Lipidico Injektionsprotokoll für serielle Kristallographiemessungen am australischen Synchrotron

Dieses Protokoll bietet Wissenschaftlern die Möglichkeit, Proteinkristalle zu charakterisieren, die in hochviskose Materialien eingebettet sind, sowie andere weiche Materialien, die derzeit mit bestehenden Aufbauten nur schwer zu charakterisieren sind. Bei dieser Methode werden die Proben in Glasspritzen vorbereitet, die direkt auf den Injektor montiert werden, wodurch das Injektorsystem einfach zu bedienen ist und der Probenabfall minimiert wird. Um Kristalle in einem hochviskosen Medium herzustellen, zentrifugieren Sie zuerst die Kristalllösung bei niedriger Geschwindigkeit, um ein weiches Kristallpellet zu bilden.

Nachdem Sie das überschüssige Medium entfernt haben, befestigen Sie eine Kupplung am Ende einer 100-Mikroliter-Glasspritze und laden Sie 28 Mikroliter der Kristalllösung in den Spritzenzylinder. Führen Sie den Kolben langsam in die Oberseite der Spritze ein und drücken Sie die Lösung vorsichtig bis zum Ende der Kupplungsspitze. Um Blasen zu entfernen, üben Sie mit einem behandschuhten Finger sehr sanften Druck auf die Oberseite der abgestumpften Kupplungsnadelspitze aus, um eine Abdichtung zu erzeugen, und ziehen Sie den Kolben zurück, um die Lösung von der Nadelspitze wegzuziehen und einen Druckaufbau in der Spritze zu erzeugen, und entfernen Sie dann den Finger, um den Druck schnell abzulassen und Blasen in der Spritze zum Platzen zu bringen.

Alternativ können Sie die Spritze in einer Hand halten, wobei die Nadel nach oben zeigt und der Kolben zwischen zwei Fingern eingeklemmt ist, und den Arm, der die Spritze hält, zwei- bis dreimal schnell in eine Richtung drehen. Die resultierende Zentrifugalkraft drückt alle Luftblasen aus der Spritze. Wenn alle Blasen entfernt sind, geben Sie mit einem feinen Spatel 42 Mikroliter Hochvakuum-Silikonfett direkt auf die Oberseite einer zweiten 100-Mikroliter-Spritze und drücken Sie den Kolben bis zum Ende, um alle Luftblasen zu entfernen und sicherzustellen, dass am Ende der Spritze kein Luftspalt entsteht.

Wenn alle Blasen von beiden Spritzen entfernt wurden, halten Sie beide Spritzen an den Enden fest und befestigen Sie die Spritzen mit der Kupplung. Um die Proben miteinander zu mischen, drücken Sie sowohl die Kristalllösung als auch die Silikonfettspritzenkolben vorsichtig nacheinander 50 bis 100 Mal, bis die Materialien gründlich gemischt sind und homogen erscheinen. Visualisieren Sie dann die Kristalle unter einem optischen Mikroskop.

Um die Kristallkonzentration im Silikonfett zu bestimmen, zählen Sie die Anzahl der Kristalle in einem bestimmten Bereich mit Hilfe der Lichtmikroskopbilder. Um die Kristallkonzentration zu verringern, wiederholen Sie die Kristallvorbereitung mit einem größeren Volumen Silikonfett oder verdünnen Sie das Kristallgranulat in Kristallisationspuffer, bevor Sie die Spritze einrichten. Um die Kristallkonzentration zu erhöhen, wiederholen Sie die Kristallvorbereitung mit einem kleineren Volumen Silikonfett und achten Sie darauf, die Viskosität nicht unter 10 Pascal Sekunden zu senken.

Wenn die entsprechende Kristallkonzentration erreicht wurde, geben Sie die gesamte Probe in eine einzige Spritze und ersetzen Sie den Kuppler durch eine Injektionsnadel mit einem Innendurchmesser von 108 Mikrometern, die sehr fest in den Boden der Spritze eingeschraubt ist. Um den Injektor einzurichten, wählen Sie die Werkzeuge und den Homing-Modus und den Minus-Endschalter, starten Sie die Referenzfahrt und lassen Sie die Software laufen, bis die Schraube so weit zurückgezogen ist, dass eine 100-Mikroliter-Spritze unter die Schraube passt. Führen Sie die Nadel einer leeren Spritze durch den Schlitz im Spritzenhalter, um die Spritze auf den Injektor zu montieren, und richten Sie die Spritze gegen den Bügel aus.

Wickeln Sie einen O-Ring über den mittleren Teil der Spritze, befestigen Sie den Ring an den Haken auf beiden Seiten der Spritze und schlingen Sie einen zweiten O-Ring um die Haken im oberen Teil der Spritze. Stellen Sie sicher, dass ein Teil des zweiten O-Rings auf der Glasspritze positioniert ist. Um die Probenspritze vorzubereiten, grundieren Sie die Spritze, setzen Sie die Injektorkappe auf den Kolbenkopf der Probenspritze und legen Sie die Spritze auf den Injektor.

Bewegen Sie die Antriebsschraube an die Oberseite der Kappe. Wählen Sie in der Injektorsteuerungssoftware den Geschwindigkeitsmodus und aktivieren Sie den Geschwindigkeitsmodus. Stellen Sie den Einstellwert auf 3.000 Umdrehungen pro Minute ein und klicken Sie auf Einstellwert übernehmen.

Wenn sich die Schraube der Kappe am Kolbenkopf der Spritze nähert, ändern Sie den Einstellwert auf Null. Sobald der Kontakt hergestellt ist, klicken Sie auf Einstellwert anwenden, um den voreingestellten Wert zu aktivieren und die Schraube sofort zu stoppen. Wackeln Sie dann vorsichtig mit der Kappe, um sicherzustellen, dass sie fest an Ort und Stelle sitzt.

Um den Injektor zu betreiben, ändern Sie den Einstellwert auf 100 Umdrehungen pro Minute und prüfen Sie die Spitze visuell, um die Probe zu beobachten, während sie zu extrudieren beginnt. Verringern Sie nach dem Schließen des Stalls den Einstellwert um 10 Grad, bis ein langsamer, aber stabiler Materialstrom zu beobachten ist. Wenn der Probenstrahl nicht gut fließt, erhöhen Sie den Einstellwert in Schritten von 10 Umdrehungen pro Minute, bis der Strahl gerader wird.

Wenn sich der Strahl nicht stabilisiert, führen Sie einen Probenfänger aus Polystyrol unter den Probenstrahl ein, um die Probe zu führen. Alternativ kann ein Venturi-Saugtrichter in den Probenfänger eingesetzt werden, der an das Luftauslassrohr angeschlossen werden kann, das sich in der Kabine des australischen Synchrotron befindet. Um die Durchflussmenge des Strahls zu bestimmen, verwenden Sie den Durchflussrechner des Lipidico-Geräts.

Die Bestimmung der optimalen Probenlaufgeschwindigkeit für den Injektor ist entscheidend für die Stabilität des Strahls. Eine langsame Durchflussrate führt zu einer Ausdehnung des aus dem Injektor austretenden Silikonfetts, während eine schnellere Durchflussrate einen dünneren Strahl erzeugt. Es wurde regelmäßig ein Aufrollen des viskosen Medienstroms beobachtet.

Um dieses Problem bei hochgeladenen Proben zu lösen, kann ein Polystyrolfänger verwendet werden, um eine schwache elektrostatische Kraft einzuleiten. Bei dieser Analyse wurde eine Glasspritze verwendet, die 26 Mikroliter Lysozymkristalle enthielt, die in Silikonfett suspendiert waren. Innerhalb von 38 Minuten wurde eine ausreichende Datenmenge gesammelt, die die Erstellung der Elektronendichtekarte um die Disulfidbindungen in der Lysozymstruktur ermöglichte.

Denken Sie daran, ein kleines Probenvolumen auf dem Objektträger zu verwenden, um die Kristallkonzentration der Probe zu beurteilen und festzustellen, ob die Viskosität korrigiert werden muss. Die Vielseitigkeit des Injektors ermöglicht die Röntgencharakterisierung anderer hochviskoser Materialien. Zum Beispiel ionische Flüssigkeitsstrukturen aus der Batterieforschung oder kolloidale Materialien aus Milchprodukten.