T- und B-Zell-Rezeptor-Immunrepertoireanalyse mittels Next-Generation-Sequencing
12. Januar 2021
Das aktuelle Protokoll beschreibt eine Methode zur DNA-Isolierung aus Blutproben und Darmbiopsien, die Generierung von TCRβ- und IGH-PCR-Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation, die Durchführung eines NGS-Laufs und die grundlegende Datenanalyse.
Diese Methode ermöglicht die Erforschung spezifischer T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene und kann so dynamische Veränderungen in Lymphozytenpopulationen und Diversitätsparametern bei verschiedenen Erkrankungen identifizieren. Der Vorteil der Next-Generation-Sequenzierung ist die Fähigkeit, einzigartige T- oder B-Zellklone zu identifizieren und sie an verschiedenen anatomischen Stellen oder bei verschiedenen Individuen zu verfolgen. Dies hat das Potenzial, neuartige Biomarker bei verschiedenen Krankheiten zu identifizieren.
Dieses Verfahren wird Naomi Salamon, eine Forschungsassistentin aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Verdauung und Zelllyse von Darmbiopsien. Rufen Sie Darmbiopsien entweder frisch gesammelt oder bei negativen 20 oder negativen 80 Grad Celsius gelagert.
Wenn Sie gefrorene Biopsien verwenden, tauen Sie sie auf Eis auf. 600 Mikroliter Kernlyselösung in ein steriles 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben, das auf Eis gekühlt wird. Dann legen Sie eine Biopsie in die Röhre und inkubieren Sie sie bei 65 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten.
Fügen Sie 17,5 Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht bei 55 Grad Celsius unter sanftem Schütteln. Lassen Sie die Probe nach der Inkubation fünf Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen. Zur DNA-Isolierung aus dem Blut die Röhre vorsichtig schaukeln, bis sie gründlich gemischt ist.
Anschließend wird das Blut in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit neun Millilitern Zelllyselösung überführen. Kehren Sie das Röhrchen während einer 10-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur mehrmals um. Zentrifuge bei 600g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Entsorgen Sie dann so viel Überstand wie möglich, ohne das sichtbare weiße Pellet zu stören. Wirbeln Sie das Rohr 15 Sekunden lang kräftig vor, bis es vollständig resuspendiert ist. Fügen Sie drei Milliliter Kernlyselösung hinzu und pipetetten Sie mehrmals, wodurch die Lösung viskos wird.
Fügen Sie der Probe einen Proteinfällungspuffer hinzu. Dann 20 Sekunden lang kräftig wirbeln und fünf Minuten lang auf Eis inkubieren. Zentrifuge bei 16.000 g für vier Minuten, um ein dichtes Pellet zu bilden, das die gefällten Proteine enthält.
Den Überstand vorsichtig ohne Störung des Pellets in ein neues 1,7-Milliliter-Rohr überführen. Fügen Sie einen Milliliter 2-Propanol in das Röhrchen mit dem Überstand hinzu und mischen Sie es vorsichtig durch Invertieren. Die DNA soll als weiße schwimmende Substanz sichtbar werden.
Zentrifuge bei 16.000 mal g für eine Minute und entfernen Sie den Überstand vollständig. Fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitetes 70% Ethanol hinzu und kehren Sie das Röhrchen mehrmals um. Zentrifugieren Sie es bei 16.000g für eine Minute bei Raumtemperatur.
Dann verwerfen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche. Dann lassen Sie das DNA-Pellet für 10 bis 15 Minuten an der Luft trocknen.
Fügen Sie der DNA 50 Mikroliter hochreines Wasser hinzu und führen Sie eine DNA-Quantifizierung durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie 150 Nanogramm DNA, um die Bibliothek für die Sequenzierung vorzubereiten. Legen Sie Pipetten und Spitzen mit UV-Licht für 15 Minuten in die Haube, um Rest-DNA abzubauen.
Lassen Sie in der Zwischenzeit die verschiedenen Indexröhrchen und dna-Polymerase auf Eis auftauen. In einer biologischen Haube 45 Mikroliter aus den verschiedenen Indexröhrchen zu den PCR-Röhrchen geben, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Anschließend werden 0,2 Mikroliter der DNA-Polymerase und fünf Mikroliter der vorbereiteten DNA in die PCR-Röhrchen eingeschmischt.
Führen Sie die PCR mit einem voreingestellten Programm gemäß den Anweisungen des Herstellers aus. Verwenden Sie magnetische Perlen zur Entfernung von überschüssigen Primern, Nukleotiden und Enzymen. Erwärmen Sie die Perlen mindestens 30 Minuten lang auf Raumtemperatur und bereiten Sie genügend frisches 80% Ethanol für 400 Mikroliter pro Probe zu.
Fügen Sie die Perlen zu jedem PCR-Röhrchen hinzu und mischen Sie es 10 Mal durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Röhrchen für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Legen Sie die gemischte Probe für fünf Minuten auf den Magnetständer.
Dann saugen Sie die klare Flüssigkeit an und entsorgen Sie sie. Saugen Sie die verbleibende Flüssigkeit mit einer 10-Mikroliter-Spitze an. Fügen Sie 200 Mikroliter 80% Ethanol zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie sie für 30 Sekunden.
195 Mikroliter Ethanol absaugen und entsorgen. Dann saugen Sie die verbleibende Flüssigkeit mit einer 10-Mikroliter-Spitze an. Wiederholen Sie die Ethanolwäsche.
Öffnen Sie dann die Kappen der Schläuche und lassen Sie sie fünf Minuten an der Luft trocknen. Nach fünf Minuten die Proben aus dem Magnetständer entfernen und 25 Mikroliter Elutionspuffer hinzufügen. Durch Pipettieren bis zum Homogenen mischen und bei Raumtemperatur zwei Minuten lang inkubieren.
Legen Sie die Röhren für fünf Minuten auf den Magnetständer. Dann 22 Mikroliter in eine neue PCR-Röhre übertragen und die DNA-Konzentration messen. Quantifizieren Sie das Amplicon wie im Textmanuskript beschrieben.
Nachdem Sie die endgültige DNA-Konzentration und die Größe des Peaks des Produkts in Basenpaaren berechnet haben, bereiten Sie für jede Probe eine neue Verdünnungsmischung vor und übertragen Sie zwei Mikroliter davon in eine neue Poolmischung. Bereiten Sie eine frische Lösung von 0,2 normalem Natriumhydroxid vor und fügen Sie 10 Mikroliter zur verdünnten Bibliothek hinzu. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die doppelsträngige DNA zu denaturieren.
Dann fügen Sie 980 Mikroliter vorgekühlten Puffer aus dem Kit in die Röhre mit DNA und Wirbel kurz hinzu. Legen Sie 600 Mikroliter der endgültigen Bibliothek auf die dafür vorgesehene Patrone und legen Sie die Proben in die Maschine. Um eine Sequenzanalyse durchzuführen, laden Sie Sequenzierungsmetriken vom Sequenzer herunter, und überprüfen Sie, ob sich die Daten innerhalb der entsprechenden Bereiche befinden.
Wiederholen Sie den Lauf für Beispiele, die die Kriterien nicht erfüllen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine grundlegende Analyse von repräsentativen autologen Blut- und Rektalproben eines Patienten mit IL10-Rezeptormangel und einer Vorgeschichte von schwerer infantiler IBD durchzuführen. Die Proben wurden sowohl für das TCR-beta- als auch für das IGH-Repertoire untersucht.
Alle Klone können durch ihre einzigartige Sequenz auf Nukleotid- oder Aminosäureebene identifiziert werden. Diese Sequenzen können zwischen verschiedenen Patienten auf der Suche nach gemeinsamen Klonen oder im selben Patienten zwischen verschiedenen anatomischen Stellen verglichen werden. Die fünf häufigsten Klone für jedes Beispiel sind hier dargestellt.
Für einen breiten Überblick über das Repertoire wurden TreeMap-Bilder generiert. Jedes farbige Quadrat stellt einen anderen Klon dar, und die Größe korreliert mit seiner Häufigkeit. Diese TreeMap-Bilder zeigen die klonale Expansion im intestinalen IGH-Repertoire.
Im Gegensatz dazu wird im TCR-beta-Repertoire eine ausgeprägte klonale Expansion im Blut im Vergleich zum autologen Darm beobachtet. Auf Genebene liefert NGS Informationen über die Verwendung von V, D und J auf der Ebene von Gen, Familie oder Allel. Darüber hinaus können aus den Daten für TCR-beta- und IGH-Repertoires spezifische VDJ-Kombinationen abgeleitet werden, die differentielle Gennutzungsmuster unter verschiedenen Bedingungen aufdecken.
Dieses Protokoll kann sowohl auf DNA als auch auf RNA angewendet werden und kann verwendet werden, um TCR-alpha-, TCR-gamma- und IGL-Repertoires zu generieren. Es ist auch mit anderen Organen nach leichten Verdauungsmodifikationen kompatibel.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von DNA aus Blutproben und Darmbiopsien, zur Erstellung von TCR尾- und IGH-PCR-Bibliotheken für die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) sowie zur Durchführung einer grundlegenden Datenanalyse. Es ermöglicht die Untersuchung der Dynamik von T- und B-Zellen auf Nukleotid- oder Aminosäureebene und erleichtert die Identifizierung eindeutiger Klone an verschiedenen anatomischen Standorten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Genomik
- Next-Generation Sequencing
Hintergrund
- Die Next-Generation-Sequenzierung ermöglicht eine detaillierte Analyse von Lymphozytenpopulationen.
- Mit dieser Methode können dynamische Veränderungen der Immunantworten bei verschiedenen Erkrankungen aufgezeigt werden.
- Die Identifizierung einzigartiger T- oder B-Zellklone kann zur Entdeckung neuartiger Biomarker führen.
- Das Verfahren wird von einer wissenschaftlichen Hilfskraft im Labor demonstriert.
Zweck der Studie
- Isolierung von DNA aus biologischen Proben zur Sequenzierung.
- Analyse der Diversität von T- und B-Zellen bei verschiedenen Erkrankungen.
- Verfolgung von Immunzellklonen an verschiedenen anatomischen Lokalisationen.
Verwendete Methoden
- Isolierung von DNA aus Blut- und Darmbiopsien.
- Erstellung von TCR尾- und IGH-PCR-Bibliotheken.
- Durchführung von Next-Generation-Sequencing-Läufen.
- Grundlegende Datenanalyse der Sequenzierergebnisse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von DNA aus Proben.
- Erzeugung von Bibliotheken, die für die NGS geeignet sind.
- Identifizierung eindeutiger T- und B-Zellklone.
- Erkenntnisse zur Lymphozytendiversität bei verschiedenen Erkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode verbessert das Verständnis der Immunantwortdynamik.
- Sie bietet einen Rahmen zur Identifizierung von Biomarkern bei Krankheiten.
- Der Ansatz kann für verschiedene Forschungsanwendungen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Analyse des immunologischen Repertoires von T- und B-Zell-Rezeptoren mittels Next-Generation-Sequenzierung bietet der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung einen hochauflösenden Einblick in die Dynamik des adaptiven Immunsystems und ermöglicht eine mechanismenbasierte Risikominimierung bei der Zielvalidierung und der Entdeckung von Biomarkern. Durch die Quantifizierung von Klonalität, Genverwendung und Repertoirevielfalt über verschiedene Krankheitszustände hinweg unterstützt die Methode die Vorhersagegenauigkeit bei frühen Entscheidungen in der Entdeckungs- und translationsmedizinischen Phase. Diese Fähigkeit ist unmittelbar auf immunologisch ausgerichtete Entwicklungsplattformen anwendbar, die darauf abzielen, Immunantworten mit therapeutischen Wirkungen bei entzündlichen, infektiösen, onkologischen und autoimmunen Erkrankungen zu verknüpfen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Verfolgung antigenspezifischer T- und B-Zellklone über anatomische Standorte und Zeitpunkte hinweg.
- Operationaler Wert: Bietet eine Auflösung auf Nukleotid- oder Aminosäureebene der Immunrepertoires, um die funktionelle Zielstrukturenbindung und die biologische Risikominderung zu klären.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem klonal expandierte Populationen identifiziert werden, die mit dem Krankheitsphänotyp oder der Therapieantwort korrelieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, quantitative Profile des Immunrepertoires, die für die Assay-Standardisierung und die Beurteilung der Reproduzierbarkeit geeignet sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Herstellung validierter biologischer Systeme aus Blut und Gewebe für nachgeschaltete Screening-Workflows.
- Technischer Wert: Liefert Metriken zur Klonalität und Diversität, die als zuverlässige Messgrößen für Screening-Kampagnen mit Wirkstoffen oder Biologika dienen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationeller Nutzen: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die klonalen Dynamiken in krankheitsrelevanten Systemen verfolgt werden.
- Biomarker-Abstimmung: Ermöglicht die Identifizierung gemeinsamer oder erweiterter Klone über Patienten hinweg und unterstützt so die translationelle Entdeckung von Biomarkern bei immunvermittelten Erkrankungen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Leitet Go/No-Go-Entscheidungen ein, indem unterschiedliche VDJ-Gen-Nutzungsmuster und klonale Expansionsprofile, die mit der Pathophysiologie assoziiert sind, aufgezeigt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zu präklinischen Studien, insbesondere in Immunologie- und Immuno-Onkologie-Pipelines, bei denen die Absicherung immunologischer Wirkmechanismen entscheidend ist.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Aufdeckung antigenspezifischer, klonaler Selektion und Expansion in den T- und B-Zell-Kompartimenten.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Bibliotheksherstellung und Sequenzierung der TCR- und IGH-Repertoires aus isolierter DNA.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse, einschließlich Klonalität, Nutzung der Genfamilien (V, D, J) und Verfolgung einzigartiger Klone zur vergleichenden Analyse unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem sie die langfristige Verfolgung immunologischer Klone in Blut- und Gewebekompartimenten ermöglicht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattformfunktion, die nach Anpassung des Protokolls auf verschiedene Krankheitsbereiche und Probenarten anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen bei der immunvermittelten Target-Validierung durch direkte Messung der Repertoire-Dynamik.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch kontrollierte DNA-Isolierung, Bibliotheksherstellung und NGS-Workflows.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühzeitige Identifizierung immunologisch aktiver Klone ermöglicht wird und damit das biologische Risiko in späteren Entwicklungsstadien reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem Veränderungen des Immunrepertoires mit Krankheitsmechanismen und therapeutischen Interventionen verknüpft werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Immunogenomik, NGS-Bibliotheksherstellung und bioinformatrischer Analyse von Immunrepertoire-Daten.
- Setzt Zugang zu NGS-Sequenziergeräten, magnetischen Bead-basierten Reinigungssystemen und kontrollierten Laborumgebungen für die DNA-Handhabung voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Teams hinweg zwischen Immunologie, Genomik und Datenwissenschaft zur konsistenten Analyse des Repertoires.
- Erfordert die Anpassung von Gewebeverdauungsprotokollen für nicht-intestinale Organe, wobei die DNA-Menge und -Integrität erhalten bleiben müssen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die erforderliche Menge an Input-DNA sowie mögliche Verzerrungen durch PCR-Amplifikation während der Bibliotheksherstellung.
