Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

Es wird erwartet, dass die hier beschriebenen Protokolle zukünftige Studien zu oligodendroglialen Defekten in der Pathogenese der Neurodegeneration erleichtern werden. Dabei handelt es sich um eine verbesserte Methode, mit der in nur drei bis vier Wochen funktionsfähige Zellen der menschlichen Oligodendrozytenlinie erzeugt und ein Co-Kultursystem zur Modellierung der Neuronen-Oligodendrozytenverbindungen etabliert werden kann. Das Protokoll kann verwendet werden, um nicht nur die Alzheimer-Krankheit, sondern auch jeden anderen krankheitsassoziierten Aspekt der Neuronen-Oligodendrozyten-Interaktionen zu untersuchen.

Zu Beginn werden etwa eine Million HEK293T Zellen in jedem T75-Kolben plattiert, um eine Konfluenz von 40 % zu erreichen, und dann transfiziert man sie mit Plasmiden, die das Tetracyclin-induzierbare NGN2 und das Puromycin-resistente Tetracyclin-Transaktivator-Gen exprimieren, zusammen mit den drei Helferplasmiden. Verwenden Sie PEI für die Transfektion. Wechseln Sie das Medium nach 16 Stunden.

Harvest entlud freigesetzte Viruspartikel, indem es jeden Tag Nährmedien sammelte und sie drei Tage lang durch frische Medien ersetzte. Mischen Sie das gesammelte Medium für die Reinigung, filtrieren Sie das Virus durch einen 0,22-Mikrometer-Filter und zentrifugieren Sie es 90 Minuten lang bei 49.000 G G. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie das Pellet in der entsprechenden Menge PBS-Glukose.

Verwenden Sie kommerziell erhältliche humane H1-ES-Zellen, um die Neuroneninduktion durchzuführen. Kultivieren Sie die Zellen auf extrazellulären Matrixlösungen, die mit ESL-Erhaltungsmedium beschichtet sind, und inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Zwei Tage vor der Induktion der Differenzierung lösen Sie ES-Zellen ab, indem Sie einen Milliliter Zellablösungslösung hinzufügen und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen, waschen Sie dann die Vertiefung mit zwei Millilitern Medium und geben Sie es in dasselbe Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300-fachem G. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in Medien und plattieren Sie die Zellen auf matrixbeschichtete 6-Well-Platten mit einer Sitzdichte von eins mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Well.

Fügen Sie am nächsten Tag Lentiviren hinzu, die NGN2 plus Puro exprimieren. R und Tetracyclin-Transaktivator zusammen mit Polybren in frischem ES-Zellerhaltungsmedium. Am Tag Null fügen Sie zwei Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin in DMEM/F-12-Medium hinzu, das mit N2 und ohne Morphogene ergänzt ist.

Am ersten Tag fügen Sie Puromycin in frischem DMEM/F-12 sowie N2 und Doxycyclin bis zu einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Wählen Sie die transduzierten Zellen in Puromycin für mindestens 24 Stunden aus. Am zweiten Tag lösen Sie differenzierende Neuronen mit Zellablösungslösung ab und plattieren sie erneut auf 24-Well-Platten, die mit Matrixlösung beschichtet sind.

Pflegen Sie sie in MBA B27 Medium ohne Doxycyclin. Kultivieren Sie reine induzierte Neuronen auf den Platten, die mit Lösungen auf Basis extrazellulärer Matrix beschichtet sind. Um die Generierung neuraler Vorläuferzellen durchzuführen, kultivieren Sie H1-humane ES-Zellen und transdifferenzieren sie in neurale Vorläuferzellen, wie im Textmanuskript beschrieben.

Am negativen ersten Tag werden 0,5 bis 1 Million Zellen im ES-Zellerhaltungsmedium in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte gesät, die mit einer Wachstumsfaktor-reduzierten Matrixlösung beschichtet ist. Behandeln Sie die Zellen am Tag Null 24 Stunden lang mit ES-Zellerhaltungsmedium, das mit 2 % DMSO ergänzt wird. Wechseln Sie an den Tagen eins bis sechs das gesamte Medium durch ein warmes neuronales Induktionsmedium, das einige Add-Inhibitoren aus einem kommerziellen Kit enthält.

Am siebten Tag wird die Passage NPCs mit einer Zellablösungslösung durchgeführt und mit einer Sitzdichte von ein bis zwei mal 10 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte plattiert. Assay der Differenzierungseffizienz durch immunhistochemische Färbung auf Abwesenheit von Pluripotentitätsmarkern und das Vorhandensein von NPC-Markern. Um die Oligodendrozyten-Vorläuferzellen zu erzeugen, werden die NPCs in warmes neuronales Induktionsmedium mit einigen Addierinhibitoren aus einem kommerziellen Kit beschichtet.

Bereiten Sie am achten Tag eine Lösung von 1 %DMSO im OPC-Differenzierungsmedium vor und behandeln Sie die plattierten NPCs 24 Stunden lang. Ersetzen Sie am neunten Tag das Medium durch frisches OPC-Differenzierungsmedium ohne DMSO und füttern Sie die Zellen dann jeden zweiten Tag bis zum 15. Tag. Wenn die Zellen vor dem 15. Tag die Konfluenz erreichen, passieren sie auf die Sitzdichte von ein bis zwei mal 10 zu den fünften Zellen pro Well.

Am Tag 14 werden OPCs in OPC-Differenzierungsmedium mit einer Dichte von ein bis zwei mal 10 Zellen pro Well, in einer 24-Well-Platte, plattiert. Testzellen auf das Vorhandensein von OPC-spezifischen Markern durch IHC-Färbung oder qPCR und auf das Fehlen von NPC-Markern. Ersetzen Sie das Medium am 15. Tag durch das OL-Reifemedium.

Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag oder jeden Tag. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen, teilen Sie sie in einem Verhältnis von eins zu drei für bis zu zwei Passagen oder bis sich die Zellteilung erheblich verlangsamt. Wenn sich OPCs zu schnell teilen und in weniger als drei Tagen Konfluenz erreichen, fügen Sie Ara-C in einer Konzentration von zwei bis fünf Mikromolaren für ein bis drei Tage hinzu.

An Tag 14 plattieren Sie die IOPCs mit einer Dichte von eins mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Well in einer 24-Well-Platte in OPC-Differenzierungsmedium. Am nächsten Tag lösen Sie die induzierten menschlichen Neuronen mit einer Lösung zur Zellablösung. Fügen Sie Neuronen zu den kultivierten OPCs hinzu und plattieren Sie mit einer Sitzdichte von zweimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Well.

Verwenden Sie ein Co-Kulturmedium mit neurobasalem A-Medium, 2 % B27-Supplement und 100 Nanogramm pro Milliliter T3-Trijodthyronin. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag. Wenn sich OPCs zu schnell vermehren und in weniger als drei Tagen Konfluenz erreichen, fügen Sie zwei bis fünf mikromolare Ara-C hinzu.

Es ist wichtig, dass die humanen pluripotenten Stammzellen einen hohen Grad an Pluripotentität aufweisen, um erfolgreich induzierte Neuronen oder OPCs und Oligodendrozyten erzeugen zu können. Daher sollten die Zellen auf spezifische Marker wie OCT-4 und SOX2 gefärbt werden, bevor eines der Induktionsprotokolle gestartet wird. Humane H1-Zellen wurden verwendet, um induzierte exzitatorische Vorderhirnneuronen zu erhalten.

Reine Neuronen in Kultur begannen an den Tagen 14 bis 16 mit der Expression von Synapsen in einem. IOPCs wurden in zwei Wochen und reife Oligodendrozyten in vier bis fünf Wochen erzeugt. Die DMSO-Behandlung bereicherte die Anzahl der Zellen in der frühen G1-Phase für eine bessere Signalintegration.

Spezifische OPC-Marker wurden bereits zwei Wochen nach der Beschichtung von ES H1-Zellen nachgewiesen. Die IOPC-Population war nach zwei Wochen ziemlich homogen, mit über 95 % der Zellen positiv für die 04-Färbung und einem hohen Maß an Immunreaktivität für andere Marker. Nach Beginn der Oligodendrozytenreifung wurden ab Tag 28 spezifische Oligodendrozytenmarker nachgewiesen.

Die idealen Plattierungsdichten für induzierte Neuronen und IOPCs müssen mit einer Reihe von Zellzahltitrationen bestimmt werden, um eine korrekte Differenzierung zu erreichen. Nach vier Wochen sollten die IOPCs in Co-Kulturen ausreichend in Oligodendrozyten differenziert sein, die positiv für bestimmte Marker wie MBP sind. Dieses Co-Kultursystem kann die Anzahl der Synapsen robust erhöhen, was darauf hindeutet, dass die IOPCs durch physischen Kontakt oder die Freisetzung trophischer Faktoren eine neuronale Unterstützung bieten.

Dieses beschriebene Verfahren kann durch das Hinzufügen verschiedener Gehirnzelltypen weiter verfeinert werden. Zum Beispiel haben Stammzellen menschliche Astrozyten gewonnen, um neue Aspekte der neuronalen Gliainteraktionen bei Gesundheit und Krankheit zu modellieren.