Kristallisation von Proteinen auf Chip durch Mikrodialyse für In Situ-Röntgenbeugungsstudien

Dieses Papier beschreibt das Herstellungsprotokoll von mikrofluidischen Chips, das für die Proteinkristallisation auf dem Chip mit der Dialysemethode und in situ Röntgenbeugungsexperimenten bei Raumtemperatur entwickelt wurde. Einer der Hauptvorteile dieser Mikrochips ist die Wahl der Fertigungsmaterialien, wodurch die Chips für die Erfassung von In-situ-Röntgenbeugungsdaten bei Raumtemperatur kompatibel sind. Die On-Chip-Kristallisationsexperimente erfordern kleine Mengen der Proteinprobe, wodurch die Gesamtkosten für die Arbeit mit diesen hochwertigen Makromolekülen reduziert werden.

Die On-Chip-Kristallisation eliminiert auch die manuelle Ernte der empfindlichen Proteinkristalle, die häufig in Kombination mit Kryokühlung bei konventionellen Kristallographieexperimenten angewendet werden. Darüber hinaus verwenden unsere Mikrochips die Mikrodialyse zur Proteinkristallisation, bei der es sich um eine diffusionsbasierte Methode handelt, die darauf abzielt, die Niederschlagskonzentration durch eine halbdurchlässige Membran zu ausdemaieren, um sich der cromulenten Konzentration für die Proteinkristallisation zu nähern, und eine präzise und reversible Kontrolle über die Kristallisationsbedingungen ermöglicht. Mikrodialyse in Kombination mit Temperaturregelung kann verwendet werden, um die Keimbildung vom Kristallwachstum zu entkoppeln, um Phasendiagramme zu untersuchen, indem die Niederschlagskonzentration während der Verwendung derselben Proteinprobe geändert wird.

Zuerst bereiten 50 Gramm PDMS Silikonbasis und es ist Aushärtungsmittel in einem 10 zu einem Masse Verhältnis. Mischen Sie die beiden Zutaten in einem Becher mit einem Spachtel. Nach dem Mischen die Mischung in eine Vakuumkammer geben, um alle Luftblasen zu entfernen.

Legen Sie 25 Gramm des vorgemischten PDMS in den ersten SU8, um die Muster des mikrofluidischen Kanals und der Säulen bis zu einer Höhe von etwa fünf Millimetern zu beherrschen. Dann gießen Sie die restlichen 25 Gramm des PDMS in den zweiten SU8-Master, der nur die Muster der Säulen enthält. Die beiden PDMS-Schichten in einem Ofen bei 338 Kelvin für eine Stunde aushärten.

Schneiden Sie die ausgehärteten PDMS-Schichten um die Muster der SU8-Master mit einem Skalpell und schälen Sie die PDMS-Formen vorsichtig von den Silikon-Meistern ab. Platzieren Sie die PDMS-Form, die sowohl die Kanäle als auch die Säulen auf einem starren Mikroskopglasschlitten mit nach oben gerichteten Mustern zeigt. Schneiden Sie ein kleines Stück regenerierte Zellulose-Dialysemembran, um die zentrale Säule der PDMS-Form zu bedecken, die als Proteinkammer konzipiert ist.

Der Molekulargewichts-Cutoff der Dialysemembran wird entsprechend dem Molekulargewicht der Proteinprobe und den Niederschlagsfaktoren der Kristallisationslösung gewählt. Dann das trockene Stück der regenerierten Zellulosedialysemembran sorgfältig trennen. Schneiden Sie ein kleines Stück der abgetrennten Dialysemembran.

Die Größe dieses Membranstücks hängt vom Design des Chips ab. Und es hängt speziell von den Dimensionen der zentralen Säule ab. Legen Sie das Stück der Dialysemembran auf die zentrale Säule der PDMS-Form, die auf dem Glasschlitten mit seiner Säule und den nach oben gerichteten Kanälen gestützt wird.

Dann legen Sie die zweite PDMS-Form mit nur den nach unten gerichteten Säulen auf die PDMS-Form, die bereits auf der Glasrutsche unterstützt wird. Richten Sie alle Säulen der beiden PDMS-Formen aus. Das Stück der regenerierten Zellulosedialysemembran ist zwischen den beiden zentralen Säulen der PDMS-Formen eingeklemmt.

Dieser Schritt des Herstellungsverfahrens kann unter einem optischen Mikroskop oder einfach durch eine sorgfältige Inspektion der Ausrichtung aller Säulen durchgeführt werden. Legen Sie die Baugruppe in eine Vakuumkammer und entigelten Sie 30 Minuten lang, um die eingeschlossenen Luftblasen innerhalb der PDMS-Formen zu entfernen und das Einsetzen des fotohärierbaren NOA-Harzes zu verbessern, das im nächsten Schritt dieses Protokolls beschrieben wird. Entfernen Sie die Baugruppe aus der Vakuumkammer und füllen Sie den leeren Raum zwischen den beiden PDMS-Formen mit dem photohärierbaren Thiolin-basierten Harz, NOA 81, durch Kapillarimbibition.

Tragen Sie das Harz auf drei der vier Seiten der Baugruppe auf. Legen Sie die Baugruppe in einen Querlinker und härten Sie das NOA-Harz aus, indem Sie mit einer kollimierten UV-Lampe von 35 Milliwatt pro Quadratzentimeter acht Sekunden lang UV-Licht aussetzen. Schneiden Sie ein 175 Mikrometer dickes PMMA-Stück in die Standardabmessungen eines Mikroskopglasschlittens und schälen Sie den Kunststoffschutz von jeder Seite des PMMA-Stücks ab.

Sobald die erste UV-Belichtung abgeschlossen ist, entfernen Sie die obere PDMS-Form mit einem teilweise vernetzten NOA-Harz, das darauf aufgeklebt ist, aus der unteren PDMS-Form und dem Glasschlitten. Drücken Sie vorsichtig die Montage der oberen PDMS-Form und des teilweise ausgehärteten NOA-Harzes auf das PMMA-Stück. Legen Sie die neue Baugruppe in den Verkreuzer und härten Sie das NOA-Harz 60 Sekunden lang durch UV-Licht ein.

Entfernen Sie vorsichtig die obere PDMS-Form. Der Dialysechip aus dem vollständig verklinken NOA-Harz, das eine regenerierte Zellulose-Dialysemembran einbettet und auf einem PMMA-Stück unterstützt wird, ist fertig. Verkleben Sie handelsübliche Steckverbinder an den Ein- und Auslasspunkten des mikrofluidischen Kanals mit schnellem Epoxidkleber.

Wählen Sie für die Flüssigkeitshandhabung den Durchmesser der PTFE-Rohre basierend auf der Größe der Steckverbinder aus. Die Rohre werden für die Einführung der Kristallisationslösung innerhalb des Fluidkanals des Dialysechips verwendet. Pipette manuell ein Tröpfchen der Proteinprobe im Proteinreservoir direkt auf der Dialysemembran.

Das Volumen des Proteintröpfchens hängt vom Design des verwendeten Mikrochips ab. Und speziell hängt es vom Volumen der zentralen Säule ab, und es kann 0,1 oder 0,3 Mikroliter sein. Tragen Sie eine dünne Schicht Hochvakuumsilikonfett rund um das Proteinreservoir vorsichtig auf.

Schneiden Sie ein kleines Stück PMMA und legen Sie es vorsichtig über die dünne Schicht des Silikonfetts. Schneiden Sie ein Stück Kapton-Band, groß genug, um das PMMA-Stück über dem Proteinreservoir zu bedecken und auf dem NOA-Chip um alle Kanten zu kleben. Die Proteinprobe wird im Reservoir verkapselt und der Chip kann für Kristallisationsexperimente verwendet werden.

Bereiten Sie zunächst ca. 500 Mikroliter der Kristallisationslösung durch Mischen geeigneter Volumen des Puffers und der Niederschlagslösungen vor. Injizieren Sie die Kristallisationslösung im Punkt des Dialysechips durch die Fluidverbinder, entweder manuell mit der Spritze oder mit einem automatisierten druckbetriebenen System. Sobald der Fluidkanal mit der Kristallisationslösung gefüllt ist und keine Luft im Inneren eingefangen ist, versiegeln Sie die Ein- und Auslassöffnungen des Chips mit Parafilmband.

Pipette das entsprechende Volumen der Proteinlösung innerhalb des Proteinreservoirs und verkapseln Sie die Proteinprobe, wie bereits beschrieben. Das Proteinkristallwachstum kann mit einer Digitalkamera visualisiert und aufgezeichnet werden. Für die Herstellung der Dialyse-Mikrochips haben wir optisch transparente und biologisch inerte Materialien ausgewählt, die eine hohe Verträglichkeit für In-situ-Röntgenbeugungsexperimente demonstrieren.

Das Hintergrundrauschen, das von den Materialien erzeugt wird, die das Proteinfach des Chips, der sich im direkten Weg des Röntgenstrahls befindet, umfassen, wurde ausgewertet. Das Proteinfach besteht aus der regenerierten Zellulosedialysemembran, dem Kaptonband, und zwei PMMA-Schichten, von der eine als Substrat der Mikrochips und eine zur Verkapselung der Proteinprobe verwendet wird. In diesem Bild werden das Hintergrundrauschen des Kaptonbandes, der regenerierten Zellulosedialysemembran, der PMMA-Schicht und ihrer Montage dargestellt.

Obwohl das fotohärtige Harz NOA den Hauptkörper der Mikrochips umfasst, ist es in diesen Messungen nicht enthalten, da es nicht Teil der Proteinkammer ist. Diffuse Ringe, die den Wechselwirkungen von Röntgenstrahlen mit den Materialien zugeschrieben werden, können für das Kapton-Band mit der Auflösung von weniger als vier Angstroms, dem PMMA zwischen vier bis acht Angstroms und der Dialysemembran zwischen vier und fünf Angstroms gesehen werden. Das gesamte Hintergrundrauschen, das durch den Chip erzeugt wird, wird hauptsächlich bei der Auflösung unter sechs Angstrom beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Behandlung von Lysozym-Beugungsdaten mit hoher Auflösung nicht beeinträchtigt wird.

Die Mikrochips wurden vor dem Röntgenstrahl mit einer 3D-gedruckten Stütze montiert, die wir für In-situ-Röntgenbeugungsexperimente entwickelt haben, und es kann bis zu drei Chips gleichzeitig aufnehmen. Es wurden Experimente durchgeführt, um die Effizienz der Mikrochips zur On-Chip-Kristallisation modelllöslicher Proteine mit der Mikrodialysemethode zu bewerten. Lysozymkristalle wurden mit 293 Kelvin unter zwei verschiedenen Bedingungen angebaut.

Die erste Kristallisationsbedingung enthielt 1,5 Molnatriumchlorid und 0,1 Molnatriumacetat. Die zweite Kristallisationsbedingung enthielt ein molares Natriumchlorid, 0,1 Mol-Natriumacetat und 30%Polyethylenglycol 400 und wurde ausgewählt, um die Kompatibilität der Mikrochips und der Mikrodialysemethode mit Niederschlagsmitteln mit hohem Molekulargewicht und viskosen Lösungen zu zeigen. Die Kristallisationsexperimente wurden unter statischen Bedingungen durchgeführt.

Sobald Lysozymkristalle auf dem Mikrochip angebaut wurden, wurden sie für In-situ-Röntgenbeugungsexperimente bei Raumtemperatur verwendet. Die Mikrochips wurden mit Hilfe der 3D-gedruckten Stütze an der Strahllinie montiert und komplette Röntgenbeugungsdatensätze aus zwei Lysozymkristallen gesammelt. Nach der Behandlung der Röntgenbeugungsdaten wurde die Elektronendichtekarte eines einzelnen Lysozymkristalls mit 1,95 Angstrom-Auflösung erhalten, wie abbildung A zeigt die Elektronendichtekarte, die mit 1,85 Angstroms Auflösung erhalten wurde.

Nach dem Zusammenführen von zwei Datensätzen aus zwei verschiedenen Lysozymkristallen zeigen beide Elektrodichtekarten detaillierte Strukturinformationen, die durch in situ-Röntgenbeugungsexperimente gewonnen werden können, die direkt an den Dialyse-Mikrochips bei Raumtemperatur, aus einzelnen oder mehreren Proteinkristallen durchgeführt werden. Wir demonstrierten das Herstellungsverfahren für mikrofluidische Geräte, die für die Proteinkristallisation auf dem Chip mit der Mikrodialysemethode entwickelt wurden, und in situ Röntgenbeugungsexperimente bei Raumtemperatur. Wir verwendeten Fertigungsmaterialien mit hoher Röntgentransparenz, kompatibel für die In-situ-Proteinkristallographie.

Die Beugungsdatenerfassung wird automatisiert mit hilfe einer 3D-gedruckten Stütze für die Chips, die direkt in makromolekularen Kristallographiestrahllinien montiert werden kann. Die Vielseitigkeit dieses Mikrochips ergibt sich aus der Verwendung von Mikrodialyse zur reversiblen Kontrolle der Kristallisationsbedingungen und zur Kartenphase mit geringem Proteinvolumen. Das Prototyping des Gerätes ist einfach und ermöglicht die Herstellung von bis zu 30 Mikrochips an einem Tag in einem Reinraum mit relativ preiswerten Materialien.

Wir erwarten, dass diese Eigenschaften der Chips für serielle Röntgenkristallographie-Studien von anspruchsvolleren Proteinzielen verwendet werden können.