Asymmetrische Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung zur Dimensionierung von Gold-Nanopartikeln in Suspension

Die Verwendung der asymmetrischen Strömungsfeld-Strömungsfraktionierung in Kombination mit der externen Größenkalibrierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur genauen Bestimmung der Größenverteilung von Goldnanopartikeln in Suspension. AF4 deckt den gesamten Größenbereich von einem bis 1000 Nanometer ab. Es ist unabhängig von der Probenzusammensetzung der Probenbestandteile und kann auch auf schlecht dispergierte und komplexe Proben angewendet werden.

Das Schöne an AF4 ist sein sehr breites Anwendungsspektrum, das nicht nur Nanopartikel unterschiedlicher Art und Größe umfasst, sondern auch Proteine, Viren oder synthetische oder natürliche Makromoleküle. Beginnen Sie damit, 50 Milligramm pro Liter eines Standards beliebiger Goldnanopartikelgröße zwei Minuten lang zu wirbeln, bevor Sie den Standard mit Reinstwasser auf ein Verhältnis von eins zu vier verdünnen. Anschließend wird die verdünnte Lösung weitere zwei Minuten lang vortext, um eine homogenisierte Suspension zu erhalten.

Öffnen Sie nach der Reinigung des Systems die AF4-Kartusche, um den Austausch der AF4-Membran zu ermöglichen. Spülen Sie die neue Membran mit UPW und bauen Sie die Kartusche wieder zusammen. Schließen Sie dann die Patrone wieder an das AF4-UV-vis-System an.

Spülen Sie das gereinigte AF4-UV-vis-System mindestens 30 Minuten lang mit gefiltertem und entgastem Eluant, indem Sie eine Spitzenflussrate von einem Milliliter pro Minute, eine Fokusflussrate von einem Milliliter pro Minute und eine Querflussrate von 1,5 Millilitern pro Minute anwenden, um die Membran auszugleichen, das System zu stabilisieren und auf mögliche Lecks zu prüfen. Der Systemdruck sollte ein konstantes Niveau zwischen vier und 12 bar erreichen. Um das AF4-UV-vis-System durch Bestimmung der Massenrückgewinnung und der Variation der Retentionszeit unter Verwendung eines beliebigen Goldnanopartikelgrößenstandards zu qualifizieren, führen Sie einen Direktinjektionslauf ohne Anwendung einer Trennkraft durch.

Führen Sie dann einen Fraktionierungslauf mit einer Trennkraft durch. Um Gold-Nanopartikel-Größenstandards für die externe Größenkalibrierung vorzubereiten, reiben Sie alle 50 Milligramm pro Liter Gold-Nanopartikel-Größenstandards zwei Minuten lang ein und verdünnen Sie jede entsprechende Probe für die Analyse in Reinstwasser im Verhältnis eins zu vier. Wenn die Größenstandards vorbereitet wurden, stellen Sie auf der Registerkarte FFF-Methode die Durchflussrate des Detektors auf 500 Mikroliter pro Minute, die Injektionsflussrate auf 500 Mikroliter pro Minute und die Injektionszeit auf 0,1 Minuten ein.

Stellen Sie eine Elutionsdauer von acht Minuten ohne definierte Trennkraft ein und injizieren Sie 10 Mikroliter des ersten Standards in das System. Wenn alle Größenstandards gemessen wurden, injizieren Sie 50 Mikroliter des ersten Standards in das System. Stellen Sie die Durchflussrate des Detektors auf 500 Mikroliter pro Minute ein.

Stellen Sie die Verzögerung auf zwei Minuten, die Einspritzflussrate für fünf Minuten auf 200 Mikroliter pro Minute und die Übergangszeit auf 0,2 Minuten ein. Die Fokusflussrate wird automatisch berechnet. Stellen Sie die Elutionsdauer auf 60 Minuten und die Cross-Flow-Rate auf einen Milliliter pro Minute ein.

Diese AF4-Methode verwendet eine konstante Querflussrate, auf die ein linearer Zerfall über 10 Minuten auf null Mikroliter pro Minute folgt. Stellen Sie den Spülschritt von neun Minuten mit einer Spitzendurchflussrate von 500 Mikrolitern pro Minute ein. Wenn alle Größenstandards für Goldnanopartikel fraktioniert wurden, bereiten Sie die unbekannte Goldnanopartikelprobe vor und führen Sie eine direkte Injektionsmessung und Fraktionierung der unbekannten Goldnanopartikelprobe durch, wie gerade gezeigt.

Um die Daten zu analysieren, importieren Sie die Datendateien in die Systemsoftware. Zeigen Sie die Messungen auf der Registerkarte Übersicht an und wählen Sie das UV-Vis-Detektorsignal aus der Detektorliste aus. Definieren Sie für jede Messung einen Interessenbereich und eine Basislinie, und passen Sie das Signal und die Basislinienansicht nach Bedarf an.

Verwenden Sie die Signalverarbeitungs-Toolbox, um verrauschte Signale zu glätten, und verwenden Sie die Funktion Verarbeitungsparameter anderen Läufen zuweisen, damit die Parameter anderen Messungen zugewiesen werden können. Um eine Berechnung der Massenrückgewinnung durchzuführen, öffnen Sie die Messungen der Direkteinspritzung und die Fraktionierungsdaten. Fügen Sie eine Direkteinspritzkalibrierung ein und wählen Sie die entsprechenden Direkteinspritzungsmessungen aus der Ansicht der Einstellungen für die Direkteinspritzung aus.

Das Injektionsvolumen und die Konzentration der Probe werden verwendet, um die Peakfläche mit der injizierten Menge zu korrelieren. Verwenden Sie anschließend die Funktion Ausgewählten Partikelvoreinstellungen zuweisen, um die erhaltene Kalibrierungsfunktion den jeweiligen Fraktionierungsmessungen zuzuweisen. Verwenden Sie dann die Gleichung, um die Massenrückgewinnung von Goldnanopartikeln zu berechnen, indem Sie die Fläche unter den jeweiligen UV-Vis-Peaks der Fraktionierungs- und Direktinjektionsmessungen vergleichen.

Um die Ergebnisse anzuzeigen, öffnen Sie die quantitative Ergebnisberechnung. Es wird eine Massenkonzentration bezogen auf die Peakfläche vorgestellt. Die Massenrückgewinnung kann durch Vergleich dieses Wertes mit der injizierten Konzentration ermittelt werden.

Klicken Sie auf der Registerkarte Partikelgröße im Fenster zur Partikelgrößenkalibrierung auf die jeweilige Messung in der Tabelle Referenzen für die Kalibrierung auswählen, um alle Kalibrierungsläufe auszuwählen. Die Messungen werden in einer Tabelle angezeigt, sobald sie ausgewählt sind. Geben Sie den hydrodynamischen Radius für alle Kalibriermessungen ein.

Die Funktion und die Gleichung werden im Funktionsfenster für die Partikelgrößenkalibrierung angezeigt. Um den Messungen der unbekannten Goldnanopartikel-Probe die Kalibrierfunktion zuzuweisen, wählen Sie innerhalb der Auswahlläufe für die Zuordnungsliste die entsprechenden Fraktionierungen aus und öffnen Sie eine Partikelgrößenverteilungsberechnung, um die Ergebnisse anzuzeigen. Die berechnete Größe wird im Fenster für die Größenverteilung angezeigt und mit dem maximalen Spitzenwert beschriftet.

Und die zuvor erstellte Partikelgrößenkalibrierung wird als Kalibrierung für die Messungen der unbekannten Goldnanopartikel-Probe aufgeführt. Um alle Messungen einer Probe zu mitteln, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Signale für Probe mitteln. Das Ergebnis wird in der Beschriftung "Maximalwert" aufgeführt.

Hier wird eine repräsentative Überlagerung von Goldnanopartikel-Größenstandards gezeigt, die durch AF4 fraktioniert und mittels UV-Vis-Spektroskopie zur Messung der Absorption der Partikel bei einer Wellenlänge von 532 Nanometern detektiert wurden. Die relative Standardabweichung aller Retentionszeiten für jedes Nanopartikel bei seinem jeweiligen UV-Vis-Spektroskopie-Peak-Maximum, das aus dreifachen Messungen erhalten wurde, lag unter 1,1 %Eine lineare Regressionsanalyse dieser Daten führte zu einer linearen Kalibrierungsfunktion mit einem quadrierten Korrelationskoeffizienten R zum Quadrat von 0,9958. Als dann neun AF4-UV-vis-Spektroskopie-Fraktogramme aus unbekannten Goldnanopartikelproben erhalten wurden, war die relative Standardabweichung der jeweiligen Retentionszeiten signifikant niedrig und lag zwischen 0,1 und 0,5 %. Unter Verwendung der Partikelgrößenkalibrierungsfunktion, die aus der Fraktionierung der Goldnanopartikel-Größenstandards gewonnen wurde, und der Korrelation dieser Daten mit den erhaltenen Retentionszeiten der unbekannten Goldnanopartikelprobe beim UV-Vis-Spektroskopie-Peakmaximum, Es konnte ein durchschnittlicher hydrodynamischer Radius berechnet werden.

Darüber hinaus könnte eine vernünftige Massenrückgewinnung erzielt werden, die darauf hindeutet, dass keine signifikante Agglomeration oder Auflösung der Goldnanopartikelproben oder eine nennenswerte Adsorption der Partikel an der Membranoberfläche vorliegt. Bei der Verwendung einer externen Größenkalibrierung und AF4-Analyse ist es von größter Bedeutung, dass die gleiche AF4-Methode konsistent auf alle Größenstandards und die Probe selbst angewendet wird. AF4 ermöglicht es Forschern, die Eigenschaften ihrer nanopartikulären Proben besser zu verstehen.

Es ist daher ein wichtiges Instrument der Qualitätskontrolle, das letztendlich dazu beiträgt, die Wirksamkeit von nanofähigen Produkten zu verbessern.