Live-Bildgebung von Chemokinrezeptoren in Zebrafisch-Neutrophilen während Wundreaktionen

Hier beschreiben wir Protokolle zur Durchführung von Live-Bildgebung und quantitativer Analyse der Chemoattraktanrezeptordynamik in Zebrafisch-Neutrophilen

Neutrophile sind wichtige Entzündungszellen, die als Reaktion auf lokal produzierte chemische Liganden Wunden infiltrieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Rezeptordynamik als Reaktion auf solche Liganden in vivo. Die Verwendung von Chemokinrezeptor-Reportern könnte auf andere physiologische Umgebungen, wie z.B. Infektions- und Tumormodelle, und auf andere Immunzellen ausgeweitet werden.

Die Methode ermöglicht es, nachzuvollziehen, wann und wo im Gewebe Leukozyten chemische Lockstoffmoleküle wahrnehmen. Dies kann ein besseres Verständnis dafür ermöglichen, wie sich Immunantworten entfalten und abklingen. Die Durchführung einer Bauchflossenverletzung bei Zebrafischlarven erfordert eine feine Larvenmanipulation, daher ist etwas Übung an Larven erforderlich, die nicht für experimentelle Zwecke bestimmt sind.

Am Tag 2,5 bis 3,5 nach der Befruchtung werden die anästhesierten Zebrafischlarven unter ein fluoreszierendes Präpariergerät gesetzt und Larven mit transgener Rezeptorexpression ausgewählt. Übertragen Sie die ausgewählten Larven in eine 120-Millimeter-Petrischale, die mit E3-Medium angereichertes Tricain enthält, und schneiden Sie mit einem sterilen Skalpell die Bauchflosse jeder Larve tief genug ein, um eine erhebliche Rekrutierung von Neutrophilen zu verursachen, ohne die kaudalen hämatopoetischen Gewebegefäße zu durchtrennen. Geben Sie 500 Mikroliter 2X Tricain in eine Glasbodenschale, fügen Sie dann 500 Mikroliter Agaroselösung hinzu und mischen Sie unter leichtem Rühren mit der Pipettenspitze.

Übertragen Sie die verwundeten narkotisierten Zebrafischlarven mit einer Pipette in die Schale und richten Sie den Embryo seitlich aus, während Sie ihn vorsichtig nach unten drücken, so dass der kaudale Teil des Fisches so nah wie möglich am Glasboden ist. Wenn der Embryo in Position ist, lassen Sie die Agarose abkühlen. Berühren Sie das Gel nach fünf bis 10 Minuten vorsichtig mit einem kleinen Pinsel, um die Verfestigung zu bestätigen, und geben Sie zwei Milliliter E3-Medium, ergänzt mit 0,2 Milligramm pro Milliliter Tricain, auf die Platte.

Bilden Sie die Wundstelle mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop ab. Übertragen Sie den Embryo so bald wie möglich, nachdem die Agarose ausgehärtet ist, auf die konfokale Bildgebungs-Spinnscheibenplattform und verwenden Sie den Tischjoystick und das Mikroskopobjektiv, um den Fisch zu lokalisieren. Fokussieren Sie mit dem 30- bis 40-fachen Objektiv auf den Wundbereich und wählen Sie das Feld aus, das um die Wunde herum abgebildet werden soll.

Wählen Sie den Laser aus und passen Sie die Belichtungszeit an, richten Sie dann alle 30 Sekunden einen Zeitraffer für die gewünschte Dauer ein und erhalten Sie ein Hellfeldbild, um das Sichtfeld zu dokumentieren. Um die Internalisierung des Neutrophilenrezeptors an der Wundstelle zu quantifizieren, öffnen Sie die Bilddatensätze in Fidschi und verwenden Sie den Zeitschieberegler, um für jeden Datensatz einen repräsentativen Zeitrahmen von Interesse auszuwählen. Erstellen Sie in MATLAB ein neues Skript und fügen Sie Funktionen zum Lesen, Öffnen und manuellen Auswählen von Points of Interest von Bildern hinzu.

Führen Sie das Skript aus, um den interessierenden Frame zu öffnen, und klicken Sie auf die Neutrophilen für die Analyse. Notieren Sie eine Schätzung ihrer Schwerpunkte, sowohl in der ventralen Flossenwunde als auch im kaudalen hämatopoetischen Gewebe. Segmentieren Sie die Neutrophilen in jedem Frame mit der Technik der aktiven Konturen, und erstellen Sie das Skript, um die Berechnung der Graustufen-Kookkurrenmatrix für jedes Neutrophil hinzuzufügen, einschließlich der Berechnung des Kontrasts der Neutrophilen basierend auf der Graustufen-Kookkurrenzmatrix.

Fügen Sie Befehle hinzu, um die Werte für einzelne Neutrophile in der ventralen Flosse separat zu speichern, einschließlich der Berechnung des mittleren Neutrophilenkontrastwerts aus allen neutrophalen Neutrophilen des kaudalen hämatopoetischen Gewebes. Schließt die Normalisierung des Kontrastwerts einzelner Neutrophilen an der Wundstelle zum berechneten mittleren Kontrast der kaudalen hämatopoetischen Gewebeneutrophilen ein, um einen normalisierten Kontrast zu erhalten, der widerspiegelt, wie punktuell das Erscheinungsbild eines Rezeptors innerhalb einzelner ansprechender Zellen im Vergleich zu den nicht reagierenden Kontrollzellen ist. Klicken Sie dann auf Ausführen, um das Skript auszuführen.

Auf die Ventralflossenverwundung folgt eine schnelle Mobilisierung der Neutrophilen aus dem kaudalen hämatopoetischen Gewebe in die Bauchflosse und eine Clusterbildung am Wundrand innerhalb von 30 bis 60 Minuten nach der Verletzungseinleitung. In dieser Analyse wurden die Chemokinrezeptoren CXCR1 und CXCR2, die von Zebrafisch-Neutrophilen exprimiert werden, mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie abgebildet. Das Muster der Rezeptorverteilung wurde mit Hilfe der Kontrastmetrik quantifiziert, die Intensitätsunterschiede zwischen benachbarten Pixeln angibt.

Eine alternative Methode besteht darin, das Verhältnis der Rezeptorspiegel zu den Spiegeln eines kontrollierten Membranmarkers zu quantifizieren. Unter Verwendung der Kontrastmetrik zum Nachweis der Rezeptorinternalisierung in Neutrophilenclustern an der Wunde können sichtbare Unterschiede zwischen dem Transport von CXCR1 und CXCR2 in Neutrophilen an der Wundstelle quantifiziert werden. In dieser Analyse nahm beispielsweise die Internalisierung von fluoreszenzmarkiertem CXCR1 in Zellen, die sich an der Wundstelle befanden, im Laufe der Zeit zu, während fluoreszenzmarkiertes CXCR2 auf den Membranen von Neutrophilen an der Wunde verblieb.

Die Unterdrückung von CXCR1- und CXCR2-Liganden durch die Behandlung mit Morpholino führt zu einer differentiellen Internalisierung von fluoreszenzmarkiertem CXCR1 an der Wundstelle. Darüber hinaus wird in frühen Embryonen fluoreszenzmarkiertes CXCR1 in Embryonen, in denen der Rezeptorligand koexprimiert wird, deutlich internalisiert. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, dass die Bildgebung so schnell wie möglich nach der Wunde durchgeführt werden sollte, um die Rezeptordynamik während der Rekrutierung von Neutrophilen zu den Wunden zu erfassen.

Nach der Bildgebung von Chemokinrezeptoren in normalen Larven können Forscher eine vergleichende Bildgebung bei mutierten Larven mit fehlregulierter Entzündung durchführen.