskaskade initiieren, Kontext zur Evolution der Augen und der Lichtdetektion8,9,10,11. In diesem Fall können Nicht-Modellorganismen, insbesondere basale Tierarten wie Nesseltiere oder Ctenophore, die Erhaltung oder Veränderungen der Phototransduktionskaskade und des Sehvermögens über die Kladen12,13,14aufklären. In ähnlicher Weise wird uns die Bestimmung der Phylogenie, Expression und Netzwerke anderer Genfamilien über die molekularen Mechanismen informieren, die Anpassungen zugrunde liegen.

<table><tbody><tr><td>Bioanalyzer-DNA-Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>Nasslabormaterialien</td></tr><tr><td>Bioanalyzer-RNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>Nasslabormaterialien</td></tr><tr><td>BLAST+ v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computercluster* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td></tr> <tr><td>Blast2GO (auf Ihrem PC)</td><td></td><td></td><td>Auf dem lokalen Computer https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td></tr><tr><td>boost v. 1.57.0</td><td></td><td></td><td>Auf Computer-Cluster</td></tr><tr><td>Bowtie v. 1.0.0</td><td></td><td></td><td>Auf Computer-Cluster https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/ Computing-Cluster</td></tr> <tr><td>(dringend empfohlen)</td><td></td><td></td><td>HINWEIS: Analysen von Genomdaten werden am besten auf einem High-Performance-Computing-Cluster durchgeführt, da die Dateien sehr groß sind.</td></tr><tr><td>Manschettenknöpfe v. 2.2.1</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computercluster</td></tr><tr><td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td><td></td><td></td><td>In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td></tr><tr><td>gcc v. 6.4.0</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computercluster</td></tr><tr><td>Java v. 11.0.2</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computercluster</td></tr><tr><td>MEGA7 (auf Ihrem PC)</td><td></td><td></td><td>Auf dem lokalen Computer https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>MEGAX v. 0.1</td><td></td><td></td><td>Auf dem lokalen Computer https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td>Nasslabormaterialien</td></tr><tr><td>perl 5.30.3</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computercluster</td></tr><tr><td>python</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computercluster</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32866</td><td>Nasslabormaterialien</td></tr><tr><td>R v.4.0.0</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computer cluster https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td></tr> <tr><td>RNAlater</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7021</td><td>Nasslabormaterialien</td></tr><tr><td>RNeasy-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Nasslabormaterialien</td></tr><tr><td>RSEM v. 1.3.0</td><td></td><td></td><td>Computersoftware https://deweylab.github.io/RSEM/</td></tr><tr><td>RStudio v. 1.2.1335</td><td></td><td></td><td>Auf dem lokalen Computer https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td></tr><tr><td>Samtools v. 1.3</td><td></td><td></td><td>Computersoftware</td></tr><tr><td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computer cluster https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td></tr><tr><td>STAR v. 2.6.0c</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computer cluster https://github.com/alexdobin/STAR</td></tr><tr><td>StringTie v. 1.3.4d</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computer cluster https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td></tr> <tr><td>Transdecoder v. 5.5.0</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computer cluster https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td></tr><tr><td>Trimmomatic v. 0.35</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computer cluster http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Trinity v.2.8.5</td><td></td><td></td><td>Auf dem Computer cluster https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>Nasslabormaterialien</td></tr><tr><td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>Nasslabormaterialien</td></tr><tr><td>TURBO DNA-freies Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td>Nasslabormaterialien</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Für Downloads und Installationen auf dem Computer-Cluster ist möglicherweise Root-Zugriff erforderlich. Wenden Sie sich an Ihren Netzwerkadministrator.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eine bioinformatik-pipeline zur untersuchung der molekularen evolution und genexpression mit rna-seq

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Das Destillieren und Melden großer Datensätze, wie z. B. das gesamte Genom oder Transkriptomdaten, ist oft eine entmutigende Aufgabe. Eine Möglichkeit, die Ergebnisse aufzuschlüsseln, besteht darin, sich auf eine oder mehrere Genfamilien zu konzentrieren, die für den Organismus und die Studie von Bedeutung sind. In diesem Protokoll skizzieren wir bioinformatische Schritte, um eine Phylogenie zu erzeugen und die Expression von Genen von Interesse zu quantifizieren. Phylogenetische Bäume können Aufschluss darüber geben, wie sich Gene innerhalb und zwischen Arten entwickeln, und die Orthologie offenbaren. Diese Ergebnisse können mit RNA-seq-Daten verbessert werden, um die Expression dieser Gene in verschiedenen Individuen oder Geweben zu vergleichen. Studien der molekularen Evolution und Expression können Modi der Evolution und Erhaltung der Genfunktion zwischen Arten aufdecken. Die Charakterisierung einer Genfamilie kann als Sprungbrett für zukünftige Studien dienen und eine wichtige Genfamilie in einem neuen Genom oder Transkriptom hervorheben.

Die oben genannten Methoden sind in Abbildung 1 zusammengefasst und wurden auf einen Datensatz von Hydra vulgaris Geweben angewendet. H. vulgaris ist ein wirbelloses Süßwasser, das zum Stamm Cnidaria gehört, zu dem auch Korallen, Quallen und Seeanämonen gehören. H. vulgaris kann sich asexuell vermehren, indem sie knospen und sie können ihren Kopf und Fuß regenerieren, wenn sie halbiert werden. In dieser Studie wollten wir die Evolution und Expression von O...

Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Evolution und Expression von Kandidatengenen anhand von RNA-Sequenzierungsdaten zu untersuchen.

Eine Bioinformatik-Pipeline zur Untersuchung der molekularen Evolution und Genexpression mit RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Dieses Protokoll beschreibt bioinformatische Schritte zur Untersuchung der molekularen Evolution und Expression von Kandidatengenen. Hier bieten wir gründliche Anweisungen, damit jeder mit minimaler bioinformatischer Erfahrung dieses Protokoll durchlaufen kann. Diese Pipeline kann auf jeden Organismus und jede Genfamilie angewendet werden.Ein häufiges Problem bei der Bioinformatik ist das Versagen von Shell-Skripten. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, stellen Sie sicher, dass Sie über die aktuellste Software verfügen, lesen Sie die Fehlerdateien und lesen Sie das Handbuch sorgfältig. Melden Sie sich zunächst in einem Terminal oder PuTTY-Anwendungsfenster beim Computerclusterkonto an.Laden Sie auf dem Terminal SRA Toolkit Version 2.8.1 mit Wget herunter und beenden Sie dann die Installation des Programms. Durchsuchen Sie NCBI nach der SRA-Zugangsnummer für die gewünschten Proben und erhalten Sie dann die RNA-Sequenzdaten im Terminalfenster. Rufen Sie zwei FASTQ-Dateien für den Dateityp mit gepaartem Ende ab.Finden Sie das Referenzgenom online, falls vorhanden. Um eine Referenzassembly abzurufen, geben Sie wget in das Terminalfenster ein, und fügen Sie die Linkadresse ein. Falls verfügbar, kopieren Sie auch die GTF-Datei und die Protein-FASTA-Datei für das Referenzgenom.Indizieren Sie das Genom, dann kartenlesen und berechnen Sie die Expression für jede Probe. Benennen Sie die Ergebnisdatei in etwas Beschreibendes um und generieren Sie eine Matrix aller Zählungen. Öffnen Sie ein Internetbrowserfenster und gehen Sie zu NCBI GenBank.Geben Sie in der Suchleiste den Namen des interessierenden Gens und den Namen der eng verwandten Arten ein, die sequenziert wurden. Wählen Sie links neben der Suchleiste Protein aus, und klicken Sie dann auf Suchen. Extrahieren Sie die Sequenzen, indem Sie auf Senden an klicken, und wählen Sie dann Datei aus.Wählen Sie unter Format die Option FASTA aus, und klicken Sie dann auf Datei erstellen. Verschieben Sie die FASTA-Datei der Homologe über ein lokales Terminalfenster oder FileZilla in den Computercluster. Als nächstes suchen Sie mit BLAST+ nach Kandidatengenen Erstellen Sie auf dem Computercluster eine BLAST-Datenbank aus dem Genom oder dem transkriptomüberseten Protein FASTA.BLAST die homologen Gensequenzen von NCBI in die Datenbank der interessierenden Spezies und dann die Ausgabedatei mit dem Befehl mehr anzeigen. Kopieren Sie eindeutige Gen-IDs von der interessierenden Spezies in eine neue Textdatei. Extrahieren Sie die Sequenzen der Kandidatengene.Um die Genannotation mit Reciprocal BLAST zu bestätigen, gehen Sie zum BLAST Local Alignment Search Tool, wählen Sie BLASTP aus, fügen Sie dann die Kandidatensequenzen ein, wählen Sie die nicht redundante Proteinsequenzdatenbank aus und klicken Sie auf BLAST. Öffnen Sie MEGA, klicken Sie auf Ausrichten, dann auf Build-Ausrichtung bearbeiten, wählen Sie Neue Ausrichtung erstellen und klicken Sie auf OK. Wählen Sie Protein aus. Wenn das Fenster Ausrichtung geöffnet wird, klicken Sie auf Bearbeiten.Klicken Sie auf Sequenzen aus Datei einfügen und wählen Sie die FASTA mit Proteinsequenzen von Kandidatengenen und wahrscheinlichen Homologen aus. Wählen Sie Alle Sequenzen aus. Suchen Sie das Armsymbol und bewegen Sie den Mauszeiger darüber.Es sollte sagen, dass Sequenzen mit dem Muskelalgorithmus ausgerichtet werden. Klicken Sie auf das Armsymbol und dann auf Protein ausrichten, um die Sequenzen auszurichten Parameter bearbeiten, oder klicken Sie auf OK, um Standardparameter zu verwenden. Dieses Protokoll wurde auf Gewebe von Hydra vulgaris angewendet, einem wirbellosen Süßwassertiere, das zum Stamm Cnidaria gehört.Opsin-Gene wurden untersucht, um Einblicke in die Evolution der Augen und die Lichtdetektion bei Tieren zu erhalten. Sequenzen für Opsin-verwandte Gene von H.vulgaris und anderen Spezies wurden in eine FASTA-Datei aus der NCBI GenBank extrahiert. Die Opsin-Gene wurden in MEGA ausgerichtet, so dass es möglich war, Hydra-Opsine zu identifizieren, denen eine konservierte Lysin-Aminosäure fehlte, die notwendig war, um ein lichtempfindliches Molekül zu binden.Ein Maximum-Likelihood-Baum wurde mit Opsin-Sequenzen von Hydra vulgaris und anderen Arten generiert. Die Phylogenie legt nahe, dass sich Opsin-Gene durch linienspezifische Duplikationen bei Nesseltieren und möglicherweise durch Tandemduplikation bei H.vulgaris entwickeln. Als nächstes wurde eine differentielle Expressionsanalyse in edgeR durchgeführt, um die absolute Expression von Opsin-Genen zu untersuchen.Um festzustellen, ob ein oder mehrere Opsine im Hypostom oder Kopf hochreguliert sind, wurden paarweise Vergleiche von Hypostom mit der Körpersäule, der Knospenzone, dem Fuß und den Tentakeln durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass 1.774 Transkripte zwischen hypostom und Körpersäule unterschiedlich exprimiert wurden. Die Gene, die über mehrere Vergleiche hochreguliert wurden, wurden bestimmt und eine funktionelle Anreicherung in Blast2GO durchgeführt.Schließlich wurde die absolute Expression von Opsin-Genen in verschiedenen Geweben während verschiedener Stadien der Knospung und während verschiedener Zeitpunkte der Regeneration untersucht. Die visuelle Inspektion der Ausrichtung und des Baums wird bestätigen, ob kandidatengene zur interessierende Familie gehören. Gene, die in der Reihenfolge zu unterschiedlich sind oder eine Gruppe außerhalb von allem anderen, sind wahrscheinlich Teil einer anderen Genfamilie.Die Ergebnisse dieses Protokolls können als hypothesengenerierend angesehen werden. Diese Pipeline kann Kandidatengene hervorheben, die in zukünftigen Studien funktionell untersucht werden sollen. Nachdem wir die Hydra-Opsin-Expression untersucht haben, verwenden wir nun ähnliche Techniken, um verwandte Gene über Arten hinweg zu untersuchen, um Ähnlichkeiten und Funktionsunterschiede zu identifizieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

RNA-Sequenzierung und Bioinformatik-Analysen wurden verwendet, um deutlich und differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren in Lin-CD34 + und Lin-CD34- Subpopulationen von Maus EMLcells identifizieren. Diese Transkriptionsfaktoren könnten eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Wechsel zwischen Selbsterneuerung Lin-CD34 + und teilweise differenziert Lin-CD34- Zellen spielen.

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