Hochdurchsatz-Zellprofilierung gezielter Proteinabbauverbindungen mit HiBiT-CRISPR-Zelllinien
9. November 2020
Dieses Protokoll beschreibt den quantitativen lumineszierenden Nachweis der Proteinabbaukinetik in lebenden Zellen, die unter Verwendung von CRISPR/Cas9 entwickelt wurden, um Antikörper freies endogenes Protein-Detektions-Tag zu exprimieren, das mit einem Zielprotein fusioniert ist. Detaillierte Anweisungen zum Berechnen und Abrufen der quantitativen Abbauparameter, Rate, Dmax, DC 50 und Dmax50 sind enthalten.
Dieser Ansatz ermöglicht die zelluläre Überwachung des Proteinabbaus und ein schnelles Screening von Degrader-Verbindungen. Die Dynamik des Abbaus kann im zellulären Kontext hochsensitiv und quantitativ überwacht werden, was eine genaue Bestimmung der wichtigsten Degradationsparameter ermöglicht. Diese Methoden ermöglichen die Erstellung von HTS-Profilen der Aktivität von Degrader-Verbindungen und ermöglichen so eine Triage in der frühen therapeutischen Entdeckungsphase.
Sie bieten auch Einblicke für alle, die die Modulation endogener Zielwerte untersuchen möchten, unabhängig davon, ob sie steigen oder fallen. Das Verfahren wird von Celia Bisbach, einer Forscherin in meinem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie mit der Vorbereitung und Beschichtung von Säugetier-Adhärement- oder Suspensionszellen.
Stellen Sie die Zelldichte auf 2,22 mal 10 bis 5 Zellen pro Milliliter ein und geben Sie sie in Platten mit mindestens drei Vertiefungen pro Versuchs- und Kontrollbedingung ab. Bereiten Sie seriell verdünnte PROTAC- oder Degrader-Testverbindungsplatten in 1000-facher Konzentration in 100 % DMSO vor. Verdünnen Sie es dann auf die 10-fache Endkonzentration im Zellkulturmedium.
Fügen Sie dem Medium das gleiche Volumen DMSO hinzu, um eine DMSO-Steuerung ohne Verbindungen zu erstellen. Geben Sie die entsprechende Menge der 10-fachen Verbindung oder Kontrolllösung zu den Zellen in der Platte und inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. Um das Endpunkt-Lumineszenzsignal zu messen, bereiten Sie ein 2x lytisches Nachweisreagenz vor, indem Sie 20 Mikroliter lytisches Substrat und 10 Mikroliter LgBiT-Protein für jeden Milliliter des lytischen Puffers hinzufügen.
Bereiten Sie genügend Reagenz für alle zu testenden Wells vor, einschließlich zusätzlichem Volumen, um Pipettierfehler zu berücksichtigen. Geben Sie das vorbereitete lytische Detektionsreagenz in die Zellen und mischen Sie die Platte auf einem Mikrotiterplatten-Vortex-Mischer für 10 bis 20 Minuten bei 350 U/min. Messen Sie die Lumineszenz mit einem Luminometer, das eine 96- oder 384-Well-Platte lesen kann.
Wenn Sie Zellviabilitätsmultiplexing verwenden, tun Sie dies vor der Zugabe des lytischen Reagenzes. 30 bis 40 Minuten vor der gewünschten Endpunktmessung bereiten Sie eine 6x Reagenzlösung zum Nachweis der Zellviabilität vor, indem Sie 10 Mikroliter des Substrats zu zwei Millilitern des Assay-Puffers hinzufügen. Geben Sie das vorbereitete Reagenz in die Vertiefungen und mischen Sie es kurz auf einem Mikrotiterplatten-Vortex-Mischer.
Inkubieren Sie die Platte dann 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Messen Sie die Fluoreszenz am gewünschten Endpunkt mit einem Gerät, das Fluoreszenz im 96- oder 384-Well-Format lesen kann. Bereiten Sie 2x lytisches Reagenz wie zuvor beschrieben vor
.Geben Sie dann das Reagenz in die Vertiefungen und mischen Sie die Platte 10 bis 20 Minuten lang auf einem Mikrotiterplatten-Vortex-Mischer. Verwenden Sie nach dem Mischen ein Luminometer, um die Lumineszenz zu messen. Um die lytische Degradationsanalyse mit einem Endpunkt in einer Konzentration zu demonstrieren, wurden mehrere CDK-Zielproteine endogen mit HiBiT markiert und mit dem Pan-Kinesse-Cereblon-basierten PROTAC TL12-186 behandelt.
Der CDK-Proteinspiegel wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen und die fraktionierte RLU bestimmt. Um zu verstehen, wie CDK-Proteine in Bezug auf den Proteinverlust direkt miteinander verglichen werden, wurden die fraktionierten RLUs als prozentualer Gesamtabbau berechnet. Eine kinetische Abbauanalyse wurde durchgeführt, indem Proteine der BET-Familie endogen mit HiBiT- und HEK293-Zellen markiert wurden, die das LgBiT-Protein stabil exprimieren.
Die Zellen wurden dann mit drei verschiedenen Konzentrationen der pan-BET PROTACs behandelt. Das Cereblon-basierte dBET6 und das VHL-basierte ARV-771. Hier sind kinetische Dosis-Wirkungs-Degradationsprofile von Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat-Zellen gezeigt, die das LgBiT-Protein stabil exprimieren und mit vier verschiedenen molekularen Klebeverbindungen behandelt wurden.
Es werden signifikante Unterschiede in der Abbaureaktion zwischen den Verbindungen sowie zwischen den Konzentrationsreihen beobachtet. Um den Abbau und die Rangfolge der Verbindungen quantitativ zu bewerten, wurden die Dosis-Wirkungs-Profile verwendet, um wichtige Abbauparameter wie die Abbaurate, das Abbaumaximum und die Dmax50-Werte zu berechnen. Multiplex-Assays zur Zellviabilität zeigten bei den getesteten Konzentrationen keinen Verlust der Zellviabilität.
Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die Bestimmung der fraktionierten RLU oder prozentualen Degradation durch Normalisierung auf die DMSO-Kontrolle. Nach diesem Protokoll könnte man einen phänotypischen Assay durchführen, um zu verstehen, wie sich der Verlust eines bestimmten Proteins auf die Zellgesundheit oder -funktion auswirken kann. Darüber hinaus können diese HiBiT-Zelllinien auch verwendet werden, um Proteininteraktionen oder die Bindung kleiner Moleküle mit der NanoBRET-Technologie zu untersuchen.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur quantitativen Erfassung der Kinetik des Proteinabbaus in lebenden Zellen unter Verwendung der CRISPR/Cas9-Technologie. Es enthält detaillierte Anweisungen zur Berechnung von Abbauparametern wie Rate und Dmax.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Proteindegradation
- CRISPR/Cas9-Technologie
Hintergrund
- Das Verständnis des Proteinabbaus ist entscheidend für die zelluläre Gesundheit.
- CRISPR/Cas9 ermöglicht präzise genetische Modifikationen.
- Die Überwachung des Abbaus kann bei der Entwicklung von Therapien helfen.
- Quantitative Methoden verbessern die Genauigkeit von Abbaustudien.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Überwachung des Proteinabbaus in lebenden Zellen.
- Möglichmachung eines Hochdurchsatz-Screenings von abbauenden Verbindungen.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Modulation endogener Proteinmengen.
Verwendete Methoden
- Herstellung und Ausplattieren von Säugetierzellen in definierten Dichten.
- Serielle Verdünnung von PROTAC-Verbindungen zur Untersuchung.
- Verwendung lumineszenzbasierter Nachweisreagenzien zur Messung des Abbaus.
- Berechnung von Abbauparametern aus Lumineszenzdaten.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Überwachung der Proteinabbaukinetik in lebenden Zellen.
- Identifizierung signifikanter Unterschiede in den Abbaureaktionen zwischen Verbindungen.
- Quantitative Bewertung der Abbauraten und maximaler Abbaustufen.
- Kein Verlust der Zellviabilität während der Experimente beobachtet.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll erleichtert die Untersuchung der Dynamik des Proteinabbaus.
- Es kann angewendet werden, um die Auswirkungen des Proteinverlusts auf zelluläre Funktionen zu bewerten.
- HiBiT-markierte Zelllinien sind nützlich für die Untersuchung von Proteinwechselwirkungen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht eine quantitative, hochdurchsatzfähige Bewertung gezielter Proteinabbauvorgänge in physiologisch relevanten zellulären Kontexten und unterstützt die frühe Vorauswahl von abbauenden Verbindungen. Durch die Beibehaltung der endogenen Expression und Regulation der Zielproteine liefert es eine vorhersagbare Sicherheit bei der Optimierung von Leitstrukturen und verringert mechanistische Unklarheiten in Entdeckungsprozessen. Der Ansatz liefert direkte Entscheidungsgrundlagen für Go/No-Go-Entscheidungen, indem er den durch die Verbindung induzierten Zielproteinabbau mit messbaren phänotypischen Ergebnissen verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch direkte Messung des Targetproteinsverlusts in nativen zellulären Umgebungen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Targetvalidierung, indem er Abbaukinetik und Wirksamkeit unter physiologischer Regulation quantifiziert.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Selektion von Wirkstoffkandidaten durch Generierung von Parametern wie Abbaugeschwindigkeit, Dmax und DC50 zur Priorisierung von Leitverbindungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: CRISPR-optimierte HiBiT-Zelllinien bieten standardisierte, reproduzierbare Systeme für die lumineszenzbasierte Detektion des Target-Abbaus.
- Multiplexfähigkeit: Kompatibel mit Zellviabilitätsassays, um spezifische Target-Effekte von Zytotoxizität während des Screenings zu unterscheiden.
- Skalierbarkeit: Die Detektion des lumineszenten Signals in 96- oder 384-Well-Formaten ermöglicht ein Hochdurchsatz-Profilings von Degrader-Substanzbibliotheken.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erhält die endogene Proteinausprägung und -regulation und verbessert dadurch die Relevanz für in-vivo-Krankheitsmodelle.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Ermöglicht die Korrelation des Target-Abbaus mit funktionellen zellulären Phänotypen und unterstützt so entscheidungsrelevante Fortschritte, die auf Biomarkern basieren.
- Vorhersagegenauigkeit: Durch quantitative Profilierung des Abbaus wird das Risiko von Fehlschlägen in späteren Stadien verringert, da die Targetbindung in relevanten zellulären Hintergründen bestätigt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows nach der Zielidentifizierung und vor der Lead-Optimierung und stellt zelluläre Systeme bereit, die für den Nachweis der Abbaufähigkeit von Verbindungen geeignet sind.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie die Echtzeit- oder Endpunkt-Messung des Abbaus von Zielproteinen in lebenden Zellen ermöglicht.
- Screening: Liefert assaysfertige, quantitative Ergebnisse (Rate, Dmax, DC50) zur hochdurchsatzfähigen Bewertung von Degrader-Substanzbibliotheken.
- Analytik: Erzeugt normalisierte Abbaumetriken, die einen vergleichenden Auswertungs- und Rangvergleich zwischen Verbindungen basierend auf der Zielinteraktion ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verknüpft den Zielproteinabbau mit funktionellen Ergebnissen durch multiplexe Vitalitätsassays und unterstützt so die risikoadjustierte Weiterentwicklung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: HiBiT-markierte Zelllinien dienen als wiederverwendbare Ressourcen in mehreren Projekten, die unterschiedliche Proteine oder Degradationsmechanismen anvisieren.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet vorhersagbare Sicherheit hinsichtlich der Zielmodulation, verringert mechanistische Unschärfen und ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Stellt die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Assays über verschiedene Screening-Kampagnen hinweg sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen, steigert die Kapitalnutzungseffizienz und reduziert biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Degrader-Leitstrukturen basierend auf quantitativen Degradationsprofilen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der CRISPR/Cas9-Genomeditierung und der Entwicklung klonaler Zelllinien.
- Benötigt lumineszenzbasierte Plattenlesegeräte, die Detektionen im 96- oder 384-Loch-Format ermöglichen.
- Erfordert die Standardisierung der Zellaussaatdichte und der Reagenzherstellung über alle Vertiefungen hinweg.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind unterschiedliche endogene Expressionsniveaus und die subzelluläre Lokalisation der Zielproteine.
- Praktische Einschränkungen ergeben sich aus begrenztem dynamischem Bereich des Signals bei stark exprimierten oder schnell abgebauten Zielproteinen.
