Name: Direkter Bioprinting von 3D Multizellulären Brustsphäroiden auf Endotheliale Netzwerke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Erfahren Sie das Bioprinting von Brustepithelsphäroiden auf vaskuläre Netzwerke für 3D-Gewebe-Modelle. Diese Methode ermöglicht schnelle Arzneimitteltests und personalisierte Medizin in vitro.

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Diese Forschung wurde von NIH 1R01HL140239-01 an AMC finanziert. Wir bedanken uns beim Cell Imaging Center der Drexel University.

1. Brustepithelzellwachstum und Assay-Medien
<ol><li>MCF10A Brustepithelzellen HINWEIS: Die nicht-tumorigenic verewigte Brustepithelzelllinie wird von einem Patienten mit fibrozystischer Erkrankungabgeleitet 43. Zellen drücken keinen Östrogenrezeptor aus.<ol>
<li>Um den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) von 20 g/ml vorzubereiten, lösen Sie 100 g lyophilisierten EGF in 500 l sterilen dH2O auf, um 200 g/ml EGF zu bilden. Fügen Sie 500 l von 200 g/ml EGF in 4,5 ml sterile 0,1% BSA in dH2O hinzu, um eine EGF-Lagerlösung mit 20 sg/ml herzustellen. Vorbereitete 20 g/ml EGF-Aliquots bei -20 °C für bis zu 12 Monate lagern.</li>
		<li>Zur Zubereitung von 500 g/ml Hydrocortison 1 mg Hydrocortison in 1 ml absolutem Ethanol (200 Nachweis) verdünnen. Fügen Sie 1 ml steriles DMEM F:12 zu dieser Mischung hinzu, um eine 500 g/ml Hydrocortison-Stammlösung herzustellen. Hydrocortison-Lager-Aliquots bei -80 °C für bis zu 12 Monate lagern.</li>
		<li>Um 10 g/ml Choleratoxin vorzubereiten, lösen Sie 1 mg Choleratoxin lyophilisiertes Pulver in 1 ml sterilem dH2O auf, um eine 1 mg/ml Choleratoxin-Stammlösung herzustellen. Speichern Sie Cholera-Toxin-Lager Aliquots bei -80 °C für bis zu 12 Monate.</li>
		<li>Zur Vorbereitung des Wachstumsmediums werden 500 l EGF (20 g/ml), 500 l Hydrocortison (500 g/ml), 5 l Choleratoxin (1 mg/ml), 500 l Rinderinsulin (10 mg/ml), 10 ml Penicillin und Streptomycin, und 25 ml Pferdeserum bis 500 ml DMEM F:12 für eine Endkonzentration von 20 ng/ml EGF, 500 ng/ml Hydrocortison, 10 ng/ml Choleratoxin, 10 ng/ml Rinderinsulin, 2% v/v Penicillin und Streptomycin und 5% v/v Pferdeserum. Die Antibiotikakonzentration wurde auf 2 % erhöht, um die verminderte Sterilität im Bioprinting-Prozess zu berücksichtigen; die Antibiotikakonzentration kann jedoch auf 1% gesenkt werden.</li>
		<li>Zur Vorbereitung von Assay Medium 500 l Hydrocortison (500 g/ml), 5 l Choleratoxin (1 mg/ml), 500 l Rinderinsulin (10 mg/ml), 10 ml Penicillin und Streptomycin, und 25 ml Pferdeserum bis 500 ml DMEM F:12 für eine Endkonzentration von 500 ng/ml Hydrocortison, 10 ng/ml Choleratoxin, 10 ng/ml Rinderinsulin, 2% v/v Penicillin und Streptomycin und 5% v/v Pferdeserum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDA-MB-231 HINWEIS: Die dreifach-negative (fehlende Östrogen-Rezeptor, Progesteron-Rezeptor, und epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2) Brustkrebs-Epithel-Zelllinie wird aus Pleuraerguss einer weiblichen Patientin mit metastasierendem Mamma-Adenokarzinom44erstellt. Zellen stellen einen aggressiven, invasiven und schlecht differenzierten Brustkrebs dar.<ol>
<li>Zur Vorbereitung von Growth and Assay Medium 50 ml fetales Rinderserum, 10 ml Penicillin und Streptomycin und 25 ml Pferdeserum zu 500 ml DMEM für eine Endkonzentration 10% v/v fetales Rinderserum, 2% v/v Penicillin und Streptomycin und 5% v/v Pferdeserum.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Brustepithelzellkultur
<ol><li>Samen 500.000 MCF10A oder MDA-MB-231 Zellen in einer 10 cm (P100) Gewebekulturschale mit 10 ml MCF10A oder MDA-MB-231 Wachstumsmedien. MCF10A- und MDA-MB-231-Zellen erreichen >90% Zusammenfluss in 48 Stunden.</li>
	<li>Um Brustepithelzellen zu durchziehen, waschen Sie zuerst Zellen mit 10 ml warmem PBS.</li>
	<li>Lösen Sie Brustepithelzellen, indem Sie 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA in die Schale geben. Legen Sie das Gericht in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 20-25 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie den Trypsinisierten Zellen 5 ml MCF10A oder MDA-MB-231 Growth Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipette die Zell-Medien-Mischung nach oben und unten, um Zellen wieder zu suspendieren und Zellcluster aufzubrechen.</li>
	<li>Fügen Sie die Zellsuspension 3 Minuten lang einem 15 ml konischen Rohr und einer Zentrifuge bei 1.200 x g hinzu. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet in 5 ml MCF10A oder MDA-MB-231 Growth Medium wieder aufsetzen.</li>
	<li>Platte 1 ml Zellsuspension in 5 neuen 10 cm Gewebekulturschalen zusammen mit MCF10A oder MDA-MB-231 Growth Medium. Legen Sie das Geschirr in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator. Die Zellen können in 2-3 Tagen wieder durchgesieben werden. MCF10A-Zellen können bis zu Durchgang s 35 beibehalten werden, danach zeigen sie morphologische Veränderungen. MDA-MB-231-Zellen können bis Durchgang S24 beibehalten werden, danach zeigen sie morphologische Veränderungen.</li>
</ol>3. Brust epitheliale Sphäroid-Formation
<ol><li>Einfrieren Sie die 200 L Pipettenspitzen 30 Minuten vor Beginn des Testes. Halten Sie die wachstumsfaktorreduzierte Matrixlösung (z. B. Matrigel) (10 mg/ml) während des gesamten Prozesses auf Eis.</li>
	<li>Langsam Pipette 30 l eiskalte Matrixlösung mit eiskalten 200 l Pipettenspitzen in jeden Brunnen eines 8-Well-Kammerschlittens. Beginnen Sie von den Seiten und ziehen Sie die Pipettenspitze entlang der Ecken, hinzufügen einen letzten Tropfen in der Mitte des Brunnens, um eine gleichmäßige Beschichtung jedes Brunnens zu gewährleisten. Vermeiden Sie Luftblasen während dieses Schritts, um eine gleichmäßige Matrixlösungsschicht zu gewährleisten. Verwenden Sie neue Pipettenspitzen für jeden Brunnen.</li>
	<li>Inkubationskammergleitet in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 15-20 Minuten, um die Matrixlösung zu polymerisieren.</li>
	<li>Setzen Sie trypsinisierte MCF10A-Zellen in MCF10A Assay Medium bei 200.000 Zellen/ml aus oder setzen Sie trypsinisierte MDA-MB-231-Zellen in MDA-MB-231 Growth Medium bei 200.000 Zellen/ml wieder aus.</li>
	<li>Bei Verwendung von MCF10A-Zellen bereiten Sie frisches MCF10A Spheroid Growth Medium vor, indem Sie 5 l EGF (20 g/ml) und 100 l Matrixlösung zu 5 ml Assay Medium für eine Endkonzentration von 2% Matrixlösung hinzufügen.</li>
	<li>Entfernen Sie den mit Matrixlösung vorbeschichteten Kammerschlitten aus dem Inkubator. Fügen Sie jedem Brunnen 50 L MCF10A oder MDA-MB-231 Zellsuspension (10.000 Zellen) hinzu. Wenn Sie MCF10A-Zellen verwenden, fügen Sie 450 L MCF10A Spheroid Growth Medium hinzu. Wenn Sie MDA-MB-231-Zellen verwenden, fügen Sie 450 L MDA-MB-231 Growth Medium vorgemischt mit 2% Matrixlösung (9 l) hinzu. Stellen Sie die Kammerrutsche sofort in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium alle 4 vier Tage. Mit einer 200-L-Pipettenspitze aus einer Ecke jedes Brunnens heraus pipette 200 l alte Medien. Kippen Sie dabei den Kammerschlitten um 45°, um sicherzustellen, dass die Sphäroide nicht gestört werden. Fügen Sie 200 L frisch zubereitetes MCF10A Spheroid Growth Medium oder MDA-MB-231 Growth Medium, das zuvor mit 2% Matrixlösung gemischt wurde, zu jedem Brunnen an der Ecke in Tropfen hinzu, um sicherzustellen, dass Sphäroide an der Matrixschicht befestigt bleiben. Nur 50 % der Medien werden ersetzt, so dass alle zytokinen, die von den Sphäroiden produziert werden, nicht vollständig erschöpft sind. HINWEIS: MCF10A Brustepithelialsphäride brauchen bis zu 8 Tage, um zu polarisieren und Hohlzentren zu bilden. MDA-MB-231 Brustepithelialsphäride brauchen bis zu 5 Tage, um sich zu bilden und haben keine Hohlzentren.</li>
</ol>4. Endotheliale Zellnetzbildung
<ol><li>Human Umbilical Venin Endothelzelle (HUVEC) Kultur<ol>
<li>Fügen Sie den Inhalt eines einzigen Endotheliale Wachstums Medium-2-Kits hinzu, das Insulinwachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor, vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor enthält, Ascorbinsäure, epidermaler Wachstumsfaktor, Heparin und Gentamicin-Amphotericin B, zusammen mit 50 ml fetalem Rinderserum, 5 ml Penicillin-Streptomycin und 5 ml 200 mM Glutamin bis 500 ml Endothelialebasal Medium-2 (EBM-2) zu einem vollständigen Endothel-Wachstumsmedium (EGM-2).</li>
		<li>Samen 500.000 Endothelzellen in einer 10 cm Gewebekulturschale in 10 ml EGM-2. Legen Sie Zellen in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator, bis sie >80% Konfluenz erreichen (ca. 48 Stunden).</li>
		<li>Um Zellen zu durchziehen, waschen Sie Endothelzellen mit 10 ml warmem PBS. Lösen Sie HUVEC, indem Sie der 10 cm Gewebekulturschale 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzufügen. Überwachen Sie die Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie. Die Zellen sind bereit, wenn sie aufgeballt werden, bleiben aber an der Schale befestigt.</li>
		<li>Das Trypsin vorsichtig aus der Schale saugen. Fügen Sie 8 ml EGM-2 in das Gericht. Waschen Sie zellenvon der Schale, indem Sie den EGM-2 über die gesamte Telleroberfläche nach oben und unten pfeifen.</li>
		<li>Alternativ können Sie den Trypsin-Zellen 5 ml EGM-2 hinzufügen, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipette die Zell-Medien-Mischung nach oben und unten, um Zellen wieder zu suspendieren und Zellcluster aufzubrechen. Fügen Sie die Zellsuspension 3 Minuten lang einem 15 ml konischen Rohr und einer Zentrifuge bei 1.200 x g hinzu. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet in 10 ml EGM-2 wieder aufhängen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml Zellsuspension zu 9 ml EGM-2 in einer 10 cm Gewebekulturschale hinzu. Legen Sie das Geschirr in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator. Tauschen Sie 2/3 des Mediums alle 2 Tage mit frischem EGM-2 um. Die Zellen können in 3-5 Tagen durchforsst werden. HUVEC kann bis Zugänge 8 aufrechterhalten werden, nach denen sie keine Netzwerke bilden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Endothelzelle (HUVEC) Netzwerkbildung</li>
	<li>Einfrieren Sie die 200 L Pipettenspitzen 30 Minuten vor Beginn des Testes. Halten Sie die wachstumsfaktorreduzierte Matrixlösung (10 mg/ml) während des gesamten Prozesses auf Eis.</li>
	<li>Langsam Pipette 30 l eiskalte Matrixlösung mit eiskalten 200 l Pipettenspitzen in jeden Brunnen eines 8-Well-Kammerschlittens. Beginnen Sie von den Seiten und ziehen Sie die Pipettenspitze entlang der Ecken, hinzufügen einen letzten Tropfen in der Mitte des Brunnens, um eine gleichmäßige Beschichtung jedes Brunnens zu gewährleisten. Vermeiden Sie Luftblasen während dieses Schritts, um eine gleichmäßige Matrixlösungsschicht zu gewährleisten. Verwenden Sie neue Pipettenspitzen für jeden Brunnen.</li>
	<li>Inkubationskammer gleitet in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 15-20 Minuten, um Matrigel zu polymerisieren.<ol>
<li>Eine 10 cm große Schale HUVEC mit 10 l Rote-Zell-Tracker (1:1000) 30 Minuten in 37 °C, 5% CO2-Inkubator vorfärben.</li>
		<li>Endothelzellen mit 10 ml warmem PBS waschen. Lösen Sie HUVEC, indem Sie der 10 cm Gewebekulturschale 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzufügen. Legen Sie die Schale in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 5 Minuten, um die Zellen vollständig zu lösen.</li>
		<li>Fügen Sie 5 ml EGM-2 in die Schale, um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 25 ml konisches Rohr. Zentrifuge HUVEC bei 1.200 x g für 5 Minuten. Den Überstand ansaugen und das Zellpellet in 5 ml serumfreiem EBM-2 wieder aufhängen.</li>
		<li>Zählen Sie Zellen mit Trypan blue, um lebensfähige Zellen zu bestimmen. Erstellen Sie eine 1 x 10 6-Zellen/ml-Lösung.</li>
		<li>Fügen Sie 100.000 HUVEC zu jedem Brunnen mit 200 L serumfreien EBM-2 hinzu. Wenn mehr Zellen hinzugefügt werden, erstellen sie eine Oberflächenmonolayer anstelle eines Rohrnetzwerks.</li>
		<li>HUVEC in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator inkubieren. Nach 6 Stunden, Bild HUVEC Netzwerke durch Phasenkontrastmikroskopie. Netzwerke sind jetzt bereit für die Kokultur mit Brustsphäroiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Bioprinting Brustepithelial sphäroide auf vorgeformten HUVEC-Netzwerken
HINWEIS: Für den Bioherstellungsprozess sollte ein Bio-Abscheidungssystem mit zwei Düsen verwendet werden. In diesem Fall verfügte das System über drei Bewegungsarme, um eine räumliche Kontrolle der Materialabscheidung im Mikronmaßstab zu ermöglichen, sowie über zwei schraubengetriebene Motoren, um Bioink aus 10 ml Spritzen abzulagern. Das System sollte mit einem hocheffizienten Partikelluftfiltrationssystem sowie UV-Sterilisationsfunktionen funktionalisiert werden, um eine sterile Umgebung während des Bioprintings zu erhalten. Der Bioprinter wird vor dem Druckvorgang eine Stunde lang UV-sterilisiert.
<ol><li>Erstellen Sie Brustepithelisaleroiide und HUVEC-Netzwerke, wie zuvor beschrieben. Schätzen Sie die Anzahl der Brustepithelialsphäroide in jedem Brunnen, indem Sie Sphäroide in repräsentativen Phasenkontrastmikroskopiebildern zählen.</li>
	<li>0,5 cm vom Ende einer 1000 L Pipettespitze abschneiden. Verwenden Sie die geschnittene Pipettenspitze, um alle Sphäroide aus dem 8-Well-Kammerschlitten und in ein 50 ml-Rohr sorgfältig zu pipette. Resuspend Sphäroide in der ausgewählten Bioink bei 100 Sphäroide/100 l. HINWEIS: Höhere Sphäroidkonzentrationen können zu Sphäroidclustering führen und die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen den Sphäroiden und den Endothelnetzwerken verhindern.</li>
	<li>Übergeben Sie die Sphäroidmischung durch ein 70-m-Zellsieb, um große oder gruppierte Sphäroide zu entfernen.</li>
	<li>Die gepoolten Sphäroide in eine 10 ml sterile Spritze geben und mit einer 25-Spur-Sterilnadel verschließen. Befestigen Sie die Spritze am Bio-Abscheidungssystem.</li>
	<li>Saugen Sie das Medium aus den HUVEC-Netzwerken in der 8-Well-Kammerrutsche.</li>
	<li>Extrudieren Sie 100 l Brustepithelialsphäride auf 6 Brunnen von HUVEC-Netzwerken mit einer Durchflussrate von 1 ml/min. Verwalten Sie 2 Brunnen von HUVEC-Netzwerken als Steuerungen.</li>
	<li>Fügen Sie 400 L MCF10A Spheroid Growth Medium hinzu, wenn Sie MCF10A Sphäroide verwenden, die auf HUVEC-Netzwerken gedruckt werden, oder 400 L MDA-MB-231 Growth Medium hinzufügen, das zuvor mit einer Matrixlösung von 2% gemischt wurde, wenn MDA-MB-231 Sphäroide verwendet werden, die auf HUVEC-Netzwerken gedruckt wurden. Das jeweilige Sphäroid-Wachstumsmedium sollte in HUVEC-Kontrollbrunnen eingesetzt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie Kokulturen in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 24 – 96 Stunden ohne Medienwechsel. Die Kokulturen werden im ursprünglichen Medium bis zu vier Tage lebensfähig bleiben.</li>
</ol>6. Konfokale Mikroskopie
<ol><li>Immunfluoreszenz und PBS-Glycin-Waschpuffer-Vorbereitung<ol>
<li>Vorbereiten Sie Immunofluoreszenz (IF) Puffer 10x Stammlösung durch Zugabe von 2,5 g Natriumazid, 5 g Rinderserumalbumin, 10 ml Triton X-100 und 2,05 ml Tween-20 in 500 ml 10x PBS. PH auf 7,4 einstellen. Lagern Sie die Lagerlösung bis zu einem Jahr bei 4 °C, um Sedimentation zu vermeiden.</li>
		<li>Erstellen Sie einen funktionierenden IF-Puffer, indem Sie 50 ml 10x IF-Puffer in 450 ml sterilen entionisiertem Wasser verdünnen. Bewahren Sie die Arbeitslösung bis zu einer Woche bei Raumtemperatur auf.</li>
		<li>Bereiten Sie 10x PBS-Glycin-Puffer-Lagerlösung vor, indem Sie 37,5 g Glycin zu 500 ml 10x PBS hinzufügen. PH auf 7,4 einstellen. Lagern Sie die Lagerlösung bis zu 6 Monate bei 4 °C, um Sedimentation zu vermeiden.</li>
		<li>Erstellen Sie eine funktionierende PBS-Glycin-Lösung, indem Sie 50 ml 10x PBS-Glycin-Puffer in 450 ml sterilen entionisierten Wassers verdünnen. Bewahren Sie die Arbeitslösung bis zu einer Woche bei 4 °C auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Label Bioprinted Samples and Image by Confocal Microscopy<ol>
<li>Aspirieren Sie Medium aus bioprinted 3D-Kokulturen und spülen Sie 3 mal mit warmen PBS. Fix bioprinted 3D Kokulturen mit 4% Paraformaldehyd für 1 h bei Raumtemperatur. Proben 3 mal für 20 Minuten mit 1x PBS-Glycin emiten.</li>
		<li>Blockproben mit IF-Puffer gemischt mit 10% Ziegenserum für 90 Minuten (Primärblock), gefolgt von 40 Minuten mit IF-Puffer plus 10% Ziegenserum und Affinipure Fab Fragment (1:100, Sekundärblock).</li>
		<li>Bei Verwendung von MCF10A-Sphäroiden proben mit einem Primärantikörper für Integrin 6 (1:100) im sekundären Sperrpuffer über Nacht bei 4 °C, gefolgt von einem Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper (1:200) und Hoescht 33342 (1:1000) für 1 h bei lichtgeschützter Raumtemperatur. MCF10A-Zelllinien drücken hohe Integrin-Konzentrationen aus 6, die für die Darstellung der Sphäroidpolarisation und Morphologie unerlässlich sind.</li>
		<li>Bei Verwendung von MDA-MB-231 Sphäroiden, die niedrige Integrin-Konzentrationen ausdrücken, beschriften Sie Proben mit Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) und Hoescht 33342 (1:1000) im sekundären Sperrpuffer für 4 Stunden bei Lichtschutz. Phalloidin ermöglicht die Visualisierung von Actin-Filamenten, so dass die amorphe und invasive Morphologie des Sphäroids beurteilt werden kann.</li>
		<li>Proben mit 1X PBS-Glycin 3 mal für 20 Minuten waschen.</li>
		<li>Bereiten Sie Proben für die Montage vor, indem Sie den Kammerschlitten mit dem Werkzeug des Herstellers entfernen. Fügen Sie jedem Brunnen einen kleinen Tropfen Antifade-Lösung hinzu. Legen Sie einen 22 mm x 60 mm Abdeckzettel auf jeden Kammerschlitten und versiegeln Sie die Kanten sorgfältig mit klarem Nagellack.</li>
		<li>Bildproben mit einem konfokalen Mikroskop als Z-Stacks von 10 Scheiben in 5'm Schritten. Komprimieren Sie zkomprimiert z.B. mit dem Befehl Extended Focus in der Zellbildsoftware in eine einzelne Ebene.</li>
		<li>Quantify spheroid adheoid ad image J. Die Anzahl der haftenden Sphäroide kann mit dem Analyse-Plugin mit der entsprechenden Partikelgröße und Zirkularität quantifiziert werden. Normalisieren Sie die Anzahl der angefügten Sphäroide im Bildbereich.</li>
		<li>Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, quantifizieren Sie die Anzahl der haftenden Sphäroide in 4 x 4 gefliesten Bildern von Kokulturen. Wenn die Sphäroidzahl statistisch signifikant niedriger ist als bei anderen Experimenten, sollte das Experiment wiederholt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll ist das erste seiner Art, das Sphäroide in ihrer 3D-Architektur für die Co-Kultur mit Endothelzellen auch in ihrer 3D-Architektur bioprintiert. Kritische Protokollschritte umfassen die Erstbildung von Brustepithelialsphäroiden und HUVEC-Netzwerken. Bei der Fütterung von Epithelsphäroiden ist äußerste Vorsicht geboten, da sie leicht von der Matrixlösung gestört werden können. Ebenso müssen Brustepithelilesphäroide mit Vorsicht behandelt werden, wenn sie von der Matrixlösung abgeführt und in die Netzwerke ...

3D-in-vitro-vaskularisierte Tumormodelle sind wesentliche Werkzeuge für die mechanistische Untersuchung von Krebswachstum und Metastasen. Insbesondere bei Brustkrebs organisieren sich in Matrigel kultivierte Brustepithelzellen zu polarisierten Sphäroiden, die eher der in vivo-Mamma-Akuinusarchitektur1,2,3,4,5,6,7,8ähneln. 3D-Brustepithelzellkultur wirkt sich auch auf die Zellfunktion aus, wobei 3D-KulturenUnterschiede in der epidermalen Wachstumsfaktor-Modulation (EGF) zeigen 8,9; Onkogenfunktion, einschließlich ErbB210; Wachstum und Apoptose-Signalisierung11,12; und Chemotherapie-Resistenz13,14. Vaskuläre Endothelzellen reagieren ähnlich unterschiedlich auf Umweltreize in 3D im Vergleich zu traditioneller 2D-Kultur15,16,17,18. Ein Großteil des Verständnisses von vaskulären endotheliale und Brustepithel-Wechselwirkungen stammt jedoch aus der 2D-Kultur mit konditionierten Medium- oder Transwell-Einsätzen oder 3D-Modellen, bei denen die beiden Zelltypen physisch getrennt sind19,20,21,22,23. Diese Co-Kultur-Modelle bieten begrenzte physiologische Erkenntnisse, da sowohl 3D-Kultur als auch Zellzellkontakt entscheidend für vaskuläre endotheliale – Brustepithelzellinteraktionen24,25,26sind.
3D-Krebsmodelle wurden mit einer Vielzahl von Techniken hergestellt, einschließlich hängender Tropfensphäroidbildung, Bioprinting, magnetische Montage und Kultur in Hydrogelen oder auf technischen Gerüsten5,27,28,29. In jüngerer Zeit wurden 3D-Tumormodelle mit mehreren Zelltypen erstellt, die in ihren jeweiligen 3D-Strukturen angeordnet sind. In einem Beispiel einer Tumor-on-a-Chip-Plattform wurden Krebs-, Endothel- und Stromalzellen in eine Matrix gemischt und dann in die drei zentralen Gewebekammern in einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Gerät injiziert. Die Gewebekammern wurden von zwei äußeren Kanälen umrandet, die eine Arterie und Venule darstellten. Nach 5-7 Tagen Kultur bildeten Endothelzellen ein mikrovaskuläres Netzwerk und Krebszellen vermehrten sich zu kleinen Tumoren in der Nähe der Vaskulatur. Diese Plattform wurde dann verwendet, um Drogen und Drogenkombinationen zu überprüfen30. Zusätzliche Tumor-on-a-Chip-Plattformen wurden geschaffen, um Metastasen und Krebsarten mit spezifischen mechanischen Reizen (z.B. mechanische Dehnung in der Lunge) zu untersuchen31,32. Diese Plattformen enthalten jedoch in der Regel nicht sowohl Vaskulatur als auch Krebs in ihren jeweiligen 3D-Strukturen.
Die Biofertigung ist vielversprechend bei der Weiterentwicklung von 3D-in-vitro-vaskularisierten Tumormodellen, da sie eine enge räumliche Kontrolle über die Zelllage ermöglicht. Trotz des Wachstums des Bioprinting in den letzten zehn Jahren konzentrieren sich nur wenige Studien speziell auf Tumore33,34. In einem Beispiel wurde der 3D-Druck von HeLa-Zellen in einem Gelatine-/Alginat-/Fibrinogen-Hydrogel verwendet, um ein in vitro Gebärmutterhalskrebsmodell zu erstellen. Tumorzellen wurden als einzelne Zellen biogedruckt und dann erlaubt, Sphäroide zu bilden, die eine höhere Proliferationsrate, erhöhte Matrix-Metalloproteinase-Expression und eine höhere Chemoresistenz als Zellen in 2D-Kultur35zeigten. In diesen Studien wurden, wie in vielen anderen36,37, dissoziierte Zellsuspensionen biogedruckt, und dann wurden die Zellkulturen mit den erforderlichen mechanischen und biochemischen Hinweisen versehen, um den Zellen eine 3D-Struktur zu ermöglichen. Die zelluläre Selbstmontage kann jedoch Tage oder Wochen dauern, komplexe räumliche und zeitliche Umwelthinweise erfordern oder nicht auftreten, wenn zwei Zelltypen mitkultiviert werden. Zum Beispiel induzierten Brustepithelzellen den Zelltod in Endothelzellen in 2D-Kokultur, und dissoziierte Brustepithelzellen bildeten keine 3D-Spheroide, wenn sie in Alginat/Gelatine-Hydrogelen38bioprinted wurden. Dissoziierte Brustepithel- oder Krebszellen bildeten Sphäroide in Alginat-basierten Bioinks nur, wenn sie in kreisförmigen PDMS-Formen eingeschlossen waren. In anderen Fällen wurden Sphäroide mit hängenden Tröpfchen in ultraniedrigen Befestigungskreisplatten gebildet und dann in Alginat-basierte Bioinks39,40gemischt.
Wir beschreiben nun eine alternative 3D-Gewebebiomanufacturing-Methode in diesem Protokoll. Anstatt entfernt von Samen dissoziierte Zellen und warten, bis diese Zellen die 3D-Strukturen bilden, beschreiben wir, wie man 3D-Tumorsphäride in einem Gefäßröhrennetzwerk erstellt und bioprintt, um ein Tumor-Kokulturmodell zu erstellen, das fast sofort verwendet werden kann. Tumorsphäride können in vitro angebaut oder aus menschlichen Geweben (Organoiden) gewonnen werden. Ebenso können Gefäßröhren angebaut oder aus mikrovaskulären Fragmenten des Fettgewebes abgeleitet werden. Bioinks können von biologisch inaktivem Alginat bis zum hochbiologisch aktiven Matrigel41reichen. Da dieses 3D-Tumor-Cokulturmodell mit einer Vielzahl von Zellstrukturen und Bioinks erstellt werden kann, kann es mehrere Zelltypen, extrazelluläre Matrizen und Chemokin-Gradienten15,42integrieren. Während in ihrer aktuellen Formulierung die Endothelnetzwerke nicht durchdrungen werden können, könnten zukünftige Iterationen diese Methode mit Mikrofluiden oder -on-Chip-Systemen integrieren. Bioprinting 3D Brust epitheliale Sphäroide auf endotheliale Netzwerke ermöglicht eine schnelle Biofertigung von menschlichen Brustmodellen für Arzneimitteltests und personalisierte Präzisionsmedizin27.

<table><tbody><tr><td>37°; C-Inkubator, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit</td><td>Sanyo</td><td>MCO-20AIC</td><td>Zellinkubation</td></tr><tr><td>3D-Biodrucker</td><td>nach Maß</td><td>Keine</td><td>Wird für das Bioprinting</td></tr><tr><td>verwendet 8-Well-Kammerobjektträger</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>53106-306</td><td>für die Aussaat von Sphäroiden</td></tr><tr><td>25-Gauge-Nadel</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>Z192406-100EA</td><td>Bioprinting-Spritzennadel</td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol (200 proof)</td> <td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>E7023-500ML</td><td>Rekonstitution von Medienkomponenten</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab&prime;)2-Fragment-Anti-Maus-IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115006020</td><td>Sekundärblock - Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>A-11006</td><td>Seconday-Antikörper-Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Rinderinsulin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>I-035-0,5ML</td><td>MCF10A Medienzusatz</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>A2153-500G</td><td>Blockierungsmittel -Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Falcon 70 & micro; m Cell Strainer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>352350</td><td>Entfernen Sie große oder gehäufte Sphäroide</td></tr><tr><td>CellTracker&trade; Roter CMTPX Farbstoff</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>C34552</td><td>Vorfärbung für HUVEC-Röhrchen</td></tr><tr><td>Kompakte Zentrifuge</td><td>Hermle-Labnet, Edison ,NJ</td><td>Z206A</td><td>Für Zellzentrifugationen</td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>C8052-.5MG</td><td>MCF10A Medienadditiv</td></tr><tr><td>Konische Röhrchen 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>62406-200</td><td>Sammeln und Resuspendieren von Zellen</td></tr><tr><td>Countess II-FL Zellzähler</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AMQAF1000</td><td>Zählzellen</td></tr><tr><td>Glaspipetten (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>76184-746</td><td>Zellresuspension</td></tr><tr><td>DMEM F:12</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>11320033</td><td>MCF10A Basalmedium</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>10-014-CV</td><td>MDA-MB-231 Basalmedium</td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC Basalmedium</td></tr><tr><td>Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3162</td><td>Begleitet von einem Bulletkit (mit Wachstumsfaktoren)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&trade; 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td></td><td>Markierung MDA-MB-231 Sphäroide</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Cytiva, Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>HUVEC/MDA-MB-231 Medienadditiv</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16210064</td><td>Immunfluoreszenzmarkierungskomponente</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>G8898-500G</td><td>Immunfluoreszenzpufferkomponente</td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>62249</td><td>Immunfluoreszenz-Pferdeserum</td></tr><tr>für<td>Kerne</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16050130</td><td>MCF10A Medienadditiv</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>H0888-5G</td><td>MCF10A Medienadditiv</td></tr><tr><td>Endothelzellen (HUVECs) Humane Umblische Venen-Endothelzellen (HUVECs)</td><td>Zellanwendungen, San Diego , CA</td><td>200-05f</td><td>Endothelzelllinien</td></tr><tr><td>Integrin & Alpha; 6</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>MAB1378</td><td>Immunfluoreszenz-Sphäroid-Markierungskomponente</td></tr><tr><td>Lebend-Assay</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>L3224</td><td>Lebend- und Totzell-Färbungsassay für die Zellviabilität</td></tr><tr><td>LSM 700 Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td>Wird zur Visualisierung von Zellen verwendet</td></tr><tr><td>Matrigel - Wachstumsfaktor reduziert 10 mg/ml</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>354230</td><td>Sphäroid Bildung</td></tr><tr><td>MCF10A-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317</td><td>Brustzelllinie</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Zellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Brustzelllinie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>158127-500G</td><td>Zellfixiermittel</td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15140122</td><td>MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Medienzusatz</td></tr><tr><td>Phosphat gepuffert Kochsalzlösung 1X (PBS)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>7001106</td><td>Waschpuffer für Zellen vor der Trypsinisierung</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung 10X</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AM9625</td><td>Immunfluoreszenzpufferkomponente</td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Antifade Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>P36934</td><td>Immunfluoreszenz-Eindeckmittel</td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor, EGF</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A/ Assay-Medienkomponente</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>S2002-25G</td><td>Immunfluoreszenzpufferkomponente</td></tr><tr><td>Sterile Spritze (10 mL)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>75846-757</td><td>Bioprinting-Verfahren</td></tr><tr><td>Gewebekulturschale (10cm)</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25382-166</td><td>Monolayer-Zellkultur</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St.Louis, MO</td><td>T8787-250ML</td><td>Immunfluoreszenzpufferkomponente</td></tr><tr><td>Trypanblau 0,4 %</td> <td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>Zellzähleradditiv</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05 %</td> <td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td>Zellablösung</td></tr><tr><td>Tween -20</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>85113</td><td>Immunfluoreszenzpufferkomponente</td></tr><tr><td>Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF165)</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>100-20</td><td>HUVEC-Röhrenadditiv</td></tr><tr><td>Volocity 6.3 Software für die Zellbildgebung</td><td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>Z-Stapelkomprimierer</td></tr></tbody></table>

direkter bioprinting von 3d multizellulären brustsphäroiden auf endotheliale netzwerke

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting entwickelt sich zu einem vielversprechenden Werkzeug, um 3D-Humankrebsmodelle herzustellen, die kritische Merkmale der In-vivo-Gewebearchitektur besser rekapitulieren. Beim aktuellen Schicht-für-Schicht-Extrusionsbioprinting werden einzelne Zellen in einem Bioink zusammen mit komplexen räumlichen und zeitlichen Hinweisen extrudiert, um die hierarchische Gewebeselbstmontage zu fördern. Diese Biofabrikationstechnik beruht jedoch auf komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen, Bioinken und biochemischen und biophysikalischen Hinweisen. Daher kann die Selbstmontage Tage oder sogar Wochen dauern, kann bestimmte Bioinks erfordern und kann nicht immer auftreten, wenn mehr als ein Zelltyp beteiligt ist. Deshalb haben wir eine Technik entwickelt, um vorgeformte 3D-Brustepithelialsphäride in einer Vielzahl von Bioinks direkt zu bioprinten. Biobedruckte vorgeformte 3D-Brustepithelialsphäride hielten ihre Lebensfähigkeit aufrecht und polarisierten die Architektur nach dem Druck. Zusätzlich haben wir die 3D-Sphäroide auf vaskuläre Endothelzellnetzwerke gedruckt, um ein Co-Kultur-Modell zu erstellen. So schafft die neuartige Bioprinting-Technik schnell ein physiologisch relevanteres 3D-Brustmodell zu geringeren Kosten und mit einer höheren Flexibilität als herkömmliche Bioprinting-Techniken. Diese vielseitige Bioprinting-Technik kann extrapoliert werden, um 3D-Modelle anderer Gewebe in zusätzlichen Bioinks zu erstellen.

Brustepithelzellen sollten sich nach 5-8 Tagen Kultur auf Matrixlösung und im Kulturmedium mit 2% Matrixlösung selbst in 3D-Sphäroide organisieren. Nicht-tumorigene MCF10A Brustepithelialsphäride sollten rund erscheinen und ein hohles Zentrum haben, mit Integrin 6 polarisiert bis zum äußeren Rand des Sphäroids(Abbildung 1, Einschub zeigt Hohlzentren). Hochinvasive MDA-MB-231 Brustkrebs-Epithelzellen bilden unregelmäßige Sphäroide. Sphäroide sollten verwendet werden, wenn sie einen Durchmesse...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Brustepithelzellen als multizelluläre Sphäroide direkt auf vorgeformte endotheliale Netzwerke zu bioprinten, um schnell 3D-Brust-Endothel-Kokulturmodelle zu erstellen, die für Arzneimittelscreening-Studien verwendet werden können.

Direkter Bioprinting von 3D Multizellulären Brustsphäroiden auf Endotheliale Netzwerke

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

Unser Protokoll erleichtert den Druck von vorgeformten 3D-Zellstrukturen wie Brustepithel-Sphäroiden und ermöglicht so die schnelle Bildung biologisch relevanter Modelle und einer Vielzahl von Biotinten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das Bioprinting von 3D-Tumorsphäroiden auf ein Gefäßnetzwerk erleichtert, das fast sofort für jede experimentelle Studie verwendet werden kann. Diese 3D-biogedruckten Gewebemodelle bieten eine schnelle In-vitro-Plattform, die für eine personalisierte Präzisionsmedizin erweitert werden kann.Dieses äußerst vielseitige 3D-Bioprinting-Verfahren kann auf andere physiologische Systeme angewendet werden, in denen 3D-Wechselwirkungen mit dem Gefäßsystem wichtig sind. Für die Bildung von epithelialen Sphäroiden der Brust frieren Sie zuerst 200 Mikroliter Pipettenspitzen für 30 Minuten ein und legen Sie die Wachstumsfaktor-reduzierte Matrixlösung auf Eis. Wenn die Spitzen eingefroren sind, geben Sie mit einer neuen eiskalten Pipettenspitze pro Vertiefung 30 Mikroliter der eiskalten Matrixlösung an die Seite und entlang der Ecken jeder Vertiefung eines Objektträgers mit acht Vertiefungen und fügen Sie einen letzten Tropfen in die Mitte hinzu, um eine gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten.Wenn alle Vertiefungen beschichtet sind, inkubieren Sie die Rutsche 15 bis 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Während die Matrix polymerisiert, resuspendieren Sie MCF 10A-Zellen in MCF 10A-Testmedium bei einer Konzentration von zweimal 10 auf fünf Zellen pro Milliliter. Am Ende der Inkubation geben Sie 50 Mikroliter Zellen und 450 Mikroliter MCF 10A Sphäroid-Wachstumsmedium in jede Vertiefung und geben Sie den Objektträger sofort wieder in den Inkubator zurück.Kippen Sie den Kammerschieber alle vier Tage in einen 45-Grad-Winkel, damit 200 Mikroliter Überstände durch frisches Sphäroid-Wachstumsmedium pro Vertiefung ersetzt werden können. Für die Bildung des HUVEC-Netzwerks bereiten Sie einen mit Matrixlösung beschichteten Acht-Well-Kammer-Objektträger vor, wie gezeigt, und färben Sie eine 10-Zentimeter-Schale mit HUVECs mit 10 Mikrolitern Erythrozyten-Tracker-Die 30 Minuten lang im Zellkultur-Inkubator vor. Waschen Sie die Endothelzellen am Ende der Inkubation mit 10 Millilitern warmem PBS, bevor Sie sie mit zwei Millilitern 0,05 % Trypsin-EDTA behandeln.Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid neutralisieren Sie das Trypsin mit fünf Millilitern endothelialem Wachstumsmedium zwei und überführen die Zellen zur Zentrifugation in ein konisches 25-Milliliter-Röhrchen. Resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern serumfreiem endothelialem Basalmedium, zwei zum Zählen und verdünnen Sie die Zellen auf eine eins mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter Konzentration. Geben Sie dann eins mal 10 zu den fünf HUVECs in jede Vertiefung und legen Sie die Platte für sechs Stunden in den Zellkultur-Inkubator.Zählen Sie nach fünf bis acht Tagen Kultur die Anzahl der Sphäroide in jeder Vertiefung in repräsentativen Phasenkontrastmikroskopiebildern und verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze, wobei die letzten 0,5 Zentimeter der Spitze entfernt werden, um alle Sphäroide aus jeder Vertiefung des Acht-Well-Kammer-Objektträgers vorsichtig in ein 50-Mikroliter-Röhrchen zu sammeln. Resuspendieren Sie die Sphäroide in einer geeigneten Biotinte mit einer Konzentration von 100 Sphäroiden pro 100 Mikroliter Tinte und laden Sie die gepoolten Sphäroide in eine sterile 10-Milliliter-Spritze. Rüsten Sie die Spritze mit einer sterilen 25-Gauge-Nadel aus und befestigen Sie die Spritze am Biodepositionssystem.Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung des HUVEC-Netzwerks und extrudieren Sie 100 Mikroliter Brustepithel-Sphäroide in jede der sechs Vertiefungen des HUVEC-Netzwerk-Kammerobjektträgers mit einer Flussrate von einem Milliliter Sphäroiden pro Minute. Geben Sie dann 400 Mikroliter MCF 10A Sphäroid-Wachstumsmedium in jede Vertiefung und stellen Sie die Co-Kulturen für 24 bis 96 Stunden in den Zellkultur-Inkubator. Nach fünf bis acht Tagen Kultur, wie gezeigt, sollten nicht-tumorigene MCF 10A-Brustepithel-Sphäroide rund mit einem hohlen Zentrum erscheinen, in dem Integrin alpha-6 zum äußeren Rand des Sphäroids polarisiert ist.Hochinvasive MDA-MB-231-Epithelzellen von Brustkrebs bilden unregelmäßige Sphäroide, die bei zu langer Verbleib in der Matrigel-Kultur Zellen zeigen können, die aus den Sphäroiden wandern. Nach sechs bis acht Stunden spärlicher serumfreier Kultur, wie gezeigt, können HUVEC-Netzwerke mittels Phasenkontrast- oder Konfokalmikroskopie abgebildet werden. Nach dem epithelialen Sphäroid-Bioprinting der Brust in die HUVEC-Netzwerke sollten sowohl die Sphäroide als auch die Netzwerke ihre ursprüngliche Morphologie für mindestens 24 Stunden beibehalten.Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Protokolls beachten sollten, ist, die Sphäroide vor dem Drucken sorgfältig zu behandeln, um Clustering zu vermeiden. Nach Bioprinting und Co-Kultur können die Lebensfähigkeit, Proliferation, Migration und andere biochemische Wechselwirkungen mit dem Endothelnetzwerk von Tumorzellen mit und ohne pharmakologische Behandlung gemessen werden. Wir haben gezeigt, dass Wirkstofftests bereits zwei Stunden nach dem Co-Kultur-Bioprinting begonnen werden können, und haben die Sphäroidaddition an Endothelnetzwerke mit dem Krebsmedikament Paclitaxel getestet.

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Forschung

JoVE Journal

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Dieses Video erklärt das 3D-magnetische Bioprinting von co-kultivierten Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und Fibroblasten. Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und aktivierte Pankreasfibroblastenzellen werden unter dem Einfluss magnetischer Kräfte co-kultiviert und mit einer biokompatiblen Nanopartikelanordnung magnetisiert, um Sphäroide zu erzeugen.

Magnetisch biogedruckte 3D-Sphäroid-Co-Kulturen: Eine Methode zur Co-Kultivierung von Krebszellen und Fibroblasten

Ein kartesischer Biodrucker wurde entworfen und hergestellt, um die Abscheidung mehrerer Materialien in präzisen, reproduzierbaren Geometrien zu ermöglichen und gleichzeitig die Kontrolle von Umweltfaktoren zu ermöglichen. Unter Verwendung des dreidimensionalen Biodruckers können komplexe und lebensfähige Konstrukte gedruckt und leicht reproduziert werden.

Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Dieses Protokoll beschreibt das 3D-Bioprinting von Herzgewebe ohne den Einsatz von Biomaterialien. 3D-Bioprints-Herz-Patches zeigen mechanische Integration von Komponenten-Sphäroiden und sind vielversprechend bei der Herz-Gewebe-Regeneration und als 3D-Modelle von Herzerkrankungen.

Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

Wir bieten ein generalisiertes Protokoll basiert auf einer mikrofluidische Bioprinting Strategie für engineering-ein Microfibrous Kreislauf Bett, wo eine sekundäre Zelle Art weiter in den interstitiellen Raum dieser Microfibrous Struktur, vaskularisierte Gewebe und Organellen zu generieren ausgesät werden konnte.

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Das Protokoll beschreibt, wie ein perfusable Kreislauf Netzwerk in ein Sphäroid zu konstruieren. Das Sphäroid umliegenden Mikroumgebung ist entworfen, um induzieren Angiogenese und der Sphäroid an die Mikrokanäle in einem mikrofluidischen Gerät anschließen. Die Methode erlaubt die Perfusion der Sphäroid, das eine lang ersehnte Technik in dreidimensionale Kulturen ist.

Perfusable vaskuläre Netzwerk mit einem Gewebe-Modell in einem mikrofluidischen Gerät

Wir entwickelten eine heterogene Brust-Krebs-Modell, bestehend aus verewigt Tumor und Fibroblasten-Zellen eingebettet in ein Bioprintable Alginat/Gelatine Bioink. Das Modell der in Vivo Tumor Mikroumgebung rekapituliert und erleichtert die Bildung von mehrzelligen Tumor Sphäroide, Einblick in die Mechanismen fahren Tumorgenese nachgeben.

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

Präsentiert wird hier ein einfach zu bedienender, Kern-/Schalen-, dreidimensionaler Bioprinting-Aufbau für die einstufige Fertigung von Hohlgerüsten, geeignet für die Gewebetechnik von Gefäß- und anderen Röhrenstrukturen.

Core/Shell DruckGerüste für Tissue Engineering von Röhrenstrukturen

Crosstalk zwischen Brustepithelzellen und Endothelzellen trägt wesentlich zum Fortschreiten von Brustkrebs, Tumorwachstum und Metastasierung bei. In dieser Studie wurden Sphäroide aus Brustkrebszellen zusammen mit vaskulären und/oder lymphatischen Endothelzellen hergestellt und demonstrieren ihre Anwendbarkeit als In-vitro-System für die Brustkrebsforschung.

Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Konstruierte Klappen erfordern ein integriertes funktionelles Gefäßnetzwerk. In diesem Protokoll stellen wir eine Methode zur Herstellung einer 3D-gedruckten Gewebeklappe vor, die ein hierarchisches Gefäßnetzwerk und seine direkten mikrochirurgischen Anastomosen an der Oberschenkelarterie der Ratte enthält.

Herstellung von technischen Gefäßklappen mit 3D-Drucktechnologien

Wir stellen ein Protokoll für die Hochdurchsatzproduktion von Gefäßkanälen mit flexiblen Größen und gewünschten Mustern auf einer Standard-Sechs-Well-Platte unter Verwendung der 3D-Bioprinting-Technologie vor, die als Gefäße auf einer Platte (VOP) bezeichnet wird. Diese Plattform hat das Potenzial, die Entwicklung von Therapeutika für die mit einem kompromittierten Endothel verbundenen Erkrankungen voranzutreiben.

Hochdurchsatz-Bioprinting-Verfahren zur Modellierung der Gefäßpermeabilität in Standard-Sechs-Well-Platten mit Größen- und Musterflexibilität

Es besteht ein dringender Bedarf an 3D-Krebsmodellen, die heterozelluläre Wechselwirkungen erfassen, um Krebsmetastasen zu untersuchen. Unsere Studie stellt die Erzeugung von heteromultizellulären Stroma-Epithel-Epithelen in einer gerüstfreien und gerüstfreien Umgebung vor, die zur Untersuchung der Invasion und der zellulären räumlichen Verteilungen verwendet werden kann.

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Erfahren Sie das Bioprinting von Brustepithelsphäroiden auf vaskuläre Netzwerke für 3D-Gewebe-Modelle. Diese Methode ermöglicht schnelle Arzneimitteltests und personalisierte Medizin in vitro.

Direkter Bioprinting von 3D Multizellulären Brustsphäroiden auf Endotheliale Netzwerke

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