Name: Bewertung der angiogenetischen Eigenschaften von Stammzellen von Eierstockkrebs mit dem dreidimensionalen Kokultursystem NICO-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Erfahren Sie, wie das 3D-Kokultursystem NICO-1 die angiogenetischen Eigenschaften von Eierstockkrebs-Stammzellen untersucht. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht die Analyse von Tumorangiogenese und Mikroumgebungsremodellierung.

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Diese Arbeit wurde durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research C (Grant no. 19K09834 to K.N.) des japanischen Ministeriums für Bildung, Wissenschaft und Kultur unterstützt.

Alle Verfahren wurden gemäß dem Protokoll durchgeführt, das von der Ethikkommission für das Wohlergehen der Menschen genehmigt wurde. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung für die Verwendung ihrer Proben in der Forschung, und die Entnahme und Verwendung von Geweben für diese Studie wurde vom Human Genome, Gene Analysis Research Ethics Committee der Teikyo University genehmigt.
1. Isolierung und Kultur von Eierstockkrebs-Stammzellen (OCSCs) von Patientinnen mit Eierstockkrebs und Aszites in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe 2
<ol><li>Isolieren Sie Krebsstammzellen aus humanem Eierstockkrebsaszitese, der durch Parazentese gewonnen wird. Sammeln Sie mindestens 100-250 ml Aszites von Patienten, um eine ausreichende Anzahl von Krebsstammzellen zu entnehmen. Zusätzlich können die Expressionsprofile von Krebsstammzellmarkern (d. H. EpCAM, Calretinin, CD133, CD44, CD45, ALDH1 und Oct4) und Eierstockkrebsmarkern (pAX-8, WT-1) durch Durchflusszytometrie ausgewertet werden.<ol><li>Zentrifugieren Sie den menschlichen Eierstockkrebs Aszites bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur innerhalb von 24 h nach Aszitesaspiration.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml OCSC-Medium und 8 ml 30% Histodenz/phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) hinzu.</li>
		<li>OCSC-Medium vorbereiten: StemPro hESC-Ergänzung, DMEM⁄F-12 mit L-Glutamin (GlutaMAX-Medium), 25% BSA, 100 μM 2-Mercaptoethanol, 8 ng/mL FGF BASIC, 10 μM Insulin und 20 μM Y-27632.</li>
		<li>2 mL OCSC-Medium werden der Zelllösung in Schritt 1.1.2 vorsichtig in einem 15-ml-Röhrchen überlagert und bei 450 x g 20 min bei Raumtemperatur in einem Schaufelrotor ohne Bremsen zentrifugiert.</li>
		<li>Übertragen Sie die OCSC-Schicht (ungestört an der Interphase) vorsichtig in ein neues 15-ml-Röhrchen mittels Transferpipette.</li>
		<li>Mit PBS bis zu 15 ml füllen. Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entfernen.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in OCSC-Medium und säen Sie auf einer Kulturschale mit extrem niedriger Bindung; Kulturen sollten bei 37 °C in 5% CO2 gehalten werden.</li>
		<li>Wechseln Sie das Medium alle drei Tage. Stellen Sie die Kulturschale vorsichtig für ca. 1 Minute auf, verwerfen Sie einen Teil des Überstands und fügen Sie das neue Medium hinzu.</li>
	</ol></li>
	<li>Verabschiedung von CSCs<ol><li>OCSCs in einem 15-ml-Röhrchen sammeln und bei 200 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.</li>
		<li>Den Überstand entfernen, mit PBS füllen und bei 200 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml der Zellablösungslösung aus proteolytischen und kollagenolytischen Enzymen (z. B. AccuMax) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 10 min.</li>
		<li>Durch Pipettieren gut mischen und bei 37 °C 5 min inkubieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen in einer einzigen Suspension befinden.</li>
		<li>Gut durch Pipettieren mischen, mit PBS füllen und bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in OCSC-Medium für die anschließende Aussaat auf Kulturschalen mit extrem niedriger Bindung und die Wartung bei 37 °C in 5%CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. HUEhT-1 Endothelzellkultur
<ol><li>Passage von HUEhT-1-Zellen<ol><li>Entfernen Sie das Medium aus der HUEhT-1-Kulturschale und waschen Sie die Zellen mit PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml 0,025% Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 3 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Fügen Sie 5 ml Endothelzellwachstumsmedium 2 hinzu, sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in HUEhT-1-Medium und säen Sie die Zellen auf kollagenbeschichteten Kulturschalen, gefolgt von einer Wartung bei 37 °C in 5%CO2.</li>
		<li>Wechseln Sie das Medium alle drei Tage.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vorbereitung der NICO-1 Kokulturplatte für den Röhrchenbildungstest mit HUEhT-1-Zellen
<ol><li>NICO-1 zusammensetzen und mit dem extrazellulären Hydrogel auf Matrixbasis (Matrigel-Matrix) beschichten.<ol><li>Nico-1 auf einer Seite nach den Anweisungen des Herstellers montieren und auf Eis halten.</li>
		<li>Decken Sie die Oberfläche von NICO-1 mit 300 μL kaltem PBS ab und entfernen Sie dann den Puffer.</li>
		<li>Fügen Sie 300 μL gekühltes Hydrogel auf Basis der extrazellulären Matrix hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 60 min.</li>
		<li>Um das Gleichgewicht zu erreichen, tauchen Sie den Filter mit 100% Ethanol ein und waschen Sie dann einen 13 mm ICCP-Filter (0,6 μm) mit PBS für 1 min.</li>
		<li>Montieren Sie den NICO-1 einschließlich der beiden Hauptkörperteile A (rechte Kammer) und B (linke Kammer) zusammen mit dem O-Ring und dem ausgeglichenen Filter.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Aussaat von HUEhT-1-Zellen und CSCs auf das NICO-1-System
<ol><li>Herstellung von HUEhT-1-Zellsuspensionen durch Trypsinisierung der Zellmonoschichten und Resuspendierung der Zellen im Endothelzellwachstumsmedium mit 2% fetalem Kälberserum.</li>
	<li>Fügen Sie 1,2 ml der Zellsuspension (1,5 x 105 Zellen) zu jeder extrazellulären Matrix-basierten Hydrogel-beschichteten Vertiefung hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie 1,5 ml OCSCs, die fünf Tage lang kultiviert wurden, in die andere Vertiefung hinzu.</li>
	<li>NICO-1 bei 37 °C in 5%CO2 inkubieren; Die Tubusbildung kann unter dem Mikroskop beobachtet werden und die Netzwerkbildung auf extrazellulärem Matrix-basiertem Hydrogel, gemessen anhand der Anzahl der Zweige.</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%2C+a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).</li>
<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+development+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li>
<li>Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+fate+in+cancer+growth%2C+progression+and+therapy+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal%2FActivin+signaling+drives+selfrenewal+and+tumorigenicity+of+pancreatic+cancer+stem+cells+and+provides+a+target+for+combined+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).</li>
<li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).</li>
<li>Ohata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+stem-like+cell+regulator+CD44+by+Rho+kinase+inhibition+contributes+to+the+maintenance+of+colon+cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+in+vitro+model+of+ovarian+cancer+stem-like+cells+with+an+enhanced+proliferative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity.</a> Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li>
<li>Zong, X., Nephew, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+role+in+metastasis+and+opportunity+for+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 934(2019).</li>
<li>Lizárraga-Verdugo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+its+role+in+angiogenesis+and+vasculogenic+mimicry+in+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers.</a> Frontiers in oncology. 10, 413(2020).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+insert+co-culture+system+of+two+cellular+types+in+the+absence+of+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Richardson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell-mediated+mesenchymal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation.</a> Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).</li>
<li>Plotnikov, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).</li>
<li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+of+IFN-gamma+in+priming+MSC-mediated+suppression+of+T+cell+proliferation+through+up-regulation+of+B7-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1.</a> Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).</li>
<li>Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+canine+mesenchymal+stem+cells+with+primary+bone-derived+osteoblasts+promotes+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cell%2Fmesenchymal+stem+cell+interaction+in+co-culture+and+its+implications+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).</li>
<li>Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+from+the+retropatellar+fat+pad+and+peripheral+blood+stimulate+ACL+fibroblast+migration%2C+proliferation%2C+and+collagen+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression.</a> Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+%26+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).</li>
<li>Burger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+bevacizumab+in+the+primary+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).</li>
<li>Goel, H., Mercurio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+targets+the+tumour+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">VEGF targets the tumour cell.</a> Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+bevacizumab+and+murine+VEGF-A%3A+a+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das vorgestellte Protokoll beschreibt, wie die Tumormikroumgebung von OCSCs in einer In-vitro-Umgebung nachgeahmt werden kann. Die Hauptkomponente der Methode bildet das hochreproduzierbare Kokulturmodell, das mit dem NICO-1-System, einem indirekten Transwell-Kokultursystem, erhalten wurde. Viele der derzeit verfügbaren Kokulturmodelle untersuchen die Auswirkungen eines direkten Zell-Zell-Kontakts auf kokultivierte Zellpopulationen 12,13,14,15,16,17,18.</sup...

Eierstockkrebs ist die achthäufigste bösartige Erkrankung bei Frauen weltweit, mit etwa 300.000 neuen Diagnosen und geschätzten 180.000 Todesfällen proJahr1. Bei der Erstdiagnose zeigt sich Eierstockkrebs oft mit schweren Symptomen, wobei sich etwa 75% der Patientinnen bereits im Stadium III-IV befinden. Dementsprechend beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate <30% und die Sterblichkeitsrate ist die höchste bei gynäkologischen Krebserkrankungen2, wobei die Effizienz der Behandlung von Eierstockkrebs stark von klinischen Faktoren wie der erfolgreichen Durchführung einer Debulking-Operation, der Resistenz gegen Chemotherapie und dem Wiederauftreten nach der Ersttherapie abhängt.
Eierstockkrebsgewebe sind hierarchisch organisiert, wobei nicht alle Tumorkomponenten gleichermaßen in der Lage sind, Nachkommen zu erzeugen. Die einzigen Zellen, die in der Lage sind, sich selbst zu erneuern und eine heterogene Tumorzellpopulation zu produzieren, gelten als Krebsstammzellen (CSCs)3. Die Selbsterneuerung des CSC und die Tumorinitiierung werden von der Förderung der Angiogenese begleitet, um ihre Tumormikroumgebung umzugestalten, um eine unterstützende Nische zu erhalten. Bisherige Modelle konnten jedoch nicht für In-vitro-Analysen verwendet werden, da die Kultivierung von CSCs aus klinischen Proben aufgrund der Störung von Sphäroiden nach mehrfachem Durchgang nur begrenzt reproduzierbar ist. In jüngerer Zeit wurden experimentelle Methoden zur Kultivierung von CSCs von Patienten für mehrere Anwendungen entwickelt 4,5,6,7. Insbesondere durch die Ausnutzung der Eigenschaft von CSCs, durch Bildung von Sphäroiden in ultraniedrigen Bindungsplatten mit serumfreiem Medium zu wachsen, werden die kultivierten CSCs dazu gebracht, einen Stammzelloberflächenmarker zu exprimieren, der in normalen Tumorzellen mit Multilineage-Differenzierungspotential nicht exprimiert wird 8,9.
Neuere Daten haben gezeigt, dass die Persistenz ruhender ovarieller (O)CSCs, visualisiert als Verbreitung am Peritoneum, mit ihrer Regeneration als rezidivierende Tumoren assoziiert ist10. Das Verständnis der molekularen und biologischen Merkmale von OCSCs kann daher eine effektive Ausrichtung und Eradikation dieser Zellen ermöglichen, was zu einer möglichen Tumorremission führt. Insbesondere ist wenig über die zellulären und molekular-mechanistischen Merkmale der CSC-Rollen in der Angiogenesebekannt 11. Daher haben wir im vorliegenden Protokoll patientenabgeleitete OCSCs in einer In-vitro-Umgebung verwendet, um die angiogene Eigenschaft von Endothelzellen unter Verwendung des Kokulturmodells zu untersuchen, das die Tumormikroumgebung von CSCs und Endothelzellen an der metastatischen Stelle im klinischen Umfeld nachahmen kann. Da die Neovaskularisation einen kritischen Prozess darstellt, der zur Unterstützung des Tumorwachstums und der Metastasierung notwendig ist, wird ein besseres Verständnis ihres Mechanismus die Entwicklung einer neuartigen zielgerichteten Therapie für OCSCs an der metastatischen Stelle ermöglichen.
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um den Neovaskularisationsschritt um die CSCs zeitlich zu visualisieren. Der Vorteil des Protokolls besteht darin, vollständig reproduzierbare Untersuchungen mit dem 3D-Kokultursystem NICO-1 zu ermöglichen, wodurch die Auswirkungen der OCSC-abgeleiteten Tumorinitiierungsfähigkeit während der Endothelzellangiogenese auf Patienten beobachtet werden können.

<table><tbody><tr><td>0,025% Trypsin&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipette</td><td>Thermo</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>1250 &micro; L Pipettenspitze</td><td>QSP</td><td>T112XLRS-Q</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Nunc</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Pipettenspitze</td><td>QSP</td><td>T110RS-NEW</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipette</td><td>Thermo</td><td>170366N</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>AccuMAX</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>BioCoatTM Collagen I 60mm Dish</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>KUBOTA</td><td>2800</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Platten</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium 2&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-22011&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>WAKO</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>SIGMA</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>HUEhT-1 Zelle</td><td>JCRB Zellbank</td><td>JCRB1458</td><td></td></tr><tr><td>ICCP Filter 0,6 &micro; m</td><td>Ginrei Lab.</td><td>2525-06</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, humanes</td><td>SIGMA (Roche)</td><td>11376497001</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>PerkinElmer</td><td>ARVO MX-flad</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Yokogawa</td><td>CQ-1</td><td></td></tr><tr><td>NICO-1</td><td>Ginrei Lab.</td><td>2501-02</td><td></td></tr><tr><td>OptiPlate-96</td><td>PerkinElmer</td><td>6005290</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Thermo (Gibco)</td><td>A1000701</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>FALCON</td><td>357575</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>WAKO</td><td>253-00513</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der angiogenetischen eigenschaften von stammzellen von eierstockkrebs mit dem dreidimensionalen kokultursystem nico-1

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Krebsstammzellen (CSCs) befinden sich in einer unterstützenden Nische und bilden eine Mikroumgebung, die aus benachbarten Stromazellen, Gefäßen und extrazellulärer Matrix besteht. Die Fähigkeit von CSCs, an der Entwicklung von Endothel teilzunehmen, stellt ein wichtiges Merkmal dar, das direkt zum allgemeinen Verständnis der Mechanismen der Tumorgenese und Tumormetastasierung beiträgt. Ziel dieser Arbeit ist es, eine reproduzierbare Methodik zu etablieren, um die Tumorinitiationsfähigkeit von Eierstockkrebsstammzellen (OCSCs) zu untersuchen. Hier untersuchten wir den Neovaskularisationsmechanismus zwischen Endothelzellen und OCSCs sowie die morphologischen Veränderungen von Endothelzellen mit dem in vitro Kokulturmodell NICO-1. Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung des Neovaskularisationsschritts, der die OCSCs umgibt. Die Technik kann Aufschluss über die angiogenetischen Eigenschaften von OCSCs bei Tumormetastasen geben.

Wir sammelten Aszitesflüssigkeiten, die von Patienten mit fortgeschrittenem Eierstockkrebs während einer Operation oder Parazentese gewonnen wurden, um eine langzeitstabile Kultur für Sphäroide durchzuführen. Hier stellen wir Fälle einer langfristigen Sphäroidkultur von ovariellen CSCs vor, die als CSC1 und CSC2 bezeichnet werden. Beide Zelllinien tragen die gleichen diagnostischen und histologischen Profile. Die mechanistische Rolle von OCSCs, die der Interaktion mit Endothelzellen zugru...

Eierstockkrebs-Stammzellen (OCSC) sind verantwortlich für Krebsentstehung, Rezidiv, therapeutische Resistenz und Metastasen. Es wird angenommen, dass die OCSC-Gefäßnische die Selbsterneuerung von OCSCs fördert, was zu Chemoresistenz führt. Dieses Protokoll bildet die Grundlage für die Etablierung eines reproduzierbaren OCSC-Gefäßnischenmodells in vitro.

Bewertung der angiogenetischen Eigenschaften von Stammzellen von Eierstockkrebs mit dem dreidimensionalen Kokultursystem NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Eierstockkrebs hat eine hohe Sterblichkeitsrate bei gynäkologischen Malignomen. Stammzellen von Eierstockkrebs und ihre vaskuläre Nische sind in der Lage, die Mikroumgebung des Tumors umzugestalten. Bisherige Stammzellmodelle von Eierstockkrebs erlaubten die detaillierte Analyse jedoch aufgrund ihrer begrenzten Reproduzierbarkeit nicht.Zu den Vorteilen unseres Protokolls gehört die Reproduzierbarkeit seines 3D-Co-Kultursystems, das die Untersuchung der Auswirkungen von Tumorinitiierungsfähigkeiten aus Eierstockkrebsstammzellen bei der Patientin während der Angiogenese erleichtert. Das Verfahren wird von Yuko Miyagawa, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus unserem Labor, vorgeführt. Um Krebsstammzellen aus menschlichem Eierstockkrebs-Aszites zu isolieren, die mittels Parazentese gewonnen wurden, entnehmen Sie 100 bis 250 Milliliter Aszites der Patientin und zentrifugieren Sie die Probe innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme.Resuspendieren Sie die Pellets in zwei Millilitern OCSC-Medium und fügen Sie jeder Probe acht Milliliter 30 % nichtionisches Dichtegradientenmedium in PBS hinzu. Übertragen Sie die Zellsuspensionen in einzelne 15-Milliliter-Röhrchen und schichten Sie vorsichtig zwei Milliliter zusätzliches OCSC-Medium auf die Zelllösung in jedem Röhrchen. Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation und überführen Sie das OCSC in der Interphase vorsichtig in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.Waschen Sie die gesammelten Zellen mit einem vollen Volumen PBS und resuspendieren Sie die Pellets in frischem OCSC-Medium. Säen Sie die Zellen auf Kulturschalen mit extrem geringer Bindung und inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach fünf Tagen Kultur sammeln Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen pro Platte durch Zentrifugation.Nach einer zweiten Zentrifugation in PBS resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter proteolytischer und kollagenolytischer Enzymzellablösungslösung für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation durch Pipettieren gut mischen und die Zellen für weitere fünf Minuten auf 37 zurückbringen. Am Ende der Inkubation mischen Sie die Zellen erneut durch Pipettieren und füllen das Röhrchen mit PBS zum Waschen durch Zentrifugation.Dann resuspendieren Sie das Pellet in OCSC-Medium und säen Sie die Zellen auf neuen Kulturschalen mit extrem niedrigem Attachment. Um eine HUEhT-1-Endothelzellkultur einzurichten, waschen Sie die HUEhT-1-Zellen mit PBS und behandeln Sie die Zellen drei Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,025 %Trypsin. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit fünf Millilitern Endothelzellwachstumsmedium zwei und sammeln Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen zur Zentrifugation.Dann resuspendieren Sie das Pellet in HUEhT-1-Medium in einer Konzentration von 1,5 x 10 bis zur fünften Konzentration und säen Sie die Zellen auf mit Kollagen beschichteten Kulturschalen aus. Um eine interaktive Co-Kulturplatte für einen Röhrchenbildungsassay einzurichten, montieren Sie das NICO-1 Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers und stellen Sie das System auf Eis. Waschen Sie die Baugruppe mit 300 Mikrolitern kaltem PBS, bevor Sie dem Gerät 300 Mikroliter gekühltes Hydrogel auf Basis extrazellulärer Matrix für eine 60-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzufügen.Tauchen Sie am Ende der Inkubation einen sterilen 13-Millimeter-Filter in 100 % Ethanol, gefolgt von einem einminütigen Eintauchen in PBS. Am Ende der Inkubation werden ein O-Ring und der äquilibrierte Filter in die entsprechenden Kammern im Körper der Baugruppe eingesetzt. Wenn das Gerät zusammengebaut ist, resuspendieren Sie die HUEhT-1-Zellen in einer Höhe von 1,25 x 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter Endothelzellwachstumsmedium, ergänzt mit einer fetalen Kälberserumkonzentration von 2 %, und fügen Sie 1,2 Milliliter Zellen zu jedem auf extrazellulärer Matrix basierenden Hydrogel hinzu, das gut beschichtet ist.Geben Sie dann 1,5 Milliliter kultiviertes OCSC für fünf Tage in eine Vertiefung und stellen Sie das NICO-1-System in den Zellkultur-Inkubator. Die Röhrenbildung kann durch Lichtmikroskopie beobachtet werden, und die Bildung von Zellnetzwerken auf dem extrazellulären Matrix-basierten Hydrogel kann durch Quantifizierung der Anzahl der Äste, die sich innerhalb der Co-Kultur im Laufe der Zeit bilden, gemessen werden. Hier kann ein Vergleich der Röhrenbildungsaktivität beobachtet werden, die durch zwei verschiedene CSC induziert wird.In dieser Analyse nahm die Anzahl der gebildeten Gefäßröhren im Laufe der Zeit während der Co-Kultur mit der zweiten CSC-Population dramatisch zu. In diesen Bildern ist die angiogene Eigenschaft von HUEhT-1 nach Behandlung mit vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren ohne CSC2-Co-Kultur als Positivkontrolle zu beobachten. In diesem OSCS-Endothelzell-Co-Kulturmodell unter Verwendung des NICO-1-Systems wurden HUEhT-1-Zellen 20 Stunden lang mit CSC2 co-kultiviert.Wie mittels Zeitraffer-Videobildgebung beobachtet wurde, bildeten die HUEhT-1-Zellen im Laufe der 20-stündigen CSC-Co-Kultur Gefäßröhren. Jüngste Entdeckungen haben zur klinischen Anwendung von PARP-Inhibitoren bei Eierstockkrebs geführt, die bei der homologen Rekombinationsreparatur defekt sind, sowie von anti-angiogenem Bevacizumab. Unser Protokoll mit einem 3D-Co-Kultursystem kann Einblicke in die angiogene Eigenschaft von Eierstockkrebsstammzellen bei Tumormetastasen geben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kultur von normalen Zellen in ihrer dreidimensionalen Kontext stellt eine alternative Methode zur frühen Ereignisse für die zelluläre Transformation und Tumorentstehung erforderlich studieren. Diese Methode wird verwendet, um normale Eierstock-und Eileiter Zellen wachsen zu frühen Ereignisse bei Eierstockkrebs Bildung zu studieren.

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In-vitro-Kugel-Assays werden häufig verwendet, um Krebsstammzellen zu identifizieren. Hier vergleichen wir Einzel- mit Multizell-basierten Kugel-Assays. Die aufwendigeren einzelzellbasierten Assays oder die Methylcellulose-Supplementierung liefern genauere Ergebnisse, während mehrzellige Assays, die in flüssigem Medium durchgeführt werden, stark von der Zelldichte beeinflusst werden können.

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Tumor-initiierende Zellen (TICs) könnten ein brauchbares therapeutisches Ziel für die Behandlung von Eierstockkrebs darstellen, einer hochgradig wiederkehrenden und tödlichen Krankheit. Wir stellen ein Protokoll für Kulturbedingungen vor, die für diese hochgradig tumorigene Zellpopulation anreichern.

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Bewertung der angiogenetischen Eigenschaften von Stammzellen von Eierstockkrebs mit dem dreidimensionalen Kokultursystem NICO-1

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