Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es detaillierte Anweisungen zur Vorbereitung und Injektion von Mückenembryonen für die CRISPR-Cas9-Genomeditierung enthält. Die Hauptvorteile dieser Mikroinjektionstechnik bestehen darin, dass sie eine hohe Überlebensrate der Mücken aufweist und es den Forschern ermöglicht, die Funktion eines Gens zu bestimmen. Dieses Protokoll wurde speziell auf die Injektion von Mücken zugeschnitten, die zur Gattung Culex gehören.

Diese Mücken übertragen mehrere Krankheitserreger, darunter die Viren, die das West-Nil-Fieber und die St.Louis-Enzephalitis verursachen, sowie die Filariennematoden, die den Herzwurm und die Elephantiasis bei Hunden verursachen. Daher werden wir mit Werkzeugen wie der CRISPR-Cas9-Genomeditierung diese wichtigen Krankheitsfaktoren besser verstehen und kontrollieren können. Die Injektion frisch gelegter Insektenembryonen und eine höhere Überlebensrate zu erreichen, erfordert viel Zeit, Übung und Geduld.

Daher empfehlen wir, mehrere Embryonen mit einer farbigen Kochsalzlösung zu injizieren, bevor teure Materialien injiziert werden, um eine Mutation zu erzeugen. Beginnen Sie damit, die Injektionsnadeln mit der Injektionsmischung zu befüllen. Wählen Sie einen Nadelfüller oder eine Gelladespitze, die leicht in das hintere Ende der ausgewählten Injektionsnadel passt.

Achten Sie darauf, dass zwischen dem Ende des Nadelfüllers und der Injektionsnadel etwas Platz ist. Aspirieren Sie vorsichtig einen einzelnen kleinen Tropfen der Injektionsmischung in die Injektionsnadel in der Nähe der Stelle, an der sie sich zu verjüngen beginnt. Befestigen Sie dann die Injektionsnadel am Mikroinjektor.

Legen Sie den Objektträger mit den Embryonen auf den Tisch des Mikroskops. Verwenden Sie zum Öffnen der Nadel einen Startinjektionsdruck von ca. 30 psi und stellen Sie ihn nach Bedarf ein, um eine angemessene Menge der Injektionsmischung abzugeben. Positionieren Sie die Nadel unter einem Präpariermikroskop über dem Mückenembryo und senken Sie die Nadel vorsichtig mit dem Mikromanipulator auf den Embryo

Sobald die Nadel den Embryo kaum berührt, bewegen Sie den Embryo schnell senkrecht zur Längsachse der Nadel. Um festzustellen, ob die Nadel erfolgreich geöffnet wurde, drücken Sie den Injektionsauslöser und prüfen Sie, ob Blasen oder Injektionsmischung aus der Nadel austreten. Wenn nicht, wiederholen Sie den Mückenembryo gegen die Nadel, bis sie offen ist und die Injektionsmischung beim Drücken des Auslösers austritt.

Positionieren Sie den ersten Mückenembryo in der Bildmitte, stellen Sie sicher, dass er scharf ist und platzieren Sie die Nadel über dem ersten Ei. Erhöhen Sie die Vergrößerung am Mikroskop schrittweise und senken Sie die Nadel vorsichtig ab, um sie knapp über dem ersten Embryo zu halten. Fahren Sie fort, bis das Mikroskop seine höchste Vergrößerung erreicht hat und sowohl der Embryo als auch die Nadel scharf sind.

Bewegen Sie den Embryo leicht nach links und senken Sie die Nadel so, dass sie sich in der gleichen Sichtebene wie der Embryo befindet. Berühren Sie den Embryo mit dem Mikroskoptisch vorsichtig mit der Spitze der Nadel. Das schmale hintere Ende des Mückenembryos sollte sich leicht ablenken.

Bewegen Sie mit dem Mikroskoptisch das hintere Ende des Embryos auf die Nadel und beobachten Sie, wie die Nadel in das Chorion des Mückeneis eindringt. Die Nadel sollte gerade die Membran und die ungefähre Position der Polzellen im Embryo durchdringen. Wenn die Injektionsmischung in diesem Bereich platziert wird, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass Mutationen auftreten und in der Keimbahn vererbt werden.

Ziehen Sie den Injektionsauslöser ein- bis dreimal, um die Injektionsmischung in den Embryo zu schießen. Geben Sie eine kleine Menge Injektionsmischung ab, gerade so viel, dass eine kleine Lichtung im Embryoplasma nachgewiesen werden kann. Verwenden Sie den Tisch, um den Embryo nach rechts, weg und von der Nadelspitze weg zu bewegen.

Wenn die Injektion gut verlaufen ist, sollte wenig bis gar keine Flüssigkeit aus dem Embryo austreten. Bewegen Sie den Tisch nach unten, so dass der nächste Embryo vor der Nadel positioniert ist. Und wiederholen Sie die Injektion.

Wenn die Injektionsmischung nicht auszutreten scheint oder wenn nach dem Entfernen der Nadel eine große Menge Flüssigkeit aus dem Embryo austritt, setzen Sie die Injektionsnadel wieder ein und beginnen Sie erneut. Vernichten Sie alle nicht injizierten oder beschädigten Eier. Nachdem alle Embryonen auf dem Objektträger injiziert wurden, waschen Sie das Halogenkohlenwasserstoff ab, indem Sie Umkehrosmosewasser mit einer Spritzflasche auftragen.

Richten Sie den Wasserstrahl auf die Oberseite des Glasdeckglases über den injizierten Embryonen und lassen Sie das Wasser durch das Deckglas fließen, wobei Sie darauf achten müssen, dass der Strahl nicht auf die Embryonen geleitet wird. Decken Sie den Objektträger mit 150 Mikrolitern Wasser ab und legen Sie ihn auf nasses Filterpapier in eine quadratische Petrischale. Inkubieren Sie die Petrischale in einer Klimakammer bei 25 bis 27 Grad Celsius und 70 bis 80 % relativer Luftfeuchtigkeit mit einer langtägigen Photoperiode.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um erfolgreich Embryonen der Nördlichen Hausmücke, Culex pipiens, zu injizieren, um sicherzustellen, dass das vordere Ende des Mückenembryos über den Streifen des medizinischen Verbandes hinausragt, das Überleben der Larven erheblich erhöht und zu qualitativ hochwertigen Nachkommen führt, die in der Lage sind, sich bis zum Erwachsenenalter zu entwickeln und sich fortzupflanzen. Die Sequenzierung zeigte, dass etwa 10% der gescreenten Mücken eine kleine Insertion oder Deletion in der Nähe der Cas9-Schnittstelle der ersten Guide-RNA zeigten, was darauf hindeutet, dass die Polzellen während der Mikroinjektionen erfolgreich angegriffen wurden. Die F1-Individuen paarten sich erfolgreich und zeugten lebensfähige Nachkommen, von denen einige auch die Mutation enthielten.

Bei der Mikroinjektion von Insektenembryonen haben die meisten Menschen Schwierigkeiten, die Nadel zunächst zu öffnen und den Embryo auf die Nadel zu bewegen. Denken Sie daran, dass die Entwicklung dieser Fähigkeiten Zeit und Übung erfordert. Dieses Protokoll kann modifiziert oder angepasst werden, um die Embryonen anderer Stechmücken oder sogar anderer Insektenarten zu injizieren.

Neben der Verwendung dieses Protokolls zum Ausschalten von Genen mit gezielter CRISPR-Cas9-Genomeditierung können die gleichen Techniken verwendet werden, um Plasmide oder Transposons zu injizieren, um entweder Gene zu knock-in-Gene oder zufällige Mutationen zu erzeugen. Mein Labor nutzt diese Technik derzeit, um besser zu verstehen, wie Mücken täglich messen und ihre saisonalen Reaktionen regulieren. Wie wir Forscher jedoch CRISPR-Cas9-Genom-Editing nutzen, um die Biologie mehrerer Organismen besser zu verstehen.