Hochdurchsatz-Zellprofilierung gezielter Proteinabbauverbindungen mit HiBiT-CRISPR-Zelllinien
November 9th, 2020
Dieses Protokoll beschreibt den quantitativen lumineszierenden Nachweis der Proteinabbaukinetik in lebenden Zellen, die unter Verwendung von CRISPR/Cas9 entwickelt wurden, um Antikörper freies endogenes Protein-Detektions-Tag zu exprimieren, das mit einem Zielprotein fusioniert ist. Detaillierte Anweisungen zum Berechnen und Abrufen der quantitativen Abbauparameter, Rate, Dmax, DC 50 und Dmax50 sind enthalten.
Dieser Ansatz ermöglicht die zelluläre Überwachung des Proteinabbaus und ein schnelles Screening von Degrader-Verbindungen. Die Dynamik des Abbaus kann im zellulären Kontext hochsensitiv und quantitativ überwacht werden, was eine genaue Bestimmung der wichtigsten Degradationsparameter ermöglicht. Diese Methoden ermöglichen die Erstellung von HTS-Profilen der Aktivität von Degrader-Verbindungen und ermöglichen so eine Triage in der frühen therapeutischen Entdeckungsphase.
Sie bieten auch Einblicke für alle, die die Modulation endogener Zielwerte untersuchen möchten, unabhängig davon, ob sie steigen oder fallen. Das Verfahren wird von Celia Bisbach, einer Forscherin in meinem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie mit der Vorbereitung und Beschichtung von Säugetier-Adhärement- oder Suspensionszellen.
Stellen Sie die Zelldichte auf 2,22 mal 10 bis 5 Zellen pro Milliliter ein und geben Sie sie in Platten mit mindestens drei Vertiefungen pro Versuchs- und Kontrollbedingung ab. Bereiten Sie seriell verdünnte PROTAC- oder Degrader-Testverbindungsplatten in 1000-facher Konzentration in 100 % DMSO vor. Verdünnen Sie es dann auf die 10-fache Endkonzentration im Zellkulturmedium.
Fügen Sie dem Medium das gleiche Volumen DMSO hinzu, um eine DMSO-Steuerung ohne Verbindungen zu erstellen. Geben Sie die entsprechende Menge der 10-fachen Verbindung oder Kontrolllösung zu den Zellen in der Platte und inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. Um das Endpunkt-Lumineszenzsignal zu messen, bereiten Sie ein 2x lytisches Nachweisreagenz vor, indem Sie 20 Mikroliter lytisches Substrat und 10 Mikroliter LgBiT-Protein für jeden Milliliter des lytischen Puffers hinzufügen.
Bereiten Sie genügend Reagenz für alle zu testenden Wells vor, einschließlich zusätzlichem Volumen, um Pipettierfehler zu berücksichtigen. Geben Sie das vorbereitete lytische Detektionsreagenz in die Zellen und mischen Sie die Platte auf einem Mikrotiterplatten-Vortex-Mischer für 10 bis 20 Minuten bei 350 U/min. Messen Sie die Lumineszenz mit einem Luminometer, das eine 96- oder 384-Well-Platte lesen kann.
Wenn Sie Zellviabilitätsmultiplexing verwenden, tun Sie dies vor der Zugabe des lytischen Reagenzes. 30 bis 40 Minuten vor der gewünschten Endpunktmessung bereiten Sie eine 6x Reagenzlösung zum Nachweis der Zellviabilität vor, indem Sie 10 Mikroliter des Substrats zu zwei Millilitern des Assay-Puffers hinzufügen. Geben Sie das vorbereitete Reagenz in die Vertiefungen und mischen Sie es kurz auf einem Mikrotiterplatten-Vortex-Mischer.
Inkubieren Sie die Platte dann 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Messen Sie die Fluoreszenz am gewünschten Endpunkt mit einem Gerät, das Fluoreszenz im 96- oder 384-Well-Format lesen kann. Bereiten Sie 2x lytisches Reagenz wie zuvor beschrieben vor
.Geben Sie dann das Reagenz in die Vertiefungen und mischen Sie die Platte 10 bis 20 Minuten lang auf einem Mikrotiterplatten-Vortex-Mischer. Verwenden Sie nach dem Mischen ein Luminometer, um die Lumineszenz zu messen. Um die lytische Degradationsanalyse mit einem Endpunkt in einer Konzentration zu demonstrieren, wurden mehrere CDK-Zielproteine endogen mit HiBiT markiert und mit dem Pan-Kinesse-Cereblon-basierten PROTAC TL12-186 behandelt.
Der CDK-Proteinspiegel wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen und die fraktionierte RLU bestimmt. Um zu verstehen, wie CDK-Proteine in Bezug auf den Proteinverlust direkt miteinander verglichen werden, wurden die fraktionierten RLUs als prozentualer Gesamtabbau berechnet. Eine kinetische Abbauanalyse wurde durchgeführt, indem Proteine der BET-Familie endogen mit HiBiT- und HEK293-Zellen markiert wurden, die das LgBiT-Protein stabil exprimieren.
Die Zellen wurden dann mit drei verschiedenen Konzentrationen der pan-BET PROTACs behandelt. Das Cereblon-basierte dBET6 und das VHL-basierte ARV-771. Hier sind kinetische Dosis-Wirkungs-Degradationsprofile von Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat-Zellen gezeigt, die das LgBiT-Protein stabil exprimieren und mit vier verschiedenen molekularen Klebeverbindungen behandelt wurden.
Es werden signifikante Unterschiede in der Abbaureaktion zwischen den Verbindungen sowie zwischen den Konzentrationsreihen beobachtet. Um den Abbau und die Rangfolge der Verbindungen quantitativ zu bewerten, wurden die Dosis-Wirkungs-Profile verwendet, um wichtige Abbauparameter wie die Abbaurate, das Abbaumaximum und die Dmax50-Werte zu berechnen. Multiplex-Assays zur Zellviabilität zeigten bei den getesteten Konzentrationen keinen Verlust der Zellviabilität.
Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die Bestimmung der fraktionierten RLU oder prozentualen Degradation durch Normalisierung auf die DMSO-Kontrolle. Nach diesem Protokoll könnte man einen phänotypischen Assay durchführen, um zu verstehen, wie sich der Verlust eines bestimmten Proteins auf die Zellgesundheit oder -funktion auswirken kann. Darüber hinaus können diese HiBiT-Zelllinien auch verwendet werden, um Proteininteraktionen oder die Bindung kleiner Moleküle mit der NanoBRET-Technologie zu untersuchen.
Überblick
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur quantitativen Erkennung der Proteinabbau-Kinetik in lebenden Zellen unter Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie. Es enthält detaillierte Anweisungen zur Berechnung von Abbauparametern wie Rate und Dmax.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellbiologie
- Proteinabbau
- CRISPR/Cas9-Technologie
Hintergrund
- Das Verständnis des Proteinabbaus ist entscheidend für die zelluläre Gesundheit.
- CRISPR/Cas9 ermöglicht präzise genetische Modifikationen.
- Die Überwachung des Abbaus kann bei der Entdeckung von Therapien helfen.
- Quantitative Methoden erhöhen die Genauigkeit von Abbaustudien.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Überwachung des Proteinabbaus in lebenden Zellen.
- Ermöglichung eines Hochdurchsatz-Screenings von Degrader-Verbindungen.
- Bereitstellung von Einblicken in die Modulation endogener Proteinspiegel.
Verwendete Methoden
- Präparation und Anlegen von Säugerzellen bei spezifischen Dichten.
- Serielle Verdünnung von PROTAC-Verbindungen zum Testen.
- Verwendung lumineszenzbasierter Nachweisreagenzien zur Messung des Abbaus.
- Berechnung von Abbauparametern aus Lumineszenzdaten.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Überwachung der Proteinabbau-Kinetik in lebenden Zellen.
- Identifizierung signifikanter Unterschiede in den Abbauantworten zwischen den Verbindungen.
- Quantitative Beurteilung der Abbaurate und der maximalen Abbauwerte.
- Während der Experimente kein Verlust der Zelllebensfähigkeit beobachtet.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll erleichtert die Untersuchung der Proteinabbau-Dynamik.
- Es kann angewendet werden, um die Auswirkungen des Proteinverlusts auf zelluläre Funktionen zu bewerten.
- HiBiT-markierte Zelllinien sind nützlich für die Untersuchung von Proteinwechselwirkungen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative, high-throughput assessment of targeted protein degradation in physiologically relevant cellular contexts, supporting early triage of degrader compounds. By maintaining endogenous expression and regulation of target proteins, it provides predictive confidence in lead optimization and reduces mechanistic ambiguity in discovery pipelines. The approach directly informs go/no-go decisions by linking compound-induced target degradation to measurable phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of target protein loss in native cellular environments.
- Operational Value: Supports functional target validation by quantifying degradation kinetics and potency under physiological regulation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating degradation rate, Dmax, and DC50 parameters for lead prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: CRISPR-engineered HiBiT cell lines provide standardized, reproducible systems for luminescent readout of target degradation.
- Multiplexing Capability: Compatible with cell viability assays to distinguish specific target effects from cytotoxicity during screening.
- Scalability: Luminescent signal detection in 96- or 384-well formats enables high-throughput profiling of degrader compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains endogenous protein expression and regulation, improving relevance to in vivo disease models.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of target degradation with functional cellular phenotypes, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Predictive Confidence: Quantitative degradation profiling reduces late-stage failure risk by confirming target engagement in relevant cellular backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification and preceding lead optimization, providing degradation-competent cellular systems for compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time or endpoint measurement of target protein degradation in live cells.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (rate, Dmax, DC50) for high-throughput evaluation of degrader compound libraries.
- Analytics: Generates normalized degradation metrics that allow cross-compound comparison and rank-ordering based on target engagement.
- Translational Research: Connects target degradation to functional outcomes via multiplexed viability assays, informing risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: HiBiT-tagged cell lines serve as reusable assets across multiple projects targeting different proteins or degradation mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation, reduces mechanistic ambiguity, and enables functional target validation.
- Operational Value: Ensures assay standardization, reproducibility, and scalability across screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, enhances capital efficiency, and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of degrader leads based on quantitative degradation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 genome editing and clonal cell line development.
- Dependent on luminescent plate readers capable of 96- or 384-well format detection.
- Necessitates standardization of cell plating density and reagent preparation across wells.
- Adaptation considerations include varying endogenous expression levels and subcellular localization of target proteins.
- Practical limitations include signal dynamic range constraints in highly abundant or rapidly turning over target proteins.
