Kapillarelektrophorese Massenspektrometrie Ansätze zur Charakterisierung der protein- und metaboliten Korona, die von Nanomaterialien erfasst werden

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Charakterisierung der vollständigen biomolekularen Korona, Proteine und Metaboliten, die von Nanomaterialien aus Biofluiden unter Verwendung eines Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie-Ansatzes gewonnen werden.

Dieses Protokoll ist das erste, das CESI-MS für die Charakterisierung nicht nur der Proteinkorona, sondern auch der Metabolitenkorona von Nanomaterialien implementiert. CESI bietet eine orthogonale Trennung zu herkömmlichen LCMS-Methoden, die sowohl hochgradig reproduzierbar als auch empfindlich ist, während nur wenige Nanoliter Probe verwendet werden. Zu Beginn werden zwei Milliliter des menschlichen Plasmas in ein Milliliter-Aliquot aufgeteilt, eines für den Metaboliten und die Proteinkorona und eines für die Charakterisierung des Plasmametaboloms.

Inkubieren Sie ein Milligramm pro Milliliter Nanomaterialien im menschlichen Plasma für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und mischen Sie sanft mit 500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermomischer. Pelletieren Sie dann die Nanomaterialien, indem Sie sie 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 4.000 G zentrifugieren. Sammeln Sie den Plasmaüberstand für die Metaboliten-Korona-Analyse und bewahren Sie den Nanomaterial-Protein-Korona-Komplex für die Protein-Korona-Charakterisierung auf.

Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 10X PBS-Puffer und wirbeln Sie es zwei Minuten lang kräftig ein, um ungebundene Proteine zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 4.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Nanomaterialien zu pelletieren, und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter ABC-Puffer und wirbeln Sie es zwei Minuten lang kräftig ein, um ungebundene Proteine und ungebundene Salze zu entfernen.

Der Zentrifugationsschritt wird wiederholt und der Überstand verworfen. Lösen Sie das Pellet in 20 Mikrolitern ABC-Puffer auf, der 10 millimolares Dithiothreitol enthält, um Proteindisulfidbindungen zu reduzieren. Inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang bei 56 Grad Celsius.

Geben Sie zwei Mikrogramm Trypsin in Sequenzierqualität zu den 20 Mikrolitern ABC-Puffer mit 0,1 % Tensid und inkubieren Sie die Aufschlusslösung 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Alkylieren Sie die Probe durch Zugabe von 20 Mikrolitern 55 millimolaren Jodacetals in 100 Millimolar ABC und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie 20 Mikroliter 0,1 molare Salzsäure hinzu, um das Tensid zu spalten, und lassen Sie die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Anreichern und entsalzen Sie die Peptide mit einer C18-gepackten Entsalzungspipettenspitze, wie im Textmanuskript beschrieben. Anschließend wird die Probe lyophilisiert und bis zur Analyse bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Nehmen Sie das Kontrollplasma und den Überstand aus der Nanomaterial-Plasma-Inkubation und legen Sie sie auf Eis.

50 Mikroliter aus jeder Probe werden in separate Fläschchen aliquotiert und mit destilliertem Wasser zehnfach verdünnt. Nach dem Vortexen 50 Mikroliter dieser verdünnten Probe in neue Fläschchen umfüllen. Fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform, 250 Mikroliter Methanol und 350 Mikroliter destilliertes Wasser hinzu und wirbeln Sie zwei Minuten lang kräftig ein.

Zentrifugieren Sie bei 20, 800 mal G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Man nehme 500 Mikroliter des Überstands und filtriere ihn zwei Stunden lang bei 10.000 mal G bei vier Grad Celsius durch einen Drei-Kilodalton-Zentrifugalfilter. Trocknen Sie 430 Mikroliter des Ultrafiltrats in einem Schnellsauger und frieren Sie die Probe ein.

Prüfen Sie vor dem Einbau der Kapillaren in das CESI-Instrument, ob die Einlass- und Auslassenden der Kapillaren intakt sind und ob keine sichtbaren Brüche in der Kapillare vorhanden sind. Setzen Sie dann eine neue neutralcodierte Kapillare gemäß den Herstellerrichtlinien in das Instrument ein. Die Trennkapillare wird in Vorwärtsrichtung mit 100 millimolar Salzsäure, dann mit BGE und schließlich mit destilliertem Wasser unter den in der Texthandschrift beschriebenen Bedingungen gespült.

Spülen Sie dann sowohl die Trennkapillare als auch die leitfähige Kapillare mit BGE, gefolgt von destilliertem Wasser, 100 Millimolar Salzsäure, wieder destilliertem Wasser und schließlich mit BGE. Koppeln Sie CESI mit der Nano-Sprühquelle und dem Adapter an das MS. Für die Protein-Korona-Analyse resuspendieren Sie die lyophilisierten Proben in 20 Mikrolitern 50 millimolares Ammoniumacetat bei pH vier.

Führen Sie die CESI-MS-Analyse für die Proben durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Erfassen Sie Massenspektrendaten zwischen 250 und 2.000 m/z mit der 10 datenabhängigen Fragmentierungserfassung der Top 10 und spülen Sie die Kapillare zwischen den Proben. Setzen Sie eine neue blanke Quarzglaskapillare in das CESI-Instrument ein.

Spülen Sie die Trennkapillare in Vorwärtsrichtung mit 100 % Methanol und spülen Sie dann sowohl die Trennkapillare als auch die leitfähige Kapillare mit BGE, um die Tröpfchenbildung an den Auslassenden sicherzustellen. Spülen Sie dann die Kapillare mit destilliertem Wasser, gefolgt von 0,1 molaren Natriumhydroxid, wieder destilliertem Wasser und schließlich mit BGE. Koppeln Sie CESI mit der Nano-Sprühquelle und dem Adapter an das SEMS.

Um eine Metaboliten-Korona-Analyse durchzuführen, resuspendieren Sie die exponierten und nicht exponierten Plasmaproben des Nanomaterials in 430 Mikrolitern destilliertem Wasser und wirbeln Sie sie zwei Minuten lang kräftig vortexen. Filtern Sie die Proben durch einen 0,1 Mikrometer großen Membranfilter. Geben Sie fünf Mikroliter der internen Standards, wie im Textmanuskript erwähnt, zu 95 Mikrolitern des Filtrats und wirbeln Sie kräftig ein.

Zentrifugieren Sie bei 16, 100 mal G und vier Grad Celsius. Führen Sie die CESI-MS-Analyse für die Proben durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Die Verwendung von CESI-MS für die proteomische und metabolomische Trennung und Detektion zeigt für jeden Ansatz gute Trennfenster auf beiden Kapillaren, was eine umfassende Charakterisierung der biomolekularen Korona ermöglicht.

Die proteomische CESI-MS-Methode ist in der Lage, zwischen einer Reihe von Proteinen und Proteinkonzentrationen in der Korona über ein breites Spektrum von Nanomaterialzusammensetzungen hinweg zu unterscheiden und für jedes Nanomaterial eine einzigartige Proteinkorona zu unterscheiden. Dieser CESI-MS-Metabolomik-Ansatz ermöglicht eine quantitative Analyse der Metabolitenkorona und kann zur Aufdeckung ihrer einzigartigen Fingerabdrücke verwendet werden. Obwohl dieser Ansatz die Nanomaterial-Metabolitenkorona passiv charakterisiert, ist er dennoch in der Lage, interessante Einblicke in die Rolle von Metaboliten in der biomolekularen Korona zu gewinnen, wie z.B. die differentielle Absorption von Isomeren.

Diese Technik ermöglicht es, sowohl das Protein als auch die Metabolitenkorona zu charakterisieren, was ein besseres Verständnis dafür ermöglicht, wie sich die gesamte biomolekulare Korona auf die Aufnahme von Nanomaterialien durch Zellen auswirkt.