Polarisation von M1 und M2 Human Monocyte-Derived Cells und Analyse mit Durchflusszytometrie bei Mycobacterium tuberculosis Infection

Dieses Protokoll bietet die Möglichkeit, die Immunpolarisation von humanen Monozyten-abgeleiteten Zellen auf der Grundlage der Visualisierung und detaillierten Charakterisierung von grün fluoreszierendem Protein-markiertem Mtb in verschiedenen Makrophagen-Untergruppen unter Verwendung der 10-Farben-Durchflusszytometrie zu verfolgen. Dies stellt eine effiziente und reproduzierbare Methode dar, um das Ansprechen auf eine Mtb-Infektion in M1- oder M2-polarisierten Makrophagen zu untersuchen, einschließlich der Beurteilung des Phänotyps und der Funktion vor und nach der Infektion. Um PBMC aus menschlichen Spender-Buffy-Coats zu isolieren, verwenden Sie eine Pipette, um langsam 15 Milliliter Buffy-Coat-Blut an der Seite eines 50-Milliliter-Röhrchens auf 15 Milliliter Dichtegradientenmedium zu überlagern und die Zellen durch Zentrifugation zu trennen.

Verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette, um die oberste Plasmaschicht zu entfernen, und übertragen Sie die mononukleäre Zellschicht vorsichtig in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie serumfreies RPMI-Medium bis zu einem Endvolumen von 50 Millilitern in die Zellen und drehen Sie das Röhrchen vor dem Zentrifugieren einige Male vorsichtig um. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 20 Millilitern serumfreiem Medium zur Zählung.

Um die Makrophagendifferenzierung zu initiieren, verdünnen Sie die Zellen auf eine 5 mal 10 bis 6. Zellen pro Milliliter serumfreier Mediumkonzentration und säen Sie zwei Milliliter Zellen in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte aus. Legen Sie die Platte für zwei bis drei Stunden in den Zellkultur-Inkubator, damit die Zellen an den Well-Böden haften können. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit einem Milliliter serumfreiem Medium pro Waschgang und fügen Sie zwei Milliliter vollständiges RPMI-Medium, ergänzt mit 50 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF bzw. 50 Nanogramm pro Milliliter M-CSF für die M1- bzw. M2-Differenzierung, zu jeder Vertiefung der adhärenten Zellen hinzu.

Drei Tage nach Beginn der Polarisation wird vorsichtig ein Milliliter Überstand aus jeder Vertiefung durch einen Milliliter frisches, vollständiges Medium ersetzt, das mit den entsprechenden Wachstumsfaktoren ergänzt wurde. Am sechsten Tag der Kultur werden 50 Nanogramm pro Milliliter Interferon-Gamma und 10 Nanogramm pro Milliliter LPS in die GM-CSF-behandelten Vertiefungen und 20 Nanogramm pro Milliliter IL-4 in die mit M-CSF behandelten Vertiefungen gegeben. Überprüfen Sie die Morphologie der aus Monozyten gewonnenen Zellkulturen regelmäßig durch Lichtmikroskopie, um sicherzustellen, dass sich die kleineren Monozyten zu größeren Makrophagen-ähnlichen Zellen differenzieren.

Um eine Mtb-Kultur in einer Anlage der Biosicherheitsstufe III einzurichten, mischen Sie ein Milliliter-Aliquot aufgetauter Bakteriensuspension mit neun Millilitern TB-Komplettmedium in einem 50-Milliliter-Patronenröhrchen mit gefiltertem Verschluss für eine 24-stündige Inkubation im Röhrchen im Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Tag sammeln Sie die Bakterien durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 15 bis 20 Millilitern frischem TB-Komplettmedium in einem neuen 50-Milliliter-Kulturröhrchen mit gefilterter Kappe, bevor Sie die Bakterien in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen. Waschen Sie die Bakterien nach sieben bis 10 Tagen Kultur zweimal in 35 bis 40 Millilitern sterilem Waschpuffer pro Waschgang und resuspendieren Sie die Bakterien nach dem zweiten Waschen in einem Milliliter serumfreiem RPMI-Medium.

Geben Sie weitere neun Milliliter serumfreies RPMI-Medium zu den Bakterien und beschallen Sie die Bakterien in einem Wasserbad-Ultraschallgerät in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Messen Sie dann die optische Dichte von einem Milliliter Bakteriensuspension bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern in einem Spektralphotometer, das sich in der Biosicherheitswerkbank befindet. Um die von Monozyten abgeleiteten Zellen zu infizieren, verdünnen Sie die Bakterien auf eine 5 mal 10 bis 6. koloniebildende Einheiten pro Milliliter in serumfreiem Medium und ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung der Sechs-Well-Zellkulturplatte durch einen Milliliter frisches serumfreies Medium und einen Milliliter Bakteriensuspension pro Vertiefung, um eine Multiplizität von fünf Infektionen zu erhalten.

Waschen Sie nach einer vierstündigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator jede Vertiefung dreimal mit einem Milliliter sterilem Waschpuffer pro Waschgang und kippen Sie die Platte vorsichtig, um nach jedem Waschen das gesamte Puffervolumen aus den Ecken der Vertiefungen zu entfernen. Dann resuspendieren Sie die Mtb-infizierten Monozyten-abgeleiteten Zellen in zwei Millilitern vollständigem Medium ohne Antibiotika. Um die Zellen für die Durchflusszytometrie zu färben, inkubieren Sie die infizierten Zellen mindestens 30 Minuten lang mit einem Milliliter FACS-Puffer, der mit 0,5 millimolaren EDTA pro Vertiefung ergänzt wird.

Am Ende der Inkubation sammeln Sie die abgelösten Zellen durch vorsichtiges Pipettieren und überführen die Zellen zur Zentrifugation in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss. Resuspendieren Sie die Zellen in etwa 50 Mikrolitern Fluorochrom-konjugiertem Anti-Human-Antikörper-Cocktail und Viabilitätsfarbstoff von Interesse und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius lichtgeschützt. Fixieren Sie die Zellen nach dem Waschen mit 200 Mikrolitern frisch zubereitetem Fixierpuffer für 30 Minuten bei Lichtschutz bei Raumtemperatur.

Nach der Fixierung und dem Waschen resuspendieren Sie die Zellen in 400 Mikrolitern FACS-Puffer und überführen die Zellen in Ein-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Um die Zellen zu analysieren, verwenden Sie Kompensationsbeads, um das Fluoreszenzsignal für jeden Fluorochrom-konjugierten Antikörper im Cocktail zu kompensieren, und verwenden Sie ungefärbte Zellen, um das Gate für die negative Zellpopulation zu setzen. Erfassen Sie dann mindestens 50.000 Zellen pro Probe.

Sowohl M1- als auch M2-Monozyten-abgeleitete Zellen zeigen bei einer Mtb-Infektion eine vertikale Verschiebung hin zu einer höheren Granularität und einer reduzierten Zellgröße. Ein erhöhter Zelltod wird auch bei Mtb-infizierten M1- und M2-Zellen bei einer Infektionsvielfalt von fünf im Vergleich zu nicht infizierten M0-Zellen beobachtet. Bemerkenswert ist, dass in M2-Zellen nach vierstündiger Infektion im Vergleich zu M1-Zellen eine wesentlich höhere Mtb-GFP-Expression beobachtet wird.

Nicht infizierte M1- und M2-Zellen können durch ihre CD64- und CD86- bzw. CD200-Rezeptor- bzw. CD163-Koexpression charakterisiert werden. Nach vierstündiger Mtb-Infektion wird in den Mtb-GFP-positiven M1-polarisierten Zellen eine erhöhte Häufigkeit von CD200-Rezeptor-positiven Zellen beobachtet, während die CD163-Expression in M2-Zellen reduziert ist. Mtb-GFP-Bakterien können auch in CD64-positiven M1-Zellen und CD163-positiven M2-Zellen durch konfokale Mikroskopie beobachtet werden.

Die UMAP-Analyse zeigt, dass eine vierstündige Mtb-Infektion nicht ausreicht, um die Polarisation der Makrophagen zu beeinflussen, während eine 24-stündige Infektion zu klar getrennten Clustern von nicht infizierten und infizierten M1- und M2-Zellen führt, die unterschiedliche Oberflächenmarker-Expressionsprofile aufweisen. Darüber hinaus zeigt die PhänoGraph-Analyse, dass 24 verschiedene Cluster unterschiedlicher Größe eindeutig auf die nicht infizierten und Mtb-infizierten M1- und M2-Zellen verteilt sind. Die Wirksamkeit der M1- oder M2-Polarisation oder der Mtb-Infektiosität kann zwischen menschlichen Spendern erheblich variieren.

Daher wird empfohlen, mindestens zwei Spender in jedes Experiment einzubeziehen, um experimentelle Variationen zu reduzieren. Dieses Modell ermöglicht die gleichzeitige Beurteilung humaner Makrophagen mittels Durchflusszytometrie, konfokaler Mikroskopie, mRNA-Expressionsanalyse, Multiplex-Assays löslicher Faktoren und bakterieller Quantifizierung mittels GFP-Expression oder koloniebildenden Einheiten.