Nanopartikel-Tracking-Analyse von Gold-Nanopartikeln in wässrigen Medien durch einen interlaborativen Vergleich

Dieses Protokoll verwendet eine Nanopartikel-Tracking-Analyse, um genaue, zuverlässige und reproduzierbare Messungen der hydrodynamischen Durchmesser von Nanomaterialien von Interesse durchzuführen. Die Methode ist schnell und einfach durchzuführen und erleichtert die Messung des hydrodynamischen sphärischen äquivalenten Durchmessers von Partikeln durch visuelle Echtzeit-Analyse von Partikeln für Partikel und minimale Probenvorbereitung. Vor der Durchführung einer Messung ist das Volumen des Reinstwassers, das für die Analyse verwendet werden soll, durch einen 0,02-Mikron-Spritzenvorsatzfilter zu filtrieren.

Verdünnen Sie die Probe entsprechend im gefilterten Wasser. Für diese 60 Nanometer große kolloidale Golddispersionsprobe volumetrisch um den Faktor 50 verdünnen. Schließen Sie das NTA-Instrument, die Spritzenpumpe und den Computer an und schalten Sie die Hardware und Software ein.

Entfernen Sie das Lasermodul aus dem System und trocknen Sie die Glasoberflächen sowie die internen LVFC-Kanäle, Schläuche und Fluidikanschlüsse mit einem Tuch und Druckluft vollständig ab. Platzieren Sie den LVFC auf dem Lasermodul und befestigen Sie ihn dann mit den vier Schrauben, mit denen Sie sie diagonal festziehen. Befestigen Sie den Auslassschlauch an der Öffnung auf der rechten Seite der Zelle.

Führen Sie den Zulaufschlauch in die Abfallflasche ein und spülen Sie 900 Mikroliter Reinigungslösung so schnell wie es der Gegendruck zulässt. Ersetzen Sie die am Einlassschlauch befestigte Spritze durch eine neue Spritze mit einem Milliliter gefiltertem Wasser und verbinden Sie den Einlassschlauch mit dem linken Anschluss der Durchflusszelle. Führen Sie dann langsam ca. 500 Mikroliter Flüssigkeit in die Probenkammer ein und achten Sie darauf, dass während der Beladung keine Luftblasen entstehen.

Um das Lasermodul zu laden, setzen Sie die wassergefüllte LVFC in das Gerät ein und verriegeln Sie die Zelle. Befestigen Sie die Spritze und die Halterung der Spritzenpumpe und klicken Sie in der Softwareoberfläche auf Kamera starten, um die Kamera zu initialisieren. Klicken Sie auf der Registerkarte "Hardware" auf "Punkt", um die Referenzposition zu verschieben und die Kameraebene auf 16 festzulegen.

Passen Sie den Fokus manuell an, um das Verdünnungsmittel auf Partikel zu überprüfen, und klicken und ziehen Sie mit der linken Maustaste im Hauptansichtsfenster, um die Position des Sichtfelds anzupassen und nach Partikeln zu suchen. Um das System zu reinigen, ersetzen Sie die Spritze durch eine Spritze, die nur mit Luft gefüllt ist, und ersetzen Sie das Wasser in der Kammer langsam durch Luft. Entfernen Sie die Zelle aus dem Lasermodul aus dem Gerät und trennen Sie die Schlauchstücke.

Reinigen Sie das optische Glas des Lasermoduls und die Glasoberflächen des LVFC mit Wasser und trocknen Sie es mit einem Taschentuch und Druckluft. Nachdem Sie das LVFC und das Lasermodul wieder zusammengebaut und den Schlauch grundiert haben, schließen Sie eine Spritze mit einem Milliliter der 60-Nanometer-Goldnanopartikelsuspension an den unteren Anschluss an und injizieren Sie langsam 750 Mikroliter der Probe in die LVFC-Kammer. Nachdem Sie das Lasermodul geladen und die Kamera initialisiert haben, klicken Sie auf Streuen, um den Referenzfokus in Position zu bringen und zu bestätigen, dass der Fokus korrekt eingestellt ist, um ein klares Bild der Partikel zu erhalten.

Vergewissern Sie sich, dass das Sichtfeld in Bezug auf die Position des Laserstrahls zentral eingestellt ist, und führen Sie die Auto-Setup-Funktion aus, um den Fokus und die Kameraebene automatisch zu optimieren und sicherzustellen, dass die optimale Bildqualität erreicht wird. Um die Probe zu analysieren, öffnen Sie die Registerkarte Standard Measurement Standard Operating Procedure und stellen Sie das Gerät so ein, dass es fünf 60-Sekunden-Videos bei langsamem und konstantem Fluss aufnimmt. Legen Sie dann den Dateinamen und den Speicherort für die Daten fest und starten Sie die Ausführung.

Um die Daten zu analysieren, ziehen Sie den Schieberegler auf der Registerkarte Erkennungsschwellenwert, um den Nachweisschwellenwert so festzulegen, dass so viele sichtbare Partikel wie möglich erkannt und verfolgt werden. Stellen Sie sicher, dass nicht mehr als fünf blaue Kreuze beachtet werden, die auf Lärm hinweisen. Um die Partikelverfolgungs-Analysevideos automatisch zu verarbeiten, klicken Sie auf "Einstellungen", "OK" und belassen Sie alle Verarbeitungsparameter auf den automatischen Einstellungen.

Nachdem die Datenverarbeitung abgeschlossen ist, exportieren Sie die Daten als CSV-Formularergebnisdatei. Hier werden die Ergebnisse des Ringvergleichs gezeigt, die mit verschiedenen Konfigurationen von Nanopartikel-Tracking-Analysegeräten erzielt wurden. Mit Ausnahme von Labor sechs war die Wiederholbarkeit zwischen den fünf Erfassungswiederholungen gut, obwohl mehrere Labore eine höhere Modusgröße als erwartet aufzeichneten.

Die Genauigkeit der Nanopartikel-Tracking-Analyseergebnisse aus der dritten Runde wurde dadurch verbessert, dass alle Labore die gleichen Standardarbeitsanweisungen und Geräteeinstellungen mit einem durchschnittlichen Modus von 62,02 plus oder minus 1,97 Nanometern in allen Laboren implementierten. Der mittlere Durchmesser der Partikel kann mit Hilfe von Transmissionselektronenmikroskopiebildern als ergänzende Technik zur NTA berechnet werden, um die Partikelgröße, Morphologie und das Aspektverhältnis zu validieren. In dieser Analyse scheinen die Partikel überwiegend kugelförmig mit einem durchschnittlichen Aspektverhältnis von 1,1 zu sein.

Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Durchflusszelle mit geringem Volumen vor der Verwendung gut gereinigt wird, dass die Probe angemessen verdünnt, gut geladen und fokussiert ist und dass die SOP befolgt wird. Diese Methode kann für jede andere Nanopartikelcharakterisierung verwendet werden, einschließlich Exosomen und Viren, um Stabilitätsstudien und qualitätskontrollierte Prozesse zu unterstützen.