Name: Segmentierung des Wachstums von Endothelzellen in 6-Well-Platten auf einem Orbitalschüttler für mechanobiologische Studien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Lernen Sie eine Beschichtungsmethode zur lokalisierten Endothelzellkultur in 6-Well-Platten auf einem Orbitalschüttler für mechanobiologische Scherstressstudien. Dieses Protokoll ermöglicht präzise Untersuchungen des Zellverhaltens unter definierten Flussbedingungen.

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Die Autoren danken einem Projektzuschuss der British Heart Foundation (an PDW), einem National Medical Research Council Singapore TAAP und DYNAMO Grant (an XW, NMRC / OFLCG / 004 / 2018, NMRC / OFLCG / 001 / 2017), einem A * STAR Graduate Scholarship (an KTP) und einem British Heart Foundation Center of Research Excellence Studentship (an MA).

1. Herstellung von Produkten und Herstellung von Reagenzien
<ol><li>Herstellung von Edelstahlmodulen<ol>
<li>Fertigen Sie das Edelstahlmodul aus Edelstahl der Klasse 316 mit einer CNC-Fräsmaschine gemäß der mitgelieferten Konstruktionszeichnung (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D-Druck einer Polydimethylsiloxan (PDMS)-Form<ol>
<li>Bereiten Sie ein 3D-CAD-Modell (Computer Aided Design) der PDMS-Form mit SolidWorks gemäß der bereitgestellten Konstruktionszeichnung vor (Abbildung 2).</li>
		<li>Exportieren Sie das CAD-Modell in eine STL-Datei und importieren Sie die STL-Datei in Cura 2.6.2.</li>
		<li>Schneiden Sie das Modell in Schichten mit einer Druckgeschwindigkeit von 50 mm/s und einer Fülldichte von 60%.</li>
		<li>Exportieren Sie die Datei als G-Code und laden Sie sie zum Drucken auf einen Ultimaker2 3D-Drucker hoch. Verwenden Sie Polymilchsäure (PLA) als Druckmaterial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gießen des PDMS-Rings<ol>
<li>Mischen Sie die PDMS-Basis und das Härter (beide aus einem Silikonelastomer-Kit) mit dem Verhältnis von 90,9% Basis und 9,1% Härter.</li>
		<li>Gießen Sie etwa 2,6 ml der gut gemischten Lösung in die 3D-gedruckte Form.</li>
		<li>Blasen in einer Vakuumentgasungskammer entfernen.</li>
		<li>Härten Sie es für 1 h in einem 80 °C Ofen aus.</li>
		<li>Lassen Sie den PDMS-Ring auf Raumtemperatur abkühlen und entfernen Sie dann den ausgehärteten PDMS-Ring vorsichtig aus der Form. Die Konstruktionszeichnung des PDMS-Rings ist in Abbildung 3 dargestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zubereitung von 1% Pluronic F-127<ol>
<li>5 g Pluronic F-127 abwiegen, in eine Glasflasche gießen und dann 100 ml steriles Wasser in die Glasflasche geben. Dies ergibt eine 5% Pluronic F-127 Lösung.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass das gesamte Pluronic F-127 Pulver in das Wasser getaucht ist, schließen Sie die Kappe und autoklavieren Sie sie mit einem flüssigen Sterilisationszyklusprogramm.</li>
		<li>Nach dem Autoklaven die Lösung vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen lassen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 ml 5% Pluronic F-127-Lösung zu 40 ml autoklaviertem sterilem Wasser hinzu, um 1% Pluronic F-127-Lösung herzustellen. Führen Sie die Verdünnung in einer Biosicherheitsschranke (BSC) durch.</li>
		<li>Lagern Sie sowohl 1% als auch 5% Pluronic F-127 bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA)<ol>
<li>800 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in ein Glasbecherglas geben und unter Rühren auf 60 °C erhitzen (von Schritt 1.5.1 bis 1.5.5 weiter rühren).</li>
		<li>Wiegen Sie 40 g PFA-Pulver und geben Sie es in die warme PBS-Lösung. ACHTUNG: PFA ist gefährlich, führen Sie die Schritte 1.5.2 bis 1.5.6 in einem Abzug durch.</li>
		<li>Fügen Sie 1 M Natriumhydroxid (NaOH) langsam abfallweise in die PFA-Lösung hinzu, bis die Lösungen klar werden.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert der PFA-Lösung mit 1 M Salzsäure (HCl) auf etwa 7,4 ein.</li>
		<li>Aufladen Sie die Lösung mit 1X PBS auf 1 L auf. Dies ergibt 1 L von 4% PFA.</li>
		<li>Filtern Sie die PFA-Lösung mit 0,2 μm-Filtern, um Partikel zu entfernen, aliquot und gefrieren Sie sie in einem Gefrierschrank mit -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zubereitung von 0,1% Triton-X<ol>
<li>Fügen Sie 50 μL reines Triton-X in 50 ml PBS hinzu, um 0,1% ige Triton-X-Lösung herzustellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von 1% Rinderserumalbumin (BSA)<ol>
<li>Wiegen Sie 0,5 g BSA, gießen Sie es in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie dann 50 ml PBS in das Röhrchen hinzu.</li>
		<li>Lassen Sie es für 1 h bei Raumtemperatur auf einer Walze rollen, um sich aufzulösen.</li>
		<li>Lagern Sie 1% BSA bei 4 °C bis zu zwei Wochen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Beschichtung einer 6-Well-Platte
<ol><li>Autoklav-Edelstahlmodul, PDMS-Ring und Pinzette vor Gebrauch. Führen Sie alle nachfolgenden Verfahren in einer BSC-Haube durch und beachten Sie aseptische Techniken, um die Sterilität zu gewährleisten.</li>
	<li>Legen Sie den PDMS-Ring mit einer Pinzette in eine 6-Vertiefung. Verwenden Sie den äußeren Rand des PDMS-Rings, um den PDMS-Ring konzentrisch mit dem Bohrraum auszurichten. HINWEIS: Es sollten nur nicht gewebekulturbehandelte Wellplatten verwendet werden.</li>
	<li>Legen Sie das Edelstahlmodul mit einer Pinzette auf den PDMS-Ring.</li>
	<li>Setzen Sie die Spitzen der internen Halteringzange in die Grifflöcher des Halterings ein, drücken Sie die Halterung zusammen, um den Durchmesser des Halterings zu reduzieren. Setzen Sie es in das 6-Well ein, drücken Sie es fest auf das Edelstahlmodul und lassen Sie die Zange los, um den PDMS-Ring im Bohrschacht zu befestigen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml 5 μg / ml Fibronektin in die Mitte oder den Rand des Brunnens (abhängig von der region des Interesses) durch die Öffnung des PDMS-Rings und des Edelstahlmoduls hinzu.</li>
	<li>Schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die Fibronektinlösung den gesamten interessierende Bereich abdeckt.</li>
	<li>30 min bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter 95% Luft/5% CO2 inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Fibronektinlösung aus dem Brunnen und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Entfernen Sie das PBS vollständig aus dem Brunnen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Haltering, das Edelstahlmodul und den PDMS-Ring aus dem Brunnen.</li>
	<li>Fügen Sie 1,5 ml 1% Pluronic F-127 in die Mitte oder den Rand des Brunnens (unbeschichtete Oberfläche) hinzu und inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur, um die unbeschichtete Oberfläche zu passivieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Pluronic F-127-Lösung aus dem Brunnen und waschen Sie sie dreimal mit PBS.</li>
	<li>Verwenden Sie die beschichtete Gut gut oder lagern Sie sie bei 4 °C für bis zu zwei Wochen mit einer Schicht PBS in der beschichteten Vertiefung.</li>
</ol>3. Aussaat von HUVECs
<ol><li>Verwenden Sie HUVECs unter Passage 5 im Experiment.</li>
	<li>Entfernen Sie das gesamte Kulturmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.</li>
	<li>3 ml 0,05% Trypsin hinzufügen und 3 min bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator unter 95% Luft/5% CO2inkubieren. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen zu vertreiben. HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit HUVECs getestet und die Konzentration von Trypsin und seine Inkubationszeit können für andere Arten von ECs unterschiedlich sein.</li>
	<li>Die Lösung wird in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen gegeben und das Trypsin mit 6 mL Kulturmedium (z.B. Lonza EGM-2) neutralisiert, das auf 37 °C vorgewärmt ist.</li>
	<li>Zentrifuge bei 200 x g für 5 min. Entfernen Sie die neutralisierte Trypsinlösung und resuspend zellen mit 1 ml vorgewärmtes Kulturmedium.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und säen Sie 180k Zellen in eine beschichtete 6-Well-Platte in 1,5 ml vorgewärmtem Kulturmedium.</li>
	<li>Schütteln Sie die Brunnenplatte seitlich, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gleichmäßig im Brunnen verteilen.</li>
	<li>Lassen Sie es in einem 37 °C befeuchteten Inkubator unter 95% Luft/5% CO2 über Nacht.</li>
	<li>Entfernen Sie die nicht befestigten Zellen und das Kulturmedium und ersetzen Sie sie durch 2 ml vorgewarmtes Kulturmedium. HINWEIS: Es werden viele nicht angehängte Zellen erwartet, die im Medium schweben.</li>
</ol>4. Scherspannungsanwendung mit einem Orbitalschüttler
<ol><li>HUVECs sollten nach 3 Tagen wachstum die Konfluenz erreichen. Ersetzen Sie das Medium durch 1,9 ml vorgewarmtes Kulturmedium (um eine Höhe von 2 mm zu erreichen).</li>
	<li>Legen Sie die Platte auf die Plattform eines Orbitalschüttlers in einem befeuchteten Inkubator unter 95% Luft / 5% CO2 und schwenken Sie sie 3 Tage lang mit 150 U / min. HINWEIS: Wischen Sie die Außenfläche des Orbitalschüttlers mit 70% Ethanol ab, bevor Sie ihn in den Inkubator legen.</li>
	<li>(Optional) Nach 2 Tagen Scherung können dem Kulturmedium Zytokine zugesetzt werden, um das Zusammenspiel zwischen Zytokinen und Scherstress zu untersuchen. Nach der Behandlung scheren Sie die Zellen für einen weiteren Tag. In dieser Studie wurde TNF-α verwendet, um die Zellen zu aktivieren.</li>
	<li>Führen Sie Analysen nach 3 Tagen Scherspannungsanwendung durch.</li>
</ol>5. Färbung und Bildgebung von Zellen
<ol><li>Nach 3 Tagen Scherung die Platte aus dem Inkubator entfernen und die Zellen zweimal mit PBS waschen.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 1,5 ml 4% PFA in die Vertiefung einfügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die 4% PFA aus dem Brunnen und waschen Sie sie zweimal mit PBS.</li>
	<li>Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 0,1% Triton-X in den Brunnen hinzufügen und 5 minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die 0,1% Triton-X-Lösung aus dem Bohrbrunnen und fügen Sie 1,5 ml 1% BSA zur Blockierung in die Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen mit 1% BSA für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Kaninchen-Anti-Human-ZO-1-Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 in 1% BSA verdünnen. 1,5 ml verdünnter Antikörper in den Brunnen geben und mit den Zellen über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Nach der Inkubation über Nacht den verdünnten Antikörper entfernen und die Zellen dreimal mit PBS waschen.</li>
	<li>Verdünnen Sie Alexa Fluor 488-markierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1:300 in PBS. Fügen Sie 1,5 ml verdünnten sekundären Antikörper in die Vertiefung hinzu und inkubieren Sie sie mit den Zellen für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie den verdünnten sekundären Antikörper und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.</li>
	<li>DrAQ5 wird mit einer Verdünnung von 1:1000 in PBS verdünnt. Fügen Sie 1,5 ml verdünntes DRAQ5 in den Brunnen hinzu und inkubieren Sie es mit den Zellen für 15 minuten bei Raumtemperatur, um die Zellkerne zu färben.</li>
	<li>Entfernen Sie den verdünnten DRAQ5 und waschen Sie ihn dreimal mit PBS.</li>
	<li>Führen Sie einen Kachelscan vom Rand bis zur Mitte des Brunnens mit einem konfokalen Mikroskop durch.</li>
</ol>6. Quantifizierung von Formindex und Zellenzahl
<ol><li>Nachbearbeitung der Bilder mit MATLAB R2016a.</li>
	<li>Lesen Sie die LIF-Datei vom konfokalen Mikroskop in MATLAB und konvertieren Sie den zusammengeführten Kachelscan in ein Binärbild, dann schwellen Sie das Bild nach Fläche und Intensität, um Kerne vom Hintergrund zu unterscheiden.</li>
	<li>Unterteilen Sie den binären Kachelscan in radiale Segmente von 1 mm.</li>
	<li>Passen Sie eine Ellipse an jeden einzelnen Kern an.</li>
	<li>Zählen Sie die Anzahl der Ellipsen innerhalb jedes radialen Segments, um eine Zellnummer zu erhalten.</li>
	<li>Definieren Sie den Formindex = als SI = 4π x Fläche / Umfang2. Berechnen Sie den Formindex für jede Ellipse18.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Swirling-Well-Methode ist in der Lage, komplexe Strömungsprofile in einer einzigen Bohrung zu erzeugen - Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) in der Mitte und High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) am Rand des Bohrstücks. Scherstressvermittelte Sekrete löslicher Mediatoren werden jedoch in das wirbelnde Medium gemischt und beeinflussen Zellen im gesamten Brunnen, wodurch möglicherweise die wahre Wirkung eines bestimmten Scherspannungsprofils auf die Zellen maskiert wird.
Das hier demons...

Reaktionen von Gefäßzellen auf ihre mechanische Umgebung sind wichtig für die normale Funktion der Blutgefäße und für die Entwicklung von Krankheiten1. Die Mechanobiologie der Endothelzellen (ECs), die die innere Oberfläche aller Blutgefäße auskleiden, war ein besonderer Schwerpunkt der mechanoobiologischen Forschung, da ECs direkt den Scherstress erfahren, der durch den Blutfluss über sie erzeugt wird. Verschiedene phänotypische Veränderungen wie Entzündungsreaktionen, veränderte Steifigkeit und Morphologie, die Freisetzung vasoaktiver Substanzen und die Lokalisation und Expression von Junctionalproteinen hängen von der EC-Exposition gegenüber Scherstressab 2,3,4. Scherabhängige endotheliale Eigenschaften können auch für die lückenhafte Entwicklung von Krankheiten wie Atherosklerose verantwortlich sein5,6,7.
Es ist nützlich, die Wirkung der Scherung auf ECs in Kultur zu untersuchen, wo Spannungen kontrolliert werden können und ECs von anderen Zelltypen isoliert werden können. Häufig verwendete In-vitro-Geräte zum Anwenden von Scherspannungen auf ECs umfassen die Parallelplattenflusskammer und das Kegel-Platten-Viskosimeter, aber nur einachsige stetige, oszillierende und pulsierende Strömung kann angewendet werden8,9. Zwar wurden modifizierte Strömungskammern mit konischen oder verzweigten Geometrien und mikrofluidischen Chips entwickelt, die eine stenotische Geometrie nachahmen, ihr geringer Durchsatz und die relativ kurze Kulturdauer, die möglich ist, stellen jedoch eine Herausforderung dar10, 11.
Die Orbital-Shaker-Methode (oder Swirling Well) zur Untersuchung der endothelialen Mechanotransduktion, bei der Zellen in Standard-Zellkultur-Kunststoffware auf der Plattform eines Orbital-Shakers gezüchtet werden, gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit, da sie in der Lage ist, komplexe, räumlich variierende Scherspannungsmuster auf ECs mit hohem Durchsatz chronisch aufzuzwingen (siehe Review von Warboys et al.12). CFD-Simulationen (Computational Fluid Dynamics) wurden eingesetzt, um die räumliche und zeitliche Variation der Scherspannung in einem wirbelnden Brunnen zu charakterisieren. Die wirbelnde Bewegung des Kulturmediums, die durch die Orbitalbewegung der Shakerplattform verursacht wird, auf der die Platte platziert ist, führt zu Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF oder angeblich pro-atherogener Strömung) in der Mitte und High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF oder angeblich atheroprotektive Strömung) am Rand der Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Zum Beispiel beträgt die zeitgemittelte Wandscherspannung (TAWSS) ungefähr 0,3 Pa in der Mitte und 0,7 Pa am Rand einer 6-Well-Platte, die bei 150 U / min mit einem 5 mm Orbitalradius13verwirbelt wird. Das Verfahren erfordert nur handelsübliche Kunststoffware und den Orbitalshatterer selbst.
Es gibt jedoch einen Nachteil der Methode (und anderer Methoden zur Auferlegung von Strömungen in vitro): ECs setzen lösliche Mediatoren und Mikropartikel scherabhängig frei14 , 15,16und dieses Sekretom kann ECs in anderen Bereichen des Brunnens als dem, in dem sie freigesetzt wurden, aufgrund der Vermischung im wirbelnden Medium beeinflussen. Dies kann die tatsächlichen Auswirkungen von Scherspannung auf den EC-Phänotyp verschleiern. So haben Ghim et al. spekuliert, dass dies den scheinbar identischen Einfluss verschiedener Scherprofile auf den transzellulären Transport großer Teilchenerklärt 17.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Förderung der Adhäsion menschlicher Nabelschnurvenendothelzellen (HUVEC) in bestimmten Regionen einer 6-Well-Platte unter Verwendung einer Fibronektinbeschichtung unter Verwendung von Pluronic F-127, um die Oberfläche zu passivieren und das Wachstum an anderer Stelle zu verhindern. Die Methode löst die oben beschriebene Einschränkung auf, da ECs durch die Segmentierung des Zellwachstums nur eine Art von Scherprofil erfahren und nicht durch Sekretome von ECs beeinflusst werden, die anderen Profilen an anderer Stelle im Bohrfeld ausgesetzt sind.

<table><tbody><tr><td>Cell and Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Growth Medium (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>cc-3162</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzellen der menschlichen Nabelvene</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Isoliert aus Schnüren, die von Spendern mit unkomplizierten Wehen am Hammersmith Hospital</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> gewonnen wurden<tr><td>Reagenzien und Materialien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fuor 488-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418-50G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6 Well Klarer flacher Boden, nicht behandelt&nbsp;</td><td>Wissenschaftlicher Laborbedarf GmbH</td><td></td><td></td>351146</tr><tr><td>Fibronektin aus Rinderplasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TNF-a</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>RS PRO 2,85 mm Schwarz PLA 3D Drucker Filament, 1 kg</td><td>RS</td><td>832-0264</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl 316</td><td>Metall Supermarkt</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard184 Silikon Elastomer Kit</td><td>Farnell</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Zonula Occludens-1 (ZO-1) Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>13663</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (5mM)</td><td>Bio Status</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grant Orbital Shaker PSU-10i</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd&nbsp;</td><td></td><td></td>SHA7930</tr><tr><td>Leica TCS SP5 Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sicherungsringzange</td><td>Misumi</td><td>RTWP32-58</td><td></td></tr><tr><td>Sicherungsringe/intern/C-Typ</td><td>Misumi</td><td>RTWS35</td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker 2+3-D Drucker</td><td>Ultimaker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cura 2.6.2</td><td>Ultimaker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Das MathWorks</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 2016</td><td>Dassault Systèmes</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

segmentierung des wachstums von endothelzellen in 6-well-platten auf einem orbitalschüttler für mechanobiologische studien

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Scherspannung, die der Arterienwand durch den Blutfluss auferlegt wird, beeinflusst die Morphologie und Funktion der Endothelzellen. Niedrige Magnitude, oszillatorische und multidirektionale Scherspannungen wurden alle postuliert, um einen pro-atherosklerotischen Phänotyp in Endothelzellen zu stimulieren, während hohe Magnituden und unidirektionale oder einachsige Scherungen die endotheliale Homöostase fördern. Diese Hypothesen erfordern weitere Untersuchungen, aber traditionelle In-vitro-Techniken haben Einschränkungen und sind besonders schlecht darin, zellen multidirektionale Scherspannungen aufzuerlegen. 
Eine Methode, die zunehmend eingesetzt wird, ist die Kultierung von Endothelzellen in Standard-Multi-Well-Platten auf der Plattform eines Orbitalschüttlers; Bei dieser einfachen, kostengünstigen, hochdurchsatzreichen und chronischen Methode erzeugt das wirbelnde Medium in verschiedenen Teilen des Bohrbrunnens unterschiedliche Muster und Größen der Scherung, einschließlich multidirektionaler Scherung. Es hat jedoch eine signifikante Einschränkung: Zellen in einer Region, die einer Art von Fluss ausgesetzt sind, können Mediatoren in das Medium freisetzen, die Zellen in anderen Teilen des Brunnens betreffen, die verschiedenen Strömungen ausgesetzt sind, wodurch die scheinbare Beziehung zwischen Fluss und Phänotyp verzerrt wird. 
Hier stellen wir eine einfache und kostengünstige Modifikation der Methode vor, die es ermöglicht, Zellen nur bestimmten Scherspannungseigenschaften auszustellen. Die Zellaussaat wird auf einen definierten Bereich der Vertiefung beschränkt, indem der interessierende Bereich mit Fibronektin beschichtet wird, gefolgt von der Passivierung mit passivierender Lösung. Anschließend können die Platten auf dem Shaker verwirbelt werden, was dazu führt, dass die Zellen je nach Standort gut definierten Scherprofilen wie multidirektionaler Scherung niedriger Größe oder einachsiger Scherung hoher Größe ausgesetzt werden. Die Verwendung von Standard-Zellkultur-Kunststoffwaren ermöglicht nach wie vor eine einfache weitere Analyse der Zellen. Die Modifikation hat bereits den Nachweis löslicher Mediatoren ermöglicht, die unter definierten Scherspannungseigenschaften aus dem Endothel freigesetzt werden und Zellen an anderer Stelle im Bohrplatz beeinflussen.

Die Haftung von HUVECs an Bereichen der Brunnenplatte, die nicht mit Fibronektin beschichtet sind, wurde durch Pluronic F-127-Passivierung aufgehoben; Das Wachstum beschränkte sich auf die mit Fibronektin beschichtete Region auch nach 72 h Kultur mit und ohne Scherspannungsanwendung (Abbildung 4A, Abbildung 4C). Ohne die Pluronic F-127-Passivierung hafteten HUVECs ohne Fibronektin an der Oberfläche und hatten sich um 72 h Kultur ...

Dieses Protokoll beschreibt eine Beschichtungsmethode, um das Wachstum von Endothelzellen auf einen bestimmten Bereich einer 6-Well-Platte für die Scherspannungsanwendung unter Verwendung des Orbitalschüttlermodells zu beschränken.

Segmentierung des Wachstums von Endothelzellen in 6-Well-Platten auf einem Orbitalschüttler für mechanobiologische Studien

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

Dieses Protokoll beschreibt eine Beschichtungsmethode, um das Wachstum von Endothelzellen auf einen bestimmten Bereich einer 6-Well-Platte für die reine Stressanwendung unter Verwendung des Orbitalschüttlermodells zu beschränken. Eine gängige Möglichkeit, die Auswirkungen des Flusses auf das Endothel zu untersuchen, besteht darin, Endothelzellen in Multi-Well-Kulturplatten auf einem Orbitalschüttler zu kulturieren. Der Orbitalschüttler induziert eine Welle, die sich um den Brunnen dreht.Zellen im Zentrum des Brunnens erleben die Art von Strömungen, von denen angenommen wird, dass sie zu Atherosklerose führen. Zellen, die näher am Rand liegen, erfahren einen Fluss, von dem angenommen wird, dass er schützend ist. Es wird angenommen, dass die Eigenschaften der Zellen in jeder Region von den schieren Belastungen abhängen, die sie erfahren.Es gibt jedoch einen potenziellen Boden in dieser Logik. Endothelzellen setzen Mediatoren flussabhängig frei. Diese Mediatoren erreichen eine gleichmäßige Konzentration im wirbelnden Medium und beeinflussen daher Zellen in anderen Regionen als denen, in denen sie freigesetzt wurden.Das kann die wahren Auswirkungen der Scherung auf das Zellverhalten beschädigen oder verbergen. Der Effekt ist nicht auf das Wirbelbrunnensystem beschränkt. Es kann sogar in einfachen Modellen wie der parallelen Plattenflusskammer auftreten.Es kann vermieden werden, indem Zellen in nur einem Teil des Systems wachsen. Hier beschreiben wir Methoden, um die Zelladhäsion nur in der Mitte oder nur am Rand des Wirbelbrunnens zuzulassen. Herstellung von Edelstahlmodulen.Fertigen Sie das Edelstahlmodul aus einem Edelstahl der Klasse 316 gemäß einer technischen Zeichnung. 3D-Druck auf PDMs. Bereiten Sie ein 3D-CAD-Modell der PDM-Form mit SOLIDWORKS gemäß der bereitgestellten Konstruktionszeichnung vor.Exportieren Sie das CAD-Modell in eine STL-Datei und importieren Sie die STL-Datei in Cura 2.6.2. Schneiden Sie das Modell in Schichten mit einer Druckgeschwindigkeit von 50 Millimetern pro Sekunde und einer Fülldichte von 60% Exportieren Sie die Datei als GCode. Habe es zum Drucken auf einen Ultimaker 3D-Drucker hochgeladen.Verwenden Sie Polymilchsäure als Druckmaterial. Gießen des PDMS-Rings. Mischen Sie die PDMS-Basis und das Härter gut mit dem Verhältnis von 90,9% Basis und 9,1% Härter.Gießen Sie die gut gemischte Lösung in die 3D-gedruckte Form. Blasen in einer Vakuumentgasungskammer entfernen. Härten Sie es eine Stunde lang in einem 80-Grad-Ofen aus.Lassen Sie den PDMS-Ring auf Raumtemperatur abkühlen. Entfernen Sie dann den ausgehärteten PDMS-Ring vorsichtig aus der Form. Zubereitung von 1%Pluronic F-127.Wiegen Sie fünf Gramm Pluronic F-127. Gießen Sie es in eine Glasflasche. Dann fügen Sie hundert Mil Milli-Q Wasser in die Glasflasche hinzu.Dies ergibt eine 5% Pluronic F-127 Lösung. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Pluronic F-127 Pulver in das Wasser getaucht ist. Schließen Sie die Kappe und autoklavieren Sie sie mit einem flüssigen Sterilisationszyklusprogramm.Lassen Sie die Lösung vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen. Fügen Sie 10 mil 5% Pluronic F-127-Lösung zu 40 mil autoklaviertem Milli-Q-Wasser hinzu, um 1% Pluronic F-127-Lösung herzustellen. Führen Sie die Verdünnung in einer Biosicherheitsschrankhaube durch.Lagern Sie sowohl 1% als auch 5% Pluronic F-127 bei Raumtemperatur. Beschichtung der 6-Well-Platte. Autoklav-Edelstahlmodul, PDMS-Ring und Pinzette vor Dem Gebrauch.Führen Sie alle nachfolgenden Verfahren in einer BSC-Haube durch und beachten Sie aseptische Techniken, um die Sterilität sicherzustellen. Legen Sie den PDMS-Ring mit einer Pinzette in eine 6-Vertiefung. Verwenden Sie den externen Rand des PDMS-Rings, um den PDMS-Ring konzentrisch innerhalb der Vertiefung auszurichten.Beachten Sie, dass nur nicht mit Gewebekultur behandelte Brunnenplatten verwendet werden sollten. Legen Sie das Edelstahlmodul mit einer Pinzette auf den PDMS-Ring. Setzen Sie die Spitzen der internen Halteringzange in die Griffgriffe des Halterings ein.Drücken Sie den Halter zusammen, um den Durchmesser des Halterings zu reduzieren. Legen Sie es in die 6-Vertiefung, drücken Sie es fest auf das Edelstahlmodul und lassen Sie die Zange los, um den PDMS-Ring im Brunnen zu befestigen. Fügen Sie ein Mil von fünf Mikrogramm pro Mikroliter Fibronektin in die Mitte oder den Rand des Brunnens hinzu, abhängig von der Region des Interesses, durch die Öffnung des PDMS-Rings und des Edelstahlmoduls.Schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die Fibronektinlösung alle interessierende Region abdeckt. 30 Minuten bei 37 Grad in einem befeuchteten Inkubator unter 95% Luft und 5% CO2 inkubieren. Entfernen Sie die Fibronektinlösung aus dem Brunnen.Und jetzt zweimal mit PBS waschen. Sobald Sie fertig sind, entfernen Sie das PBS vollständig aus dem Brunnen. Entfernen Sie den Haltering, das Edelstahlmodul und den PDMS-Ring aus dem Bohrrohr.Fügen Sie 1,5 mil 1% Pluronic F-127 in die Vertiefung hinzu und inkubieren Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur, um die unbeschichtete Oberfläche zu passivieren. Entfernen Sie die Pluronic F-127-Lösung aus dem Brunnen und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Nach dem Waschen den beschichteten Brunnen sofort verwenden oder bei vier Grad bis zu zwei Wochen mit der Schicht PBS im beschichteten Brunnen lagern.Aussaat von Endothelzellen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und säen Sie 180.000 Zellen in eine beschichtete 6-Well-Platte in 1,5 mil vorwarmem Zellkulturmedium. Schütteln Sie die Brunnenplatte seitlich, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gleichmäßig im Brunnen verteilen.Lassen Sie es in einem 37 Grad befeuchteten Inkubator unter 95% Luft und 5% CO2 über Nacht. Scherspannungsanwendung mit einem Orbitalschüttler. Die Zellen sollten nach drei Tagen des Wachstums zusammenfließen.Ersetzen Sie das Medium durch 1,9 mil Vorwarn-Zellkulturmedium, um eine Höhe von zwei Millimetern zu erreichen. Legen Sie eine Brunnenplatte auf die Plattform eines Orbitalschüttlers in einem befeuchteten Inkubator und schwenken Sie sie drei Tage lang mit 150 U / min. Optional können nach zwei Tagen Scherung zytokine zum Zellkulturmedium hinzugefügt werden, um das Zusammenspiel zwischen Zytokinen und stresserm Stress zu untersuchen.Nach der Behandlung scheren Sie die Zellen für einen weiteren Tag. In dieser Studie wurde TNF-alpha verwendet, um die Zellen zu aktivieren. Führen Sie eine Analyse nach drei Tagen Scherspannungsanwendung durch.Mikroskopische Aufnahmen zeigen, dass Pluronic F-127 die HUVEC-Adhäsion in der Region ohne Fibronektinbeschichtung verhinderte. An dem Teil der Bohroberfläche, der vor der Passivierung von Pluronic F-127 nach 24 Stunden in Abbildung A und 72 Stunden (Abbildung C) des Wachstums nicht mit Fibronektin vorbehandelt worden war, wurden keine HUVECs angebracht. Ohne pluronic F-127-Passivierung wurden HUVECs 24 Stunden nach der Aussaat ohne Fibronektin an der Oberfläche befestigt und in Abbildung B um 72 Stunden weiter vermehrt.Der Maßstabsbalken entspricht 500 Mikrometern.Nuclear Red Fleck zeigt die Morphologie von gescherten HUVECs, A, in der Mitte und B, am Rand eines vollen Brunnens. Der Maßstabsbalken entspricht hundert Mikrometern. A und B zeigen auch Zellumrisse, die durch Immunfärbung von ZO-1 abgegrenzelt sind.Beachten Sie die Ausrichtung und Dehnung der Zellen am Rand, aber nicht in der Mitte. Es zeigt keinen signifikanten Unterschied im Kernformindex, was auf rundheit hinweist, zwischen HUVECs, die in Vollbohrungen gezüchtet wurden, und segmentierten Vertiefungen, die für unbehandelte oder TNF-alpha-behandelte HUVECs beobachtet wurden. Die Zellen waren in der Nähe des Brunnenrandes länglicher.Eine Tendenz zu einer größeren Dehnung bei TNF-alpha-behandelten HUVECs war an allen Standorten nicht durchgängig signifikant. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen vollen und segmentierten Vertiefungen in der Dichtezahl von A, unbehandelt, und B, TNF-alpha-behandelten HUVECs an verschiedenen radialen Stellen beobachtet. In beiden Fällen gab es mehr Zellen pro Flächeneinheit am Rand als in der Mitte des Brunnens.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene Methode es Ihnen ermöglicht, Zellen in nur einem Bereich des wirbelnden Brunnens oder eines kunststoffbasierten Zellkultursystems zu züchten. Das bedeutet, dass Zellen in einem Teil des Brunnens, der eine Art von Fluss erlebt, nicht durch Mediatoren beeinflusst werden, die von Zellen in einer anderen Region freigesetzt werden, die unterschiedliche Flüsse erfahren. Nicht nur das, wir können Zellen betrachten, die in einer Region mit oder ohne Zellen in anderen Regionen gezüchtet wurden.Damit lassen sich die Wirkungen solcher löslichen Mediatoren nachvollzeigt. Das Testen der Auswirkungen von konditioniertem Medium auf naive Zellen erlaubt dasselbe. Durch die Analyse des Zustandsmediums können die Mediatoren identifiziert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Diese Studie verwendet eine Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, deutlichen Erhöhung des Durchzellroll Studien unter physiologisch relevanten Scherströmung. Angesichts der Bedeutung der Zellvoll in der Mehrschrittzellen Homing Kaskade und die Bedeutung der Referenzzelle nach systemischer Abgabe exogener Populationen von Zellen in Patienten, bietet dieses System als Screening-Plattform zellbasierte Therapie verbessern Potential.

Systematische Analyse von In-vitro- Zellroll Mit einer Multi-Well-Platte mikrofluidischen System

Es ist bekannt, dass verschiedene Niveaus und Muster der Flüssigkeitsscherung die endotheliale Genexpression, den Phänotyp und die Anfälligkeit für Krankheiten modulieren. Wir diskutieren den Aufbau und die Verwendung von "Scherringen": ein Modell, das unidirektionale, periodische Schubspannungsmuster erzeugt. Scherringe sind einfach zu montieren, wirtschaftlich und können hohe Zellausbeuten erzeugen.

Die Montage und Anwendung der &quot;Shear Ringe &#39;: A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

Die Erhaltung der Blut-Hirn-Schranke Abdeckung ist der Schlüssel für die Homöostase des zentralen Nervensystems. Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die fundamentalen und pathologischen Prozesse abzugrenzen, die die Blut-Hirn-Schrankenabdeckung modulieren.

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von O-förmigen Schiffe, spezialisiert für Suspensionskulturen zellulären Aggregate mit orbital schütteln. Die HEK293 Zellen gewachsen in diese Tasche zu bilden mehr homogene Aggregate als die in herkömmlichen Kulturgefäße angebaut.

Orbital schütteln Kultur von Säugerzellen in O-förmigen Schiffe, einheitliche Aggregate zu produzieren

Das dreidimensionale Co-Kultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay-System wurde entwickelt, um die physiologische Angiogenese nachzuahmen. Co-Kultur-Sphäroide werden von zwei menschlichen Gefäßzellvorläufern, EFCCs und MSCs, gebildet und in Kollagengel eingebettet. Das neue System ist wirksam für die Bewertung angiogener Modulatoren und liefert relevantere Informationen für die in vivo-Studie.

Dreidimensionales Angiogenese-Assay-System mit Co-Culture-Spheroiden, die von endotheliaalen Koloniebildenden Zellen und mesenchymalen Stammzellen gebildet werden

Dieser Assay verwendet embryonale Stammzellen der Maus, die in Embryoidkörperchen differenziert sind, die in 3D-Kollagengel kultiviert werden, um die biologischen Prozesse zu analysieren, die die Keimangiogenese in vitro steuern. Die Technik kann zum Testen von Medikamenten, zur Modellierung von Krankheiten und zur Untersuchung spezifischer Gene im Zusammenhang mit embryonal tödlichen Deletionen eingesetzt werden.

In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

Hier wird ein einfacher Arbeitsablauf zur Unterscheidung von Endothelzellen von humanen pluripotenten Stammzellen beschrieben, gefolgt von einem detaillierten Protokoll für ihre mechanische Stimulation. Dies ermöglicht die Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie von Endothelzellen. Dieser Ansatz ist kompatibel mit nachgeschalteten Assays von lebenden Zellen, die nach mechanischer Stimulation aus dem Kulturchip entnommen wurden.

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

Wir stellen ein Protokoll für die Hochdurchsatzproduktion von Gefäßkanälen mit flexiblen Größen und gewünschten Mustern auf einer Standard-Sechs-Well-Platte unter Verwendung der 3D-Bioprinting-Technologie vor, die als Gefäße auf einer Platte (VOP) bezeichnet wird. Diese Plattform hat das Potenzial, die Entwicklung von Therapeutika für die mit einem kompromittierten Endothel verbundenen Erkrankungen voranzutreiben.

Hochdurchsatz-Bioprinting-Verfahren zur Modellierung der Gefäßpermeabilität in Standard-Sechs-Well-Platten mit Größen- und Musterflexibilität

Es besteht ein dringender Bedarf an 3D-Krebsmodellen, die heterozelluläre Wechselwirkungen erfassen, um Krebsmetastasen zu untersuchen. Unsere Studie stellt die Erzeugung von heteromultizellulären Stroma-Epithel-Epithelen in einer gerüstfreien und gerüstfreien Umgebung vor, die zur Untersuchung der Invasion und der zellulären räumlichen Verteilungen verwendet werden kann.

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.

On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung

Lernen Sie eine Beschichtungsmethode zur lokalisierten Endothelzellkultur in 6-Well-Platten auf einem Orbitalschüttler für mechanobiologische Scherstressstudien. Dieses Protokoll ermöglicht präzise Untersuchungen des Zellverhaltens unter definierten Flussbedingungen.

Segmentierung des Wachstums von Endothelzellen in 6-Well-Platten auf einem Orbitalschüttler für mechanobiologische Studien

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