Transplantation eines biobedruckten 3D-Patches in einem Murine-Modell des Myokardinfarkts
26. September 2020
Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein biogedrucktes 3D-Pflaster auf das Epikardium von infarktierten Mäusen zu transplantieren, die Herzinsuffizienz modellieren. Es enthält Details über Anästhesie, die chirurgische Brustöffnung, permanente Ligation der linken vorderen absteigenden (LAD) Koronararterie und die Anwendung eines biobedruckten Pflasters auf den Infarktbereich des Herzens.
Alle 10 Minuten hat jemand in Australien einen Herzinfarkt. Dies kann sie mit geschädigtem Herzmuskel verlassen, und das kann zu Herzinsuffizienz führen. Wir haben herausgefunden, dass wir Stammzellen aus Blut oder Haut in schlagende Herzzellen umwandeln können.
Wenn wir dann diese umprogrammierten Zellen über unseren 3D-Bioprinter mit Bioink einsetzen, glauben wir, dass wir Herzpflaster mit Zellen herstellen können, die den eigenen Zellen entsprechen. Eine tief anästhesierte Maus mit Ketamin-Xylazin wird mit einem 20-Meter-Katheter intubiert. Nach der Intubation des Trackers wird die Maus sorgfältig auf ein Heizkissen gelegt und dann mit dem Beatmungsgerät verbunden, das automatisch das Zielvolumen basierend auf dem Mausgewicht festlegt.
Unter einer leichten Anästhesie mit 2%iso fluorid ist die Maus nur mit Jod und Ethanol sauber. Eine linke Lateralthorakotomie wird durchgeführt, um das Herz zu entblößen. Ein Retraktor wird zwischen der dritten und vierten Rippe platziert.
Das Perikard wird sorgfältig geschnitten. Der LAD wurde unter dem Mikroskop identifiziert. Für den LAD-Ligationsschritt ist es wichtig zu vermeiden, dass die Naht durch den LAD schneidet.
Daher wird ein verstärkendes Stück 3,06 Seidennaht auf das Herz gelegt, wie gezeigt, in die gleiche Richtung und nur auf der Oberseite des LAD laufen. Mit einer 7,06 Seidennaht wird der LAD isoliert und dauerhaft ligiert. Dies ermöglicht das Blanchieren des Herzens, das einen Herzinfarkt erhält.
Dies wird zu einem Umbau führen und der linke Ventrikel wird im Laufe der Zeit versagen. Ein 3D-Biodruck-Herz-Patch wird im Labor mit einem 3D-Bioprinter erzeugt. Dies ermöglicht die Schicht für Schicht, Ablagerung von Herzzellen, mit einer Kombination von Zellen und Hydrogelen.
Sie können eine schwebende in diesem Video und jetzt in diesem Bild sehen. Hier ist ein Bild des Patch-Erscheinungsbildes, wenn es durch Epifluoreszenz-Lichtmikroskopie in einem Brunnen einer sechs Brunnenplatte abgebildet wird. Das Pflaster wurde mit Hoechst-Färbung für Zellkerne befleckt, und dieser blaue Fleck hebt auch die autofluoreszierenden Hydrogele hervor.
Dies ist ein intaktes Algengelatine-Patch, das für die Transplantation geeignet ist, ähnlich dem im Video gezeigten. Mit unserer Methode begannen die meisten Patches zwischen 14 und 28 Tagen zu zerfallen, in der Kultur, wie hier in diesem Bild eines anderen Patches gezeigt, der sich aufgelöst hat. Wir fanden heraus, dass die optimale Zeit für die Transplantation von Pflastern zwischen Tag sieben und Tag 14 nach dem Bioprinting war.
Dies war, als Flecken mit Herzzellen zu schlagen begannen, zeigten einen Grad der Gewebereifung, aber bevor Patches begannen zu zerfallen. Das Pflaster wird in den Operationssaal gebracht und langsam und vorsichtig auf das Herz in einem Teil der Maus gelegt. Vorsichtig wird auch in den Bereich des Ableitens verschoben.
Der Retraktor wird langsam entfernt. Schließlich werden die dritte und vierte Rippe mit einer 6,0-Prolen-Nähte zusammengeschlossen. Zusammen mit einem Muskel werden die Rippen geschlossen, gefolgt vom Verschluss der Haut.
Nach Dem Verschluss der Brust wird die Maus mit Antisedan und Furosemid injiziert. Langsam wird die Maus wieder unabhängige Atmungsaktivität, und wird auf Zehenkneifung reagieren. Die Maus wird genau überwacht, und sobald sie aus dem Anästhetikum erwacht, wird sie in ihren eigenen Käfig gelegt.
Dieses Bild zeigt mit dem angenommenen Bereich, wo der biogedruckte Patch auf dem Mausherz sitzt. Abschließend haben wir gezeigt, dass 3D-biobedruckte Algenat-Gelatine-Pflaster mit unserer Methode, auf das Epikardium, in einem Mausmodell des Myokardinfarkts transplantiert werden können. In der Bioprinting-Phase haben Algenat-Gelatine-Hydrogele aufgrund ihrer rheologischen Eigenschaften eine hervorragende Bedruckbarkeit, die eine Extrusion ohne schädliche Zellen ermöglicht, aber auch die biomechanische Festigkeit hat, um ihre Struktur nach dem 3D-Bioprinting und während der Transplantation zu behalten.
Unsere Methode ist wahrscheinlich weit übermöglich und eignet sich auch zum Testen mehrerer Gruppen von 3D-Biodruck-Patches. Zum Beispiel mit unterschiedlichen Zellinhalten.
Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll für die Transplantation eines 3D-biogedruckten Pflasters auf das Epikard von infarzierten Mäusen vor, das eine Herzinsuffizienz modelliert. Die Methode umfasst detaillierte chirurgische Schritte sowie die Verwendung von aus Herzzellen hergestellten biogedruckten Pflastern.
Wichtige Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Herzgewebe-Engineering
- 3D-Bioprinting
- Modelle der Myokardinfarktion
Hintergrund
- Herzinfarkte können zu geschädigtem Herzmuskelgewebe und Herzinsuffizienz führen.
- Stammzellen können zu schlagenden Herzzellen umprogrammiert werden.
- Mittels 3D-Bioprinting lassen sich mithilfe von Bio-Tinte Herz-Patches herstellen.
- Der optimale Zeitpunkt für die Transplantation des Patches ist entscheidend für den Behandlungserfolg.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zum Transplantieren biogedruckter Herzpatches.
- Beurteilung der Durchführbarkeit der Verwendung patientenangepasster Zellen zur Erstellung der Patches.
- Überprüfung der Wirksamkeit der Patches in einem Mausmodell des Myokardinfarkts.
Verwendete Methoden
- Verwendung von Ketamin-Xylazin zur Anästhesie bei Mäusen.
- Linker lateraler Thorakotomieansatz zur Exposition des Herzens.
- Dauerhafte Ligatur des linken vorderen absteigenden Koronararterienastes.
- Transplantation von dreidimensionalen bioprintierten Pflastern auf das Herz.
Hauptergebnisse
- 3D-biogedruckte Patches wiesen eine gute Druckbarkeit und biomechanische Festigkeit auf.
- Die Patches begannen zwischen 14 und 28 Tagen in Kultur zu zerfallen.
- Die optimale Transplantation erfolgte zwischen Tag 7 und 14 nach dem Bioprinting.
- Die Methode eignet sich zum Testen verschiedener Zusammensetzungen biogedruckter Patches.
Schlussfolgerungen
- 3D-biogedruckte Alginate-Gelatine-Pflaster können erfolgreich transplantiert werden.
- Die Technik ist voraussichtlich in der kardiologischen Forschung weit verbreitet anwendbar.
- Zukünftige Studien können unterschiedliche zelluläre Inhalte zur Verbesserung der Ergebnisse untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Dieses Protokoll behebt einen kritischen Engpass in der Forschung zur Herzerneuerung: die zuverlässige in-vivo-Prüfung von 3D-bioprintierten therapeutischen Pflastern in murinen Myokardinfarkt-Modellen. Durch die Verringerung der prozeduralen Variabilität und der mit der chirurgischen Transplantation verbundenen Mortalität ermöglicht es eine statistisch robustere präklinische Bewertung von konstruierten Geweben. Dieser Fortschritt trägt zur Risikominderung früher biologischer Wirkstoffe und Biomaterialien bei, indem er die Reproduzierbarkeit in funktionellen Validierungsstudien verbessert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Beurteilung bioprintierter Pflaster in einem krankheitsrelevanten ischämischen Mikromilieu, um mechanistische Hypothesen zur Gewebeeinlagerung und parakrinen Signalgebung zu validieren.
- Operativer Wert: Standardisiert die chirurgische Applikation komplexer Biologika und verringert so die tierbedingte Variabilität der Einlagerungseffizienz.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine reproduzierbare Plattform zum Vergleich von Pflasterformulierungen (z. B. Zelltypen, Hydrogel-Anteile) anhand von Metriken zur strukturellen Retention und Integration.
- Operativer Wert: Unterstützt die mittelhochdurchsatzfähige Untersuchung von Biomaterial-Kandidaten, indem eine konsistente chirurgische Applikation über verschiedene Studienkohorten hinweg ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die longitudinale Bewertung der durch Patches vermittelten ventrikulären Remodelung und funktionellen Erholung in einem klinisch relevanten Modell ischämischer Verletzung.
- Operativer Wert: Ermöglicht statistisch fundierte Studien mit geringerer Drop-out-Rate und verbessert die Durchführbarkeit von Experimenten zur Dosis-Wirkungs-Beziehung und zur Optimierung des Zeitpunkts.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein, indem sie eine standardisierte Applikation von gewebetechnisch hergestellten Konstrukten nach der Zielvalidierung und vor der Wirksamkeitsprüfung in Krankheitsmodellen ermöglicht.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung bezüglich Zellüberleben, Einwachsen und Sekretion bioaktiver Faktoren im infarzierten Myokard.
- Screening: Ermöglicht den quantitativen Vergleich von Patch-Designs durch standardisierte chirurgische Implantation und Überwachung nach der Transplantation.
- Analytik: Erzeugt histopathologische und funktionelle Messgrößen (z. B. Infarctgröße, Wanddicke), um die Leistungsfähigkeit der Patches zu bewerten.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Maße der Reifung mit in-vivo-Funktionsergebnissen, um Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch zu unterstützen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare chirurgische Plattform zur Bewertung unterschiedlicher kardialer regenerativer Kandidaten über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Vorhersagesicherheit in präklinischen Modellen, indem chirurgische Störfaktoren reduziert werden.
- Operationaler Wert: Steigert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit komplexer Gewebetransplantationsverfahren.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Hintergrundstörungen bei Wirksamkeitsbewertungen und unterstützt klarere Go/No-Go-Entscheidungen in der frühen Entwicklung.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten für die Herzerneuerung auf Grundlage zuverlässigerer präklinischer Daten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der murinen Herzchirurgie, Anästhesie und postoperativen Versorgung.
- Hängt vom Zugang zu Mikronahtwerkzeugen, Beatmungsgeräten und Stereomikroskopen für eine präzise LAD-Ligatur ab.
- Erfordert die Standardisierung von Protokollen zum Umgang mit und zur Positionierung des Pflasters über verschiedene Operateure hinweg.
- Muss die Variabilität in der Reifedauer des Pflasters in Abhängigkeit von der Zellquelle und der Zusammensetzung des Hydrogels berücksichtigen.
- Auf akute und subakute Verletzungsmodelle beschränkt; für chronische Ischämie-Studien ohne Anpassung des Modells nicht geeignet.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Surgical Procedure
1:18
Preparing the Surgical Field
1:31
Left Lateral Thoracotomy
2:00
Left Anterior Descending (LAD) Permanent Coronary Artery Ligation
2:58
3D Bioprinting and Culturing Patches (7-14 days before transplantation)
4:19
Transplantation of the Bioprinted Patch onto the Epicardium
5:39
Mouse Recovery
6:29
Representative Results
6:45
Conclusion
