Name: Kapillarelektrophorese Massenspektrometrie Ansätze zur Charakterisierung der protein- und metaboliten Korona, die von Nanomaterialien erfasst werden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Erfahren Sie die Charakterisierung der Protein- und Metabolitenkorona von Nanomaterialien mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht eine umfassende biomolekulare Analyse mit hoher Sensitivität.

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A.J.C, J.A.T und I.L bestätigen Förderung durch die Europäische Kommission über horizon 2020 Projekt ACEnano (Grant No. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z erkennt Promotionsförderung durch den China Scholarship Council (CSC, Nr. 201507060011) an. R.R. erkennt die finanzielle Unterstützung des Vidi-Zuschussprogramms der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO Vidi 723.0160330) an.

Die Verwendung von Humanbiofluid wurde gemäß den IRB-Protokollrichtlinien der Universität Leiden und der Medizinischen Universität Innsbruck genehmigt. Wenn menschliche oder tierische Biofluide untersucht werden, ist eine ethische Genehmigung der Forschungseinrichtung erforderlich, die im Falle der in diesem Protokoll gezeigten Ergebnisse eingeholt wurde. Darüber hinaus sollte auch eine angemessene Berichterstattung durchgeführt werden, um Transparenz und Wiederverwendbarkeit der Daten inkünftigenArbeiten zu gewährleisten9,29,30.
1. Herstellung von Hintergrundelektrolyten (BGE)
HINWEIS: Alle Lösungsmittel sollten in einem geeigneten Abzug vorbereitet werden und für alle Schritte muss eine angemessene persönliche Schutzausrüstung verwendet werden (Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille). In jedem Schritt sind niedrig bindende Kunststofffläschchen erforderlich, um den Analytverlust und die Kontamination der Probe mit Salzen, die aus Glaswaren ausgelaucht werden, zu minimieren.
<ol><li>Bereiten Sie täglich 10% Essigsäure BGE (v / v), pH 2,2 für die Metabolomik vor.<ol>
<li>In einen 10-ml-Messkolben werden 1 ml Essigsäure hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von entionisiertem (DI) Wasser zur markierten Linie und einer gründlichen Mischung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mM Essigsäure, pH 2,9 täglich für die Proteomik vor.<ol>
<li>In einen 10-ml-Messkolben werden 57 μL Essigsäure hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von DI-Wasser zur markierten Linie und dem gründlichen Mischen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NM-Vorbereitung
<ol><li>NMs anhand der veröffentlichten Richtlinien31 , 32,33kräftig in Wasser verteilen. HINWEIS: Bei der Entwicklung dieses Protokolls wurden 7 NMs wie folgt verwendet: 100 und 1.000 nm carboxyliertes Polystyrol wurden für Protein- bzw. Metabolitenkorona verwendet. 100 nm unmodifizierte Polystyrol-NMs, 13 nm Anatas-TiO2-NMs, die unverändert oder mit Polyacrylat- oder PVP-Polymeren beschichtet waren, und 22 nm unmodifizierte SiO2-NMs wurden sowohl für Protein- als auch für Metabolitenkoronen verwendet. Während die Methode mit diesen NMs entwickelt und demonstriert wurde, sollte beachtet werden, dass dieser Ansatz für eine Vielzahl von NM-Zusammensetzungen, -Größen, -Formen und -Morphologien anwendbar wäre.</li>
	<li>Charakterisierung der Partikelgröße entweder mit dynamischer Lichtstreuung34,35, Einzelpartikel-induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie36, Nanopartikel-Tracking-Analyse37oder Transmissionselektronenmikroskopie und Oberflächenladung als Zetapotential mit einem Zeta-Sizer34.</li>
</ol>3. Biomolekulare Koronabildung
<ol><li>Teilen Sie 2 ml menschliches Plasma (oder Biofluid ihrer Wahl) in 1 ml Aliquoten, eines für den Metaboliten und die Proteinkorona und das zweite für die Plasmametabolomcharakterisierung.</li>
	<li>1 mg/ml NMs im menschlichen Plasma für 1 h bei 37 °C inkubieren, während sie bei 500 U/min in einem Thermomixer sanft gemischt werden. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C, um die NMs zu pelletieren.</li>
	<li>Sammeln Sie den Plasmaüberstand für die Metabolitenkoronaanalyse. Behalten Sie den NM-Protein-Korona-Komplex für die Proteinkorona-Charakterisierung bei.</li>
</ol>4. Protein-Korona-Isolierung
<ol><li>Den NM-Proteinkomplex (das Pellet) in 1 ml 10x PBS Buffer und Wirbel kräftig für 2 min resuspendieren, um ungebundene Proteine zu entfernen. Zentrifugieren Sie die PBS-Lösung bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C, um die NMs zu pelletieren, und entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Das Pellet in 1 ml Ammoniumbicarbonatpuffer (ABC) (100 mM, pH 8,0) und Wirbel kräftig für 2 min resuspendieren, um ungebundene Proteine und unerwünschte Salze zu entfernen. Zentrifuge bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C, um die NMs zu pelletieren; Entfernen und verwerfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
	<li>Reduzieren Sie Proteindisulfidbindungen, indem Sie das NM-Proteinpellet in 20 μL ABC-Puffer (100 mM pH 8) mit 10 mM Dithiotherit auflösen. Inkubieren Sie die Reduktionslösung für 30 min bei 56 °C.</li>
	<li>Um Proteine zu verdauen, fügen Sie 2 μg Trypsin in Sequenzierungsgrad zu 20 μL ABC hinzu, das 0,1% Tensid enthält. Inkubieren Sie die Fermentlösung für 16 h bei 37 °C.</li>
	<li>Alkylieren Sie die Probe durch Zugabe von 20 μL Jodoacetamid bei 55 mM in 100 mM ABC und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 20 min.</li>
	<li>Fügen Sie 20 μL von 0,1 M HCl hinzu, um das Tensid zu spalten, und lassen Sie es 10 minuten bei Raumtemperatur stehen.</li>
	<li>Anreichern und Entsalzen von Peptiden mit einer C18-verpackten Entsalzungspipettenspitze.<ol>
<li>Die Spitze mit 80 μL 0,1% Ameisensäure 50% Acetonitril 5 mal befeuchten, mit 80 μL 0,1% Ameisensäure 5 mal reinigen, Probe 10 mal ziehen und eluieren, Probe durch Spülen von 80 μL 0,1 % Ameisensäure 5 mal entsalzen und die Probe 2 mal mit 80 μL 0,1% Ameisensäure 70% Acetonitril in ein sauberes, niedrig bindendes PCR-Röhrchen eluieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Proben lyophilisieren und bis zur Analyse bei -20 °C lagern.</li>
</ol>5. Metaboliten-Korona-Isolierung
<ol><li>Nehmen Sie das Kontrollplasma und den Überstand aus der NM-Plasmainkubation aus Schritt 3.3 und halten Sie es während der Probenvorbereitung auf Eis.</li>
	<li>Nehmen Sie jeweils 50 μL in separate Durchstechflaschen und verdünnen Sie 1 zu 10 mit DI-Wasser. Nehmen Sie 50 μL jeder verdünnten Probe und wechseln Sie zu neuen Durchstechflaschen für Schritt 5.3.</li>
	<li>200 μL Chloroform, 250 μL Methanol und 350 μL DI-Wasser und kräftige Wirbelmischung für 2 min hinzufügen. Zentrifuge für 10 min bei 20.800 x g bei 4 °C.</li>
	<li>Nehmen Sie 500 μL Überstand und filtern Sie durch einen 3 kDa Zentrifugalfilter für 2 h bei 10.000 x g bei 4 °C. Nehmen Sie 430 μL Ultrafiltrat und trocknen Sie sie in einem Geschwindigkeitssauger. Proben können nun vor der Analyse eingefroren werden.</li>
</ol>6. Vorbereitung des CESI-MS-Systems38
HINWEIS: Überprüfen Sie vor der Installation der Kapillaren, ob der Einlass und das Auslassende der Kapillaren intakt sind und dass keine sichtbaren Brüche in der Kapillare vorhanden sind.
<ol><li>Installation einer neutral beschichteten Kapillare zur Proteinkoronaanalyse39.<ol>
<li>Legen Sie eine neue neutral beschichtete Kapillare (90 cm Länge mit 30 μm Innendurchmesser) gemäß den Herstellerrichtlinien in das CESI-Gerät.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von CESI-Kapillaren für die proteomische Analyse.<ol>
<li>Spülen Sie die Trennkapillar in Vorwärtsrichtung mit 100 mM HCl für 5 min bei 100 psi und überprüfen Sie die Tröpfchenbildung am Auslass der Kapillare. Spülung der Trennkapillare mit BGE bei 100 psi für 10 min und dann DI-Wasser bei 100 psi für 30 min (dies ist nur für neue Kapillaren erforderlich).</li>
		<li>Spülen Sie sowohl die Trennkapillar als auch die leitfähige Kapillare mit BGE bei 90 psi für 5 min und stellen Sie sicher, dass sich Tröpfchen am Auslassende beider Kapillaren bilden.</li>
		<li>Spülen Sie die Trennkapillare mit DI-Wasser bei 90 psi für 10 min, dann 50 psi für 10 min mit 0,1 M HCl, gefolgt von 90 psi für 10 min mit DI-Wasser und schließlich BGE bei 90 psi für 10 min. Koppeln Sie CESI mit dem MS mit einer Nanospray-Quelle und einem Adapter, wie zuvor beschrieben38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installation von blanker Quarzglaskapillare zur Metabolitenkoronacharakterisierung38.<ol>
<li>Legen Sie eine neue blanke Quarzglaskapillare (90 cm Länge mit einem Innendurchmesser von 30 μm) gemäß den Herstellerrichtlinien in das CESI-Gerät ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von CESI-Kapillaren für die Metabolomik-Analyse.<ol>
<li>Spülen Sie die Trennkapillar in Vorwärtsrichtung mit 100% MeOH bei 50 psi für 15 min und überprüfen Sie die Tröpfchenbildung am Auslass der Kapillare. Spülen Sie sowohl die Trennkapillar als auch die leitfähige Kapillare mit BGE bei 90 psi für 5 min und stellen Sie sicher, dass sich Tröpfchen am Auslass beider Kapillaren bilden.</li>
		<li>Spülen Sie die Trennkapillare mit DI-Wasser bei 90 psi für 10 min, dann 50 psi für 10 min mit 0,1 M NaOH, gefolgt von 90 psi für 10 min mit DI-Wasser und schließlich BGE bei 90 psi für 10 min. Koppeln Sie CESI mit dem ESI-MS mithilfe einer Nanospray-Quelle und eines Adapters, wie zuvor beschrieben. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS für die Proteinkoronaanalyse
<ol><li>Proben aus Schritt 4.8 in 20 μL von 50 mM Ammoniumacetat pH 4.0 resuspendieren.</li>
	<li>Führen Sie 5 psi 10 s hydrodynamische Injektion der Probe durch. Getrennt mit einer 30 kV Trennspannung mit folgendem Druckgradienten: 0-10 min bei 1 psi, 10-35 min bei 1,5 psi und 35-45 min bei 5 psi mit 100 mM, pH 2,9 Essigsäure als BGE.</li>
	<li>Sammeln Sie Massenspektren zwischen 250-2000 m/z mit Top-10-Daten, die von der Fragmentierung abhängig sind.</li>
	<li>Zwischen den Proben die Kapillare mit 0,1 M HCl für 3 min bei 100 psi und 10 min 100 psi BGE für die Trennkapillare und für 3 min bei 100 psi für die leitfähige flüssige Kapillare ausspülen.</li>
</ol>8. CESI-MS für die Metaboliten-Korona-Analyse
HINWEIS: Alle Proben müssen zweimal analysiert werden, einmal im positiven Modus für den Nachweis von Kationen und einmal im negativen Modus für den Nachweis von Anionen. Die Kontrollplasmaproben müssen mindestens 5 Mal analysiert werden.
<ol><li>NM-exponierte und nicht exponierte Plasmaproben aus Schritt 5.4 in 430 μL DI-Wasser und kräftigem Wirbel für 2 min resuspendieren. Filtern Sie durch einen 0,1 μm Membranfilter.</li>
	<li>Nehmen Sie 95 μL Filtrat und fügen Sie 5 μL interne Standards bei 200 μM für Kationen (L-Methioninsulfon) und 400 μM für Anionen (2,2,4,4-D4-Zitronensäure) und Wirbel kräftig hinzu. Zentrifuge bei 4.000 x g bei 4 °C für 10 min vor der CESI-MS-Analyse.</li>
	<li>Die Probe hydrodynamisch für 30 s (Kationen) und 40 s (Anionen) bei 2 psi injizieren.</li>
	<li>Trennen Sie Metaboliten in 10% Essigsäure mit einer Trennspannung von 30 kV im Vorwärts- (Kationen) und Rückwärtsmodus (Anionen). Der umgekehrte Trennmodus wird mit einem Vorwärtsdruck von 0,5 psi auf die Trennkapillare unterstützt.</li>
	<li>Stellen Sie das Massenspektrometer ein, um Daten im positiven (Kationen) oder negativen (Anionen) Modus über den Massenbereich von 65-1000 m / z zu sammeln. Zwischen den Proben Die Kapillare mit 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI-Wasser und BGE bei 50 psi für 2 min abspülen.</li>
</ol>

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</ol>

J.A.T ist ein Mitarbeiter von AB Sciex UK Ltd, der als Industriepartner am ACEnano-Projekt teilnimmt, J.A.T und alle anderen Autoren haben keinen Interessenkonflikt in dieser Arbeit.

Dies ist die erste Methode, die vorgeschlagen wird, um die vollständige biomolekulare Korona mit Proteinen und Metaboliten aus derselben Probe mit CESI-MS zu charakterisieren. Die Fähigkeit, sowohl die Proteine als auch die Metaboliten aus derselben Probe zu charakterisieren, wird die Datenmenge, die aus einer einzigen experimentellen Exposition gesammelt wird, signifikant erhöhen und neue Einblicke in den Prozess der Koronabildung und ihre Auswirkungen auf die Toxizität und Wirksamkeit von NMs als Nanoarzneimittel ermöglichen. Darüber hinaus ist CESI-MS eine ideale Plattform, um beide Klassen von Biomolekülen mit nur einer Erforderlichen Kapillarveränderung zu charakterisieren. Neue Methoden, die für nicht-wässriges CE entwickelt wurden, werden es ermöglichen, Lipidomik mit CE-MS40 durchzuführen, so dass es jetzt möglich ist, Proteine, Metaboliten und Lipide mit einer einzigen Plattform zu analysieren. Die derzeitigen konventionellen Ansätze würden zwei dedizierte LC-MS-Plattformen erfordern, eine für die Proteinkorona und eine für den Metaboliten Korona. Somit kann dieser Ansatz doppelt so viele Daten mit einer einzigen Analyseplattform sammeln.
Es gibt einige Vorbehalte gegen diesen Ansatz, insbesondere mit dem Metaboliten Corona, da dieses Protokoll eine indirekte Messung der Korona vorschlägt. Daher kann ein Problem auftreten, wenn die Metabolitenspiegel in hohen Konzentrationen relativ zu den NMs vorhanden sind und der anschließende Abfall der Metabolitenkonzentration in der Matrix gering ist. Anders als bei der Proteinkorona ist es jedoch unwahrscheinlich, dass ein "one size fits all" -Ansatz zur Isolierung der Metabolitenkorona entwickelt wird, da jede NM über eine einzigartige Oberflächenchemie verfügt. In Zukunft ist es jedoch wahrscheinlicher, dass NM-spezifische Ansätze zur Isolierung des Metaboliten Corona entwickelt und validiert werden; Dies gilt nur für diesen spezifischen NM. Trotzdem wird das CESI-MS weiterhin eine sehr geeignete Plattform für die Charakterisierung der polar geladenen Metaboliten sein, unabhängig davon, wie sie isoliert werden. Bemerkenswert ist auch, dass, wenn sich während der Zentrifugationsschritte, die zur Pelletierung der NMs bestimmt sind, kein Pellet bildet, eine höhere Zentrifugalkraft erforderlich sein kann; Dies tritt am ehesten bei weniger dichten NMs auf. Es ist auch wichtig, dass alle Filterschritte innerhalb des Protokolls eingehalten werden, da die Kapillaren durch die enge Bohrung der Kapillaren leicht blockiert werden können, wenn Partikel nicht ausreichend aus der Probe entfernt wurden.
Während das Protein Corona seit einigen Jahren ein intensives Forschungsgebiet ist, ist die Fähigkeit, dies mit dem Metaboliten Corona zu kombinieren, ein neues Interessengebiet fürWissenschaftler,die die Bio-Nano-Grenzflächeuntersuchen 6,14. Bisher konzentrierte sich die Mehrzahl dieser Studien auf die unpolare Lipidfraktion des Metaboliten Korona9,28. Diese aktuelle Methode ermöglicht die Charakterisierung der hochpolaren und geladenen Metaboliten in der Korona, zu denen wichtige Metaboliten gehören, die am Energiestoffwechsel, der Glykolyse und der DNA-Synthese beteiligt sind. Dadurch ist in Kombination mit dem Proteomik-Workflow eine ganzheitlichere Charakterisierung der biomolekularen Korona möglich. Dies ermöglicht eine eingehendere Analyse von Bio-Nano-Wechselwirkungen. Diese Methode ermöglicht verbesserte mechanistische Einblicke in die rezeptorvermittelte Endozytose über Protein- und Metaboliteninteraktionen mit Membranrezeptoren. Weiterhin können inter- und intrakoronale Wechselwirkungen zwischen Proteinen und kleinen Molekülen untersucht werden; So konnte kürzlich gezeigt werden, dass die Proteine in der Korona eine Schlüsselrolle bei der Rekrutierung von Metaboliten spielen15. Es ist erwähnenswert, dass die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 3 und Abbildung 4 eine absolute Quantifizierung von Metaboliten sind, jedoch würde ein ungezielter Ansatz mit multivariater Datenanalyse zum Vergleich aller CE-MS-Merkmale in Kontrollen im Vergleich zu exponiertem Plasma auch die Metabolitenbindung aufklären. Daher gibt es einen erheblichen Spielraum zu untersuchen, wie und welche Metaboliten und Proteine ihre jeweilige Rekrutierung in NM-Coronas beeinflussen. Diese zusätzlichen Studien können dazu beitragen, Coronas zu entwerfen, um die Verabreichung von Nanoarzneimitteln zu optimieren oder weitere Hürden für ihre Entwicklung aufzudecken, wie die Unterdrückung der pharmazeutischen Wirkung aufgrund der biomolekularen Koronablockierung oder maskierenden Targeting-Funktionalitäten.
CESI-MS mit seinen Nano-Durchflussraten von etwa 20 nL / min und dem minimalen Einsatz organischer Lösungsmittel bietet eine Verbesserung der grünen und wirtschaftlichen Referenzen gegenüber Standard-LC-MS und NanoLC-MS in Bezug auf den Lösungsmitteleinsatz, die größten Herausforderungen für Metabolomik- bzw. Proteomik-Studien. CESI-MS bietet hochreproduzierbare Ergebnisse sowohl für die Migrationszeit als auch für den Peak-Bereich, die im Vergleich zu LC-MS-basierten Methoden11,15günstig sind. Darüber hinaus ist die Übertragung im Vergleich zu nanoLC-MS bei CESI-MS kein Problem. Daher ist keine umfangreiche Systembereinigung zwischen den Probenanalysen erforderlich, was den Probendurchsatz erheblich verbessert11.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der vorgeschlagene Workflow der erste ist, der einen Ansatz zur Charakterisierung sowohl der Protein- als auch der Metabolitenkomponenten der vollständigen biomolekularen Korona von NMs beschreibt. Dies erschließt einen neuen Aspekt der Bio-Nano-Interaktionen, den Metaboliten Corona, und ermöglicht so die Sammlung von doppelt so vielen Daten aus derselben Probe und ermöglicht ein vollständigeres Verständnis der Wechselwirkungen an der Bio-Nano-Grenzfläche.

Bio-Nano-Wechselwirkungen an der Schnittstelle zwischen Nanomaterial (NM)-Oberflächen und biologischen Matrizen, aus denen Biomoleküle an die NM adsorbieren, sind ein intensives Forschungsgebiet, das nanosicherheit und nanomedizinischuntermauert 1. Diese Schicht adsorbierender Biomoleküle verleiht NMs eine biologische Identität, so dass Zellen sie als "Selbst" identifizieren und anschließend die zelluläre Aufnahme, Verteilung und biologischen Endpunkte beeinflussen2,3,4. Die überwiegende Mehrheit der Bio-Nano-Studien hat sich auf die Proteine innerhalb der Korona konzentriert und gezeigt, dass Proteine quantitativ und qualitativ zwischen NMs unterschiedlicher Zusammensetzung variieren5. Diese Variation hängt sowohl von den Eigenschaften des NM wie Größe, Funktionalisierung und Material als auch von den Eigenschaften der biologischen Matrix einschließlich Zusammensetzung und Salzgehaltab 5. Ein zunehmendes Interesse an der Bio-Nano-Grenzfläche sind die Metaboliten, die an NMsadsorbieren 6. Mehrere Studien haben gezeigt, dass nm-Eigenschaften wie bei den Proteinen ein Schlüsselfaktor bei der Bestimmung der Zusammensetzung der Metaboliten in der Korona sind und dass sie die biologischen Ergebnisse der NM-Exposition beeinflussen können6,7,8.
In Studien der biomolekularen Korona gibt es vier verschiedene Phasen zu ihrer Charakterisierung, Koronabildung, isolierung der Biomoleküle innerhalb der Korona, deren Nachweis durch qualitative oder quantitative Massenspektrometrie und Identifizierung9. Bis heute wurde eine Reihe von Techniken zur Isolierung der Proteinkorona eingesetzt, einschließlich des Kochens in SDS-PAGE-Laufpuffern, Lösungsmittel- und Salzextraktionen oder der direkten Verdauung von Proteinen in situ auf der Oberfläche von NMs. In Bezug auf die Metaboliten in der Korona ist die Isolierung mit verschiedenen Methoden unter Verwendung von Lösungsmitteln oder sogar die Auflösung der als Lösungen vorgeschlagenen NMs8,10,11komplexer. Im Gegensatz zur Proteinkorona ist es jedoch unwahrscheinlich, dass ein "One Size Fits All"-Ansatz für die Isolierung von Metaboliten aus NMs gilt, da das Metabolom einen großen chemischen Raum einnimmt und die Möglichen NMs vielfältig sind. Ein alternativer Ansatz besteht darin, die biologische Matrix vor und nach der NM-Exposition mit dem Unterschied in den Metabolitenkonzentrationen zu charakterisieren, der auf die Adsorption von Metaboliten an NMs zurückzuführen ist.12
Dieser alternative Ansatz wäre auf alle Biofluide und NMs anwendbar und obwohl er doppelt so viel Analyse erfordert, bietet er folglich ein viel genaueres Maß für die Metabolitenkorona und hat kein Risiko, dass niedrige Metabolitenrückgewinnungen von der NM-Oberfläche mit einer geringen Bindung des spezifischen Metaboliten verwechselt werden.
Der zweite Schritt zur biomolekularen Koronaanalyse ist der Nachweis der Biomoleküle. Traditionell für die Proteine in der Korona war dies die Aufgabe von Nano-LC-MS, dem Arbeitspferd der Proteomik; andere Ansätze wie NMR13, 1D und 2D SDS-PAGE wurden ebenfalls angewendet. In Bezug auf den Metaboliten Corona LC-MS7wurden GC-MS8 und direkte Infusionsmassenspektrometrie verwendet14. In jüngster Zeit hat jedoch ein neuer Ansatz begonnen, an Zugkraft zu gewinnen, nämlich die Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS)11,15, und ist in NM-Laboren als eigenständige Technik zur Charakterisierung verschiedener physikalischer und chemischer Eigenschaften von NMs16vorhanden. CE-MS ist eine orthogonale Trenntechnik zu nanoLC-MS und GC-MS und ist in der Lage, den Nachweis von hochpolaren und geladenen Metaboliten zu ermöglichen17,18. Darüber hinaus eignet sich CE-MS gut für die Analyse von Proteinen und deren posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung und Glykosylierung19,20,21,22. Der letzte Schritt, die Identifizierung und Datenanalyse kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden, je nachdem, ob ein quantitativer / qualitativer oder gezielter / ungezielter Ansatz verwendet wird, dies fällt jedoch nicht in den Zuständigkeitsbereich dieses Protokolls.
CESI-MS, eine Kombination aus CE und einer NanoESI-Schnittstelle, ist ein neuer Fortschritt in der CE-Technologie mit einer mantellosen Schnittstelle. Dies ermöglicht den direkten Anschluss von Ultra-Low-Flow CE (<20 nL/min) an ein hochauflösendes Massenspektrometer ohne Verdünnung, was zu einer deutlich verbesserten Detektionsempfindlichkeitführt 23,24,25. CESI-MS ermöglicht die Analyse volumenbegrennter Proben (< 10 μL) unter Beibehaltung einer hochempfindlichen Analyse26. CESI-MS ist auch im Vergleich zu herkömmlichen NanoLC-MS-Ansätzen mit niedriger Durchflussrate, die in der Proteomik und Metabolomik verwendet werden, in Bezug auf Reproduzierbarkeit27,28, Durchsatz und Übertragung günstig, was es zu einer aufregenden Perspektive für die vollständige biomolekulare Koronacharakterisierung macht.
Um das Potenzial von CESI-MS für die Analyse von Bio-Nano-Interaktionen hervorzuheben, beschreibt diese Arbeit die Probenvorbereitung, die erforderlich ist, um die biomolekulare NM-Korona aus einer einzigen menschlichen Plasmaprobe so zu isolieren, dass die Daten sowohl aus den Protein- als auch aus den Metabolitenaspekten der gesamten biomolekularen NM-Korona maximiert werden. Während wir über die Verwendung von menschlichem Plasma berichten, wäre dieses Protokoll für andere Bioflüssigkeiten wie Blutserum, komplettes Zellkulturmedium, Zelllysat, Zerebrospinalflüssigkeit oder Urin gleichermaßen geeignet. Die Analysen dieser beiden Komponenten (Proteine und Metaboliten) werden dann mit neutral beschichteten CESI-Kapillaren für die Proteinkorona und blanken Quarzglaskapillaren für kationische und anionische Metaboliten beschrieben.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citric</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Internes Standard-Anion</td></tr><tr><td>Ammoniumacetat >98%</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat >99,5%</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarpatrone Kühlmittel</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 Instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Cap</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Fläschchen</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Giftig, Verwendung in einem Abzug</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacetamid</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-Methioninsulfon</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Internes Standardkation</td></tr><tr><td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Verwendung in einem Abzug</td></tr><tr><td>Mikrofläschchen</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>nanoFläschchen</td><td>Sciex</td><td>5043467</td><td></td></tr><tr><td>Kartusche mit neutraler Oberfläche 30 & Mikro; M ID x 90 cm Gesamtlänge</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adapter für Sciex Nanospray III Quelle</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 und B83386 für Thermo-Massenspektrometer, B85397 für Wasser-Massenspektrometer, B86099 für Bruker Massenspektrometer</td></tr><tr><td>OptiMS Quarzglaskartusche 30 &; micro; m ID x 90 cm Gesamtlänge</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte gepufferte Kochsalzlösung 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Spitzen, 100 & micro; L-Bett</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol carboxyliert 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol carboxyliert 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (Tensid)</td><td>Wasser</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Sequenzierungsgrad modifiziert Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxidlösung</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Dispex beschichtete</td><td>Promethion-Partikel</td><td>Maßgeschneiderte Partikel</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 PVP-beschichtete</td><td>Promethion-Partikel</td><td>Maßgeschneiderte Partikel</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 unbeschichtete</td><td>Promethion-Partikel</td><td>Maßgeschneiderte Partikel</td><td></td></tr></tbody></table>

kapillarelektrophorese massenspektrometrie ansätze zur charakterisierung der protein- und metaboliten korona, die von nanomaterialien erfasst werden

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Die Adsorption von Biomolekülen aus umgebenden biologischen Matrizen an die Oberfläche von Nanomaterialien (NMs) zur Bildung der Korona ist seit einem Jahrzehnt von Interesse. Das Interesse an der Bio-Nano-Grenzfläche ergibt sich daraus, dass die biomolekulare Korona NMs eine biologische Identität verleiht und so den Körper veranlasst, sie als "Selbst" zu identifizieren. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass die Proteine in der Korona in der Lage sind, mit Membranrezeptoren zu interagieren, um die zelluläre Aufnahme zu beeinflussen, und festgestellt, dass die Korona für den zellulären Transport von NMs und deren eventuelle Toxizität verantwortlich ist. Bisher hat sich die meiste Forschung auf die Proteinkorona konzentriert und die möglichen Auswirkungen der in der Korona enthaltenen Metaboliten oder synergistische Effekte zwischen Komponenten in der gesamten biomolekularen Korona übersehen. Daher zeigt diese Arbeit Methoden, um sowohl die Protein- als auch die Metabolitenkomponenten der biomolekularen Korona unter Verwendung von Bottom-up-Proteomik- und Metabolomik-Ansätzen parallel zu charakterisieren. Dazu gehören eine On-Particle-Digest der Proteinkorona mit einem Tensid zur Erhöhung der Proteinrückgewinnung und eine passive Charakterisierung der Metabolitenkorona durch Analyse von Metabolitenmatrizen vor und nach NM-Expositionen. Diese Arbeit führt die Kapillarelektrophorese – Massenspektrometrie (CESI-MS) als neue Technik zur NM-Koronacharakterisierung ein. Die hier beschriebenen Protokolle zeigen, wie CESI-MS für die zuverlässige Charakterisierung sowohl des Proteins als auch der Metabolitenkorona, die von NMs erworben werden, verwendet werden kann. Der Wechsel zu CESI-MS verringert das erforderliche Probenvolumen erheblich (im Vergleich zu herkömmlichen Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Ansätzen (LC-MS) mit mehreren Injektionen ab nur 5 μL Probe, was es ideal für volumenbegrente Proben macht. Darüber hinaus werden die Umweltfolgen der Analyse in Bezug auf LC-MS aufgrund der niedrigen Durchflussraten (<20 nL / min) in CESI-MS und der Verwendung von wässrigen Elektrolyten, wodurch organische Lösungsmittel überflüssig werden, reduziert.

Die beschriebene Methode ist die erste, die sowohl die Proteine als auch die Metaboliten in der biomolekularen NM-Korona mit derselben menschlichen Plasmaprobe charakterisiert. Diese Methode ist in der Lage, &gt;200 Proteine und &gt;150-Metaboliten nachzuweisen, wodurch ein möglichst umfassender Überblick über die gesamte biomolekulare Korona bestimmt werden kann, was ein besseres Verständnis der zellulären Bindung, Aufnahme und Auswirkungen von NMs ermöglicht.
Die Verwendung von CESI-MS sowohl für die Proteomik (Abbildung 1) als auch für die Metabolomik (Abbildung 2) trennung und detektion zeigt gute Trennfenster an beiden Kapillaren für jeden Ansatz.
Diese Methode ist in der Lage, zwischen den Proteinen in der Korona über eine breite Palette von NMs-Zusammensetzungen zu unterscheiden und so die Anwendbarkeit der Methoden auf NMs über ein breites Spektrum physikalischer und chemischer Eigenschaften zu demonstrieren (Tabelle 1).
Die eindeutigen Fingerabdrücke des Metaboliten Korona können auch mit dem metabolomischen Zweig dieser Methodik unterschieden werden (Abbildung 3). Obwohl dieser Ansatz einen passiven Ansatz zur Charakterisierung der NM-Metabolitenkorona verwendet, ist er immer noch in der Lage, interessante Einblicke in die Rolle von Metaboliten in der biomolekularen Korona wie die differentielle Adsorption von Isomeren zu gewinnen (Abbildung 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Abbildung 1: Beispiel-Elektropherogramm einer SiO2-Proteinkoronatrennung mittels CESI-MS nach einem On-Particle-Digest. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiel für extrahierte Ionenelektropherogramme, die aus endogenen Verbindungen im Plasma durch CE-MS gewonnen wurden. Die nummerierten Verbindungen sind wie folgt: 1. Ornithin; 2. Lysin; 3. Arginin; 4. Histidin; 5. Kreatin; 6. Glycin; 7. Alanin; 8. Valin; 9. Isoleucin; 10. Leucin; 11. Serin; 12. Threonin; 13. Asparagin; 14. Methionin; 15. Glutamin; 16. Glutaminsäure; 17. Phenyl-D5-Alanin; 18. Phenylalanin; 19. Tyrosin; 20. Prolin; 21. Methioninsulfon (interner Standard). Veröffentlicht unter einer Open-Access-Lizenz von Creative Commons CC BY und reproduziert von Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Analyse der Proteinkorona über ein Array von 6 NMs. Heatmap der Proteinklassen, die auf Kieselsäure(SiO2),Titan (TiO2), PVP-gekapptes Titan (TiO2-PVP), dispex-gekapptes Titan (TiO2-Dispex), Polystyrol und carboxyliertes Polystyrol-NMs identifiziert wurden. Prozentsätze beziehen sich auf die Häufigkeit der Proteine im Verhältnis zum Gesamtproteingehalt basierend auf der Top-3-Peptidhäufigkeit für jedes Protein. Angesichts der Beobachteten Unterschiede in den relativen Häufigkeiten von Proteinen in den verschiedenen NM-Koronen ist es klar, dass dieses vorgeschlagene Protokoll ausreichend empfindlich ist, um zwischen der Proteinkorona verschiedener NMs zu unterscheiden. Abbildung reproduziert aus einer CESI-MS-Analyse der Proteinkorona, veröffentlicht unter einem Open Access Creative Commons CC BY Lizenz11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Abbildung 3: Gezielte Analyse der kationischen Metaboliten in der NM-Korona. Adsorption von Kationen anSiO2 undTiO2 NMs. Rot bezieht sich auf die Anfangskonzentration von Metaboliten, während Blau sich auf die Konzentration von Metaboliten nach einer 1 h Inkubation mit den NMs bei 37 °C bezieht. Die Verringerung der Metabolitenkonzentration in der Lösung ist das Ergebnis der Metabolitenadsorption an der NM-Oberfläche. Für die Polystyrol-NMs wurde keine signifikante Adsorption von Metaboliten beobachtet. Box-Diagramme stellen die Minimal- und Maximalwerte, Median- und Interquartilbereiche dar. Abbildung reproduziert aus einer CESI-MS-gezielten Analyse des Metaboliten Corona, die unter einer Open-Access-Creative Commons CC BY-Lizenz15veröffentlicht wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Abbildung 4: Gezielte Analyse der anionischen Metaboliten in der NM-Korona mit Fokus auf Isomerenadsorption. Die Adsorption von Anionen an eine Reihe von Titan-NMs zeigt deutliche Unterschiede zwischen verschiedenen Isomeren wie den Zuckerphosphaten. Rot bezieht sich auf die Anfangskonzentration von Metaboliten, während Blau auf die Konzentration von Metaboliten nach einer 1 h Inkubation mit dem NM bei 37 °C verweist. Die Verringerung der Metabolitenkonzentration in Lösung ist das Ergebnis der Metabolitenadsorption an der NM-Oberfläche. FürsiO2 und die Polystyrol-NMs wurde keine signifikante Adsorption von Metaboliten beobachtet. Box-Diagramme stellen die Minimal- und Maximalwerte, Median- und Interquartilsbereiche dar. Abbildung reproduziert aus einer CESI-MS-gezielten Analyse des Metaboliten Corona, die unter einer Open-Access-Lizenz von Creative Common CC BY15veröffentlicht wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analyt</td>
			<td>Mittlere RSD-Spitzenfläche</td>
			<td>Mittlere RSD-Migrationszeit</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 Peptide intraday (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 Kationen intraday (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 Kationen intertags (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Reproduzierbarkeit von technischen CESI-MS-Replikaten für Peptide und kationische Metaboliten. RSD: relative Standardabweichung als Maß für die Reproduzierbarkeit. Die Reproduzierbarkeit von CESI-MS in Bezug auf Spitzengebiete und Migrationszeiten ist sehr gut, wobei alle Analyten einen mittleren RSD-&lt;15% und Migrationszeiten &lt;2,2% aufweisen. Diese Ergebnisse zeigen das hohe Maß an Vertrauen, das den mit dieser Technik gesammelten Daten zugeschrieben werden kann, und bestätigen, dass die festgestellten Variationen eher auf echte Unterschiede in der Probenzusammensetzung (Anreicherung auf NMs) als auf analytische Variationen zurückzuführen sind. Tabelle 2 wird aus den zuvor dargestellten Ergebnissen11,15generiert.

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Charakterisierung der vollständigen biomolekularen Korona, Proteine und Metaboliten, die von Nanomaterialien aus Biofluiden unter Verwendung eines Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie-Ansatzes gewonnen werden.

Kapillarelektrophorese Massenspektrometrie Ansätze zur Charakterisierung der protein- und metaboliten Korona, die von Nanomaterialien erfasst werden

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Dieses Protokoll ist das erste, das CESI-MS für die Charakterisierung nicht nur der Proteinkorona, sondern auch der Metabolitenkorona von Nanomaterialien implementiert. CESI bietet eine orthogonale Trennung zu herkömmlichen LCMS-Methoden, die sowohl hochgradig reproduzierbar als auch empfindlich ist, während nur wenige Nanoliter Probe verwendet werden. Zu Beginn werden zwei Milliliter des menschlichen Plasmas in ein Milliliter-Aliquot aufgeteilt, eines für den Metaboliten und die Proteinkorona und eines für die Charakterisierung des Plasmametaboloms.Inkubieren Sie ein Milligramm pro Milliliter Nanomaterialien im menschlichen Plasma für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und mischen Sie sanft mit 500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermomischer. Pelletieren Sie dann die Nanomaterialien, indem Sie sie 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 4.000 G zentrifugieren. Sammeln Sie den Plasmaüberstand für die Metaboliten-Korona-Analyse und bewahren Sie den Nanomaterial-Protein-Korona-Komplex für die Protein-Korona-Charakterisierung auf.Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 10X PBS-Puffer und wirbeln Sie es zwei Minuten lang kräftig ein, um ungebundene Proteine zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 4.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Nanomaterialien zu pelletieren, und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter ABC-Puffer und wirbeln Sie es zwei Minuten lang kräftig ein, um ungebundene Proteine und ungebundene Salze zu entfernen.Der Zentrifugationsschritt wird wiederholt und der Überstand verworfen. Lösen Sie das Pellet in 20 Mikrolitern ABC-Puffer auf, der 10 millimolares Dithiothreitol enthält, um Proteindisulfidbindungen zu reduzieren. Inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang bei 56 Grad Celsius.Geben Sie zwei Mikrogramm Trypsin in Sequenzierqualität zu den 20 Mikrolitern ABC-Puffer mit 0,1 % Tensid und inkubieren Sie die Aufschlusslösung 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Alkylieren Sie die Probe durch Zugabe von 20 Mikrolitern 55 millimolaren Jodacetals in 100 Millimolar ABC und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie 20 Mikroliter 0,1 molare Salzsäure hinzu, um das Tensid zu spalten, und lassen Sie die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.Anreichern und entsalzen Sie die Peptide mit einer C18-gepackten Entsalzungspipettenspitze, wie im Textmanuskript beschrieben. Anschließend wird die Probe lyophilisiert und bis zur Analyse bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Nehmen Sie das Kontrollplasma und den Überstand aus der Nanomaterial-Plasma-Inkubation und legen Sie sie auf Eis.50 Mikroliter aus jeder Probe werden in separate Fläschchen aliquotiert und mit destilliertem Wasser zehnfach verdünnt. Nach dem Vortexen 50 Mikroliter dieser verdünnten Probe in neue Fläschchen umfüllen. Fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform, 250 Mikroliter Methanol und 350 Mikroliter destilliertes Wasser hinzu und wirbeln Sie zwei Minuten lang kräftig ein.Zentrifugieren Sie bei 20, 800 mal G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Man nehme 500 Mikroliter des Überstands und filtriere ihn zwei Stunden lang bei 10.000 mal G bei vier Grad Celsius durch einen Drei-Kilodalton-Zentrifugalfilter. Trocknen Sie 430 Mikroliter des Ultrafiltrats in einem Schnellsauger und frieren Sie die Probe ein.Prüfen Sie vor dem Einbau der Kapillaren in das CESI-Instrument, ob die Einlass- und Auslassenden der Kapillaren intakt sind und ob keine sichtbaren Brüche in der Kapillare vorhanden sind. Setzen Sie dann eine neue neutralcodierte Kapillare gemäß den Herstellerrichtlinien in das Instrument ein. Die Trennkapillare wird in Vorwärtsrichtung mit 100 millimolar Salzsäure, dann mit BGE und schließlich mit destilliertem Wasser unter den in der Texthandschrift beschriebenen Bedingungen gespült.Spülen Sie dann sowohl die Trennkapillare als auch die leitfähige Kapillare mit BGE, gefolgt von destilliertem Wasser, 100 Millimolar Salzsäure, wieder destilliertem Wasser und schließlich mit BGE. Koppeln Sie CESI mit der Nano-Sprühquelle und dem Adapter an das MS. Für die Protein-Korona-Analyse resuspendieren Sie die lyophilisierten Proben in 20 Mikrolitern 50 millimolares Ammoniumacetat bei pH vier.Führen Sie die CESI-MS-Analyse für die Proben durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Erfassen Sie Massenspektrendaten zwischen 250 und 2.000 m/z mit der 10 datenabhängigen Fragmentierungserfassung der Top 10 und spülen Sie die Kapillare zwischen den Proben. Setzen Sie eine neue blanke Quarzglaskapillare in das CESI-Instrument ein.Spülen Sie die Trennkapillare in Vorwärtsrichtung mit 100 % Methanol und spülen Sie dann sowohl die Trennkapillare als auch die leitfähige Kapillare mit BGE, um die Tröpfchenbildung an den Auslassenden sicherzustellen. Spülen Sie dann die Kapillare mit destilliertem Wasser, gefolgt von 0,1 molaren Natriumhydroxid, wieder destilliertem Wasser und schließlich mit BGE. Koppeln Sie CESI mit der Nano-Sprühquelle und dem Adapter an das SEMS.Um eine Metaboliten-Korona-Analyse durchzuführen, resuspendieren Sie die exponierten und nicht exponierten Plasmaproben des Nanomaterials in 430 Mikrolitern destilliertem Wasser und wirbeln Sie sie zwei Minuten lang kräftig vortexen. Filtern Sie die Proben durch einen 0,1 Mikrometer großen Membranfilter. Geben Sie fünf Mikroliter der internen Standards, wie im Textmanuskript erwähnt, zu 95 Mikrolitern des Filtrats und wirbeln Sie kräftig ein.Zentrifugieren Sie bei 16, 100 mal G und vier Grad Celsius. Führen Sie die CESI-MS-Analyse für die Proben durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Die Verwendung von CESI-MS für die proteomische und metabolomische Trennung und Detektion zeigt für jeden Ansatz gute Trennfenster auf beiden Kapillaren, was eine umfassende Charakterisierung der biomolekularen Korona ermöglicht.Die proteomische CESI-MS-Methode ist in der Lage, zwischen einer Reihe von Proteinen und Proteinkonzentrationen in der Korona über ein breites Spektrum von Nanomaterialzusammensetzungen hinweg zu unterscheiden und für jedes Nanomaterial eine einzigartige Proteinkorona zu unterscheiden. Dieser CESI-MS-Metabolomik-Ansatz ermöglicht eine quantitative Analyse der Metabolitenkorona und kann zur Aufdeckung ihrer einzigartigen Fingerabdrücke verwendet werden. Obwohl dieser Ansatz die Nanomaterial-Metabolitenkorona passiv charakterisiert, ist er dennoch in der Lage, interessante Einblicke in die Rolle von Metaboliten in der biomolekularen Korona zu gewinnen, wie z.B. die differentielle Absorption von Isomeren.Diese Technik ermöglicht es, sowohl das Protein als auch die Metabolitenkorona zu charakterisieren, was ein besseres Verständnis dafür ermöglicht, wie sich die gesamte biomolekulare Korona auf die Aufnahme von Nanomaterialien durch Zellen auswirkt.

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Die Massenspektrometrie hat sich als wertvolles Tool für die Analyse großer Proteinkomplexe werden. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Zusammensetzung, Stöchiometrie und Gesamtarchitektur des Multi-Untereinheit Baugruppen. Hier beschreiben wir, Schritt-für-Schritt, wie man ein strukturelles Massenspektrometrie-Analyse durchzuführen, und Charakterisierung makromolekularen Strukturen.

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Die Architektur von Proteinkomplexen ist essentiell für ihre Funktion. Kombination von verschiedenen massenspektrometrischen Techniken erwies sich als leistungsstarke, deren Montage zu studieren. Wir bieten Protokolle für chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie und zeigen, wie diese komplementären Techniken helfen, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen aufzuklären.

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Der Zweck dieses Artikels ist es, ein Protokoll für die Extraktion von wässrigen Metaboliten aus kultivierten, anhaftenden Zellen für die metabolomische Analyse zu beschreiben, insbesondere die kapillare Elektrophoresen-Massenspektrometrie.

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Erfahren Sie die Charakterisierung der Protein- und Metabolitenkorona von Nanomaterialien mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht eine umfassende biomolekulare Analyse mit hoher Sensitivität.

Kapillarelektrophorese Massenspektrometrie Ansätze zur Charakterisierung der protein- und metaboliten Korona, die von Nanomaterialien erfasst werden (Video) | JoVE Journal

Kapillarelektrophorese Massenspektrometrie Ansätze zur Charakterisierung der protein- und metaboliten Korona, die von Nanomaterialien erfasst werden

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