Horizontale Hippocampal Scheiben der Maus Gehirn

Dieses Protokoll erleichtert die Aufbereitung von horizontalen Schnitten des Hippocampus-Gehirns für deren Verwendung in verschiedenen wissenschaftlichen Anwendungen. Diese Technik bewahrt die Integrität aller Faserwege des Hippocampus innerhalb einer einzigen Hemisphärenscheibe. Dieses Slice-Protokoll eignet sich ideal zur Beurteilung neurologischer Veränderungen, die bei Hirnpathologien auftreten, die sich im Gyrus dentatus entwickeln und manifestieren.

Der wichtigste Aspekt dieses Protokolls ist es, die Balance zwischen einer möglichst schnellen Ausführung und dem schonenden Umgang mit dem Hirngewebe zu finden. Um einen Liter ACSF herzustellen, mischen Sie langsam alle festen Chemikalien wie angegeben in 800 Millilitern Wasser unter ständigem Rühren mit einem magnetischen Rührstab, bevor Sie langsam die entsprechenden Mengen an Magnesiumsulfat und Calciumchlorid eintropfen lassen. Verwenden Sie dann ein Dampfdruckosmometer, um die Osmolarität zwischen 305 und 315 Milliosmol zu validieren, und blasen Sie die ACSF-Lösung kontinuierlich bei Raumtemperatur mit Carbogen, um den pH-Wert zwischen 7,3 und 7,4 einzustellen.

Um 250 Milliliter Scheibenlösung mit hohem Saccharosegehalt herzustellen, fügen Sie die Verbindungen zu 25 Millilitern vorgeschnittener Lösung hinzu, wie in der Tabelle angegeben, und stellen Sie sicher, dass die Osmolarität zwischen 320 und 325 Milliosmol liegt. Dann die Scheibenlösung mit hohem Saccharosegehalt 10 bis 15 Minuten lang mit Carbogen sprudeln, um den pH-Wert zwischen 7,3 und 7,4 einzustellen, und die Scheibenlösung mit hohem Saccharosegehalt 20 bis 30 Minuten bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis sie teilweise gefroren ist. Um einen Arbeitsbereich für die Dissektion vorzubereiten, füllen Sie eine Rückgewinnungskammer mit karbogenierter ACSF-Lösung und stellen Sie die Kammer in ein 32 Grad Celsius heißes Wasserbad.

Stellen Sie das Vibratom auf das entsprechende Schneidprogramm ein und füllen Sie den Halter mit Eis, montieren Sie ihn auf dem Vibratom und befestigen Sie eine Klinge am Vibratomarm. Die teilweise gefrorene Scheibenlösung mit hohem Saccharosegehalt mit einem Spatel zerkleinern und mischen, bis ein heterogener Matsch entsteht. Blasen Sie dann die Lösung mit Carbogen und verwenden Sie die Lösung, um ein Stück Filterpapier auf eine gekühlte 90-Millimeter-Kulturschale zu hydratisieren und eine 35-Millimeter-Kulturschale mit Eis zu füllen.

Um das Gehirn zu entnehmen, schneiden Sie mit einer Präparierschere die Kopfhaut einer zwei bis sechs Wochen alten männlichen Maus auf und öffnen Sie die Schädeldecke entlang der sagittalen Naht. Entfernen Sie den Schädel mit einer gebogenen Pinzette, bis das gesamte Gehirn einschließlich der Riechkolben sichtbar ist, und schöpfen Sie mit einem Spatel vorsichtig das intakte Hirngewebe heraus. Legen Sie das Gehirn in die 35-Millimeter-Kulturschale und verwenden Sie eine Pasteurpipette, die mit einer Scheibenlösung mit hohem Saccharosegehalt gefüllt ist, um vorsichtig alle Haar- oder Blutpartikel aus dem Gewebe zu entfernen.

Übertragen Sie das gereinigte Gehirn mit dem Spatel auf das durchnässte Stück Filterpapier und schneiden Sie das Gehirn mit einer Klinge in Längsrichtung in zwei Hälften. Legen Sie beide Hemisphären auf die frisch geschnittene mediale Seite und machen Sie mit der Klinge einen parallelen Schnitt an der dorsalen Oberseite jeder Hemisphäre, um die dorsale Region jedes Gehirnstücks zu entfernen. Legen Sie beide Hemisphären mit dem ventralen Teil des Gehirns nach oben auf die frisch geschnittene dorsale Seite und geben Sie einen Tropfen Sekundenkleber auf eine Probenplatte.

Verteilen Sie den Kleber mit einer Pipettenspitze auf einer großen Fläche, in der beide Gewebestücke Platz finden, und berühren Sie ein Stück Filterpapierband mit der Bauchseite einer Hemisphäre. Verwenden Sie ein weiteres Filterpapierband, um die dorsale Seite des Gehirns vorsichtig halbtrocken zu trocknen, und positionieren Sie die Rückenseite der Hemisphäre nach unten auf dem Kleber auf der Probenplatte. Verwenden Sie zwei zusätzliche Filterpapierbänder, um die zweite Halbkugel wie gerade gezeigt auf dem Kleber zu positionieren und legen Sie die Probenplatte in die Schneidekammer.

Dann schnell, aber vorsichtig den Teller mit eiskaltem, hochsaccharosereichem Scheibenlösungsmatsch abdecken. Um Schnitte des Hirngewebes zu entnehmen, positionieren Sie die Vibratom-Klinge vor der medialen Seite der Hemisphären und heben Sie den Vibratom-Tisch so an, dass sich die Klinge auf der gleichen Höhe wie die ventralen Seiten der Hemisphären befindet, die nun nach oben zeigen. Mit der Vibratomensteuerung senken Sie die Klinge 600 Mikrometer weiter in dorsaler Richtung ab und schneiden das Gewebe auf, bis die ersten beiden Scheiben vollständig von den beiden Hemisphären getrennt sind.

Wenn die ersten beiden Gewebescheiben erhalten wurden, kehren Sie die Schnittrichtung um und senken Sie die Klinge um weitere 300 Mikrometer, bevor Sie erneut schneiden. Wenn der Hippocampus sichtbar wird, verwenden Sie eine verbreiterte Pasteurpipette aus Kunststoff, um die Scheiben zu sammeln und in die Auffangkammer im Wasserbad zu übertragen. Lassen Sie die Scheiben eine Stunde lang in der mit ACSF gefüllten Aufwachkammer und stellen Sie die Auffangkammer dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf, bevor Sie elektrophysiologische Aufzeichnungen der Gewebeproben durchführen.

Hier können repräsentative negative und positive Felder exzitatorische postsynaptische Potentialaufnahmen von niedrig- bzw. hochqualitativen Schnitten beobachtet werden. Die Negativ-Beispiel-Kurve weist bei der Depolarisation der stimulierten neuronalen Fasern eine große Faservolley-Amplitude auf, die sogar höher ist als die tatsächliche fEPSP-Amplitude, während die hochwertige Spur ein kleines Verhältnis von Faser-Volley zu fEPSP und eine hohe fEPSP-Amplitude aufweist. Die Lebensfähigkeit eines Hirnschnitts kann auch analysiert werden, indem die feldexzitatorischen postsynaptischen Potentialsteigungen im Vergleich zu den Amplituden der Fasersalve aufgetragen werden.

Eingabe-/Ausgabekurven, die typischerweise zur Bestimmung der Schnittqualität verwendet werden, können erhalten werden, indem zunehmende Stromstimuli auf den Gehirnschnitt angewendet und die nachfolgenden fEPSP-Reaktionen überwacht werden. Aufgrund der suboptimalen Leitungseigenschaften von schlecht erhaltenem Hirngewebe weisen minderwertige Hirnschnitte reduzierte Ein-/Ausgabekurven auf. Lebensfähige Hirnschnitte haben stabile synaptische Transmissionsbaselines, während Hirnschnitte mit einer instabilen Baseline nicht für weitere Konditionierungsprotokolle zur Untersuchung der synaptischen Plastizität von Gehirnschaltkreisen verwendet werden können.

fEPSP-Baseline-Aufzeichnungen können auch nützlich sein, um die Auswirkungen von Medikamenten auf die synaptische Übertragung selbst zu überwachen. Darüber hinaus können die Hirnschnitte in Kombination mit einem Kalziumindikator verwendet werden, um Fluoreszenzbildgebungsaufzeichnungen zu erfassen und Kalziumeinflüsse unter verschiedenen Schnittbedingungen oder Behandlungen zu untersuchen. Stellen Sie sicher, dass die Hirndissektion innerhalb von nicht mehr als 1,5 Minuten nach der Opferung durchgeführt wird und dies immer noch Garantie dafür ist, dass das Hirngewebe nur kurz ohne Kühlung und Sauerstoffversorgung ist.

Hippocampus-Hirnschnitte haben viele verschiedene Anwendungen, von molekularbiologischen Techniken bis hin zur Elektrophysiologie. Dieses Verfahren ermöglicht die intensive Untersuchung der Anatomie des Hippocampus und der neurologischen Prozesse.