Name: Eine einfache Trockenschnittmethode zum Erhalt von Vollkornharzund und ihren Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie eine einfache Trockenschnittmethode zur Präparation ganzer Samen in LR White-Harz für die Untersuchung von Zellen, Stärkekörnern und Proteinbodies in Maiskörnern. Diese Technik ermöglicht präzise morphologische Analysen.

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Die Finanzierung wurde von der National Natural Science Foundation of China (32071927), dem TalentProjekt der Yangzhou University und dem Priority Academic Program Development der Jiangsu Higher Education Institutions bereitgestellt.

1. Herstellung von harzeingebettetem Saatgut (Abbildung 1)
<ol><li>Fix sechs Mais reife Kerne in 10 ml von 2,5% Phosphat-gepuffertem Glutaraldehyd (0,1 M, pH7,2) bei 4 °C für 48 h. Die Forscher können andere fixative Mischungen, fixative Konzentrationen und Fixierungsbedingungen nach ihren Forschungszielen und Gewebetypen wählen.</li>
	<li>Nehmen Sie die Kerne heraus und schneiden Sie sie längs oder quer auf 2-3 mm Dicke mit einer scharfen doppelseitigen Klinge, und fixieren Sie sie in 10 ml von 2,5% phosphatgepuffertem Glutaraldehyd (0,1 M, pH 7,2) wieder für 48 h.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben dreimal mit 10 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) jeweils 30 min lang.</li>
	<li>Dehydrieren Sie die Proben in zunehmenden Qualitäten von ethanolwäriger Lösung (10 ml) von 30% bis 50%, 70%, 90% einmal und 100% dreimal für 30 min jedes Mal.</li>
	<li>Infiltrieren Sie die Proben in 10 ml erhöhenden Qualitäten der LR White Harzlösung, die mit Ethanol von 25% auf 50%, 75% einmal verdünnt wird, und 100% zweimal bei 4 °C für 12 h jedes Mal.</li>
	<li>Bereiten Sie die Sockel für Proben vor dem Einbetten vor. 0,25 ml 100% LR Weißharz in ein 2-ml-Zentrifugenrohr geben und bei 60 °C für 48 h polymerisieren.</li>
	<li>Nacheinander das reine LR White Harz (0,5 ml) und die infiltrierte Probe in das Zentrifugenrohr mit einem Sockel geben. Richten Sie die Proben mit der anatomischen Nadel aus und polymerisieren Sie sie bei 60 °C im Ofen für 48 h.</li>
</ol>2. Trockenschnitt zur Vorbereitung eines Abschnitts in voller Saatgröße (Abbildung 1)
<ol><li>Nehmen Sie die eingebetteten Kerne aus dem Zentrifugenrohr heraus und schneiden Sie das überschüssige Harz um die Probe mit einer scharfen Klinge aus.</li>
	<li>Klemmen Sie den Harzblock im Probenhalter von Ultramikrotom (EM UC7), und schneiden Sie das überflüssige Harz auf der Oberfläche der Probe und um die Probe herum mit einer Klinge ab.</li>
	<li>Die Oberfläche der Probe fein mit einem Glasmesser polieren, bis ein vollständiger Abschnitt gebildet werden kann.</li>
	<li>Legen Sie vor dem Schneiden einen kleinen Kupferhaken etwa 2 mm über der Klingenkante und schneiden Sie die Probe in einen 2 m Abschnitt. Die Rolle des Hakens ist es, das Curling nach oben des Abschnitts zu vermeiden.</li>
	<li>Setzen Sie den Haken unter den Abschnitt, um ihn zu unterstützen, wenn der Abschnitt lang wird.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l Wasser auf einer unvorbehandelten Rutsche hinzu und übertragen Sie den kompletten und ungebrochenen Abschnitt vorsichtig mit der Pinzette ins Wasser.</li>
	<li>Um den faltigen Abschnitt zu glätten, die Probe auf dem Abflachungstisch bei 50 °C über Nacht erhitzen und trocknen.<ol>
<li>Wenn der Abschnitt bröckelt oder reißt, verlängern Sie die Zeit für jede Harzinfiltration der Probe von 12 h auf 24 h oder 48 h.</li>
		<li>Wenn der Abschnitt einige Linien parallel zum Messer hat, klemmen Sie den Probenblock fest. Wenn der Abschnitt einige Linien vertikal zum Messer hat, verwenden Sie bitte ein neues Messer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Färbung und Beobachtung des Abschnitts
HINWEIS: Um die Gewebestruktur und Morphologie von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern zu beobachten, färben Sie die Abschnitte entsprechend dem Forschungszweck mit spezifischen Flecken. Hier verwenden wir den fluoreszierenden Aufheller 28, Jodlösung und Coomassie brillant blau R250, um die Zellwände, Stärkegranulate bzw. Proteinkörper zu färben.
<ol><li>Zur Beobachtung der Morphologie der Zellen den Abschnitt mit 40 ml 0,1% (w/v) fluoreszierender Aufheller 28 wässrige Lösung in einem 70 ml kompakten Glas-Färbeglas glas bei 45 °C für 10 min färben, und dann mit fließendem Wasser für 5 min abspülen. Beobachten und fotografieren Sie den Abschnitt unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist.</li>
	<li>Zur Beobachtung der Morphologie von Stärkegranulat den Abschnitt mit 40 l Jodlösung (0,07% (w/v) I2 und 0,14% (w/v) KI in 25% (v/v) Glycerin) 1 min färben und die Mitprobe, die Jodlösung enthält, mit einem Deckzettel bedecken. Sehen und fotografieren Sie die Probe unter einem Lichtmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist.</li>
	<li>Zur Beobachtung der Morphologie von Proteinkörpern Tauchen Sie den Abschnitt mit 40 ml 10% (v/v) Essigsäure in ein 70 ml kompaktes Glas-Färbeglasglas für 10 min bei 45 °C ein und färben Sie ihn dann in 40 ml von 1% (w/v) Coomassie brilliant blue R250 in 25% (v/v) Isopropanol und 10% (v/v) Essigsäure für 15 min bei 45 °C. Die gebeizten Abschnitte mit fließendem Wasser 5 min waschen und trocknen. Beobachten und fotografieren Sie den Abschnitt unter einem Lichtmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist.</li>
</ol>4. Quantitative Analyse von Morphologieparametern
<ol><li>Prozess und quantitativ analysieren die fotografierten Bilder für Fläche, Lang-/Kurzachse und Rundheit von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen mit Morphologie-Analysesoftware (Image-Pro Plus 6.0 Software) nach den Verfahren von Zhao et al.9 genau.</li>
</ol>

<ol><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+structure+and+spatial+distribution+in+endosperm+of+high-amylose+rice+starch+granules+with+different+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+defective+effect+of+starch+branching+enzyme+IIb+from+weak+to+strong+induces+the+formation+of+biphasic+starch+granules+in+amylose-extender+maize+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm.</a> Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradually+decreasing+starch+branching+enzyme+expression+is+responsible+for+the+formation+of+heterogeneous+starch+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules.</a> Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dek35+encodes+a+PPR+protein+that+affects+cis-splicing+of+mitochondrial+nad4+intron+1+and+seed+development+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize.</a> Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).</li>
<li>Hu, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+structure+characteristics+to+form+ultrahigh+oil+content+in+rapeseed%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed.</a> PLoS One. 8 (4), 62099(2013).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+VKS1+regulates+mitosis+and+cytokinesis+during+early+endosperm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development.</a> Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).</li>
<li>Xu, A., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+comparison+and+applications+of+different+sections+in+investigating+the+microstructure+and+histochemistry+of+cereal+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels.</a> Plant Methods. 16, 8(2020).</li>
<li>Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+whole+sections+of+mature+cereal+seeds+to+visualize+the+morphology+of+endosperm+cell+and+starch+and+the+distribution+of+storage+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein.</a> Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).</li>
<li>Zhao, L., Cai, C., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+processing+method+for+investigating+the+morphology+of+cereal+endosperm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells.</a> Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).</li>
<li>Borisjuk, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+architecture+shapes+embryo+metabolism+in+oilseed+rape%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).</li>
<li>Lott, J. N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+bodies+in+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Nordic+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Protein bodies in seeds.</a> Nordic Journal of Botany. 1, 421-432 (1981).</li>
<li>Jing, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+endosperm+cells+and+starch+granules+in+common+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Development of endosperm cells and starch granules in common wheat.</a> Cereal Research Communications. 42 (3), 514-524 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Samen sind die wichtigste erneuerbare Ressource für Lebensmittel, Futter und industrielle Rohstoffe und sind reich an Lagermaterialien wie Stärke und Protein. Die Morphologie und Quantität der Zellen sowie der Inhalt und die Konfiguration der Lagermaterialien beeinflussen das Gewicht und die Qualität der Samen7,12. Obwohl die Stereologie- und Bildanalysetechnologie die Größe und Quantität der Zellen in einer Geweberegion messen kann, fehlen sie in vielen Labo...

Pflanzensamen enthalten Lagermaterialien wie Stärke und Protein und liefern Energie und Nahrung für die Menschen. Form, Größe und Menge der Zell- und Lagermaterialien bestimmen das Gewicht und die Qualität des Saatguts. Die Zellen und Speichermaterialien in verschiedenen Samenregionen haben signifikant unterschiedliche Morphologien, insbesondere für einige hochamylose Getreidepflanzen mit Hemmung des Stärkeverzweigungsenzyms IIb1,2,3. Daher ist es sehr wichtig, die Morphologien von Zellen und Lagermaterialien in verschiedenen Samenregionen zu untersuchen.
Paraffinschnitt ist eine gute Methode, um den ganzwertigen Abschnitt vorzubereiten und kann die Gewebestruktur des Saatguts und die Ansammlung von Lagermaterial in verschiedenen Regionen des Saatguts4,5,6aufweisen. Die Paraffinabschnitte haben jedoch in der Regel eine Dicke von 6-8 m mit geringer Auflösung; Daher ist es sehr schwierig, die Morphologie von Zell- und Speichermaterialien klar zu beobachten und quantitativ zu analysieren. Die Harzprofile haben in der Regel eine Dicke von 1-2 m und eine hohe Auflösung und eignen sich sehr gut, um die Morphologie von Zell- und Lagermaterialien zu beobachten und zu analysieren7. Die routinemäßige Harzschnittmethode hat jedoch Schwierigkeiten bei der Vorbereitung des Abschnitts in voller Saatgröße, insbesondere für Samen mit einem großen Volumen und hohem Stärkegehalt; somit gibt es keine Möglichkeit, die Morphologie von Zellen und Lagermaterialien in verschiedenen Bereichen des Saatguts zu beobachten und zu analysieren. LR White Harz ist ein Acrylharz und weist eine geringe Viskosität und starke Durchlässigkeit auf, was zu seinen guten Anwendungen bei der Herstellung des Harzabschnitts von Samen führt, insbesondere für Getreidereife Kerne mit großem Volumen und hohem Stärkegehalt. Darüber hinaus kann die in LR White Resin eingebettete Probe leicht mit vielen chemischen Farbstoffen gefärbt werden, um die Morphologie von Zellen und Speichermaterialien unter Licht- oder Fluoreszenzmikroskop deutlich zu zeigen7. In unserem vorherigen Papier haben wir über eine Trockenschnittmethode zur Herstellung der in LR White Harz eingebetteten Abschnitte von reifen Getreidekernen berichtet. Die Methode kann auch den vollwertigen Abschnitt des entwickelnden, gekeimten und gekochten Getreidekerns8vorbereiten. Der erhaltene Abschnitt im Ganzensaathat hat viele Anwendungen in der Mikromorphologiebeobachtung und -analyse, insbesondere zur übersichtlichen Betrachtung und quantitativen Analyse der morphologischen Unterschiede von Zell- und Speichermaterialien in verschiedenen Samenregionen8,9.
Diese Technik eignet sich für Forscher, die die Mikrostruktur des Gewebes und die Form und Größe von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen mit Hilfe des Lichtmikroskops beobachten möchten. Die Bilder von Abschnitten in Vollkorngröße, die speziell für die Ausstellung von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern gebeizt wurden, können mit einer Morphologie-Analysesoftware analysiert werden, um die morphologischen Parameter von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen quantitativ zu messen. Um die technische Anwendbarkeit und die Anwendung von Ganzsaat-Abschnitten zu demonstrieren, haben wir in dieser Studie die reifen Samen von Mais und Ölraps sowie die sich entwickelnden, gekeimten und gekochten Reiskerne untersucht. Das Protokoll enthält vier Prozesse. Hier verwenden wir reifen Maiskern, der aufgrund des großen Volumens und des hohen Stärkegehalts am schwierigsten bei der Vorbereitung der ganzaatigen Abschnitte ist, als Beispiel, um die Prozesse Schritt für Schritt auszustellen.

<table><tbody><tr><td>Essigsäure</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A501931</tr><tr><td>Kompaktes Glasfärbeglas (5 Plätze)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E678013</tr><tr><td>Coomassie brillantblau R-250</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A100472</tr><tr><td>Deckglas</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>F518211</tr><tr><td>Doppelseitige Klinge</td><td>Gillette Shanghai Co., Ltd.</td><td>74-S</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A500737</tr><tr><td>Plantisch</td><td>Leica</td><td>HI1220</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX60</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzaufheller 28</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>910090</td><td></td></tr><tr><td>Glasstreifen</td><td>Leica</td><td>840031</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd 50%ige Lösung in Wasser</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A600875</tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A600232</tr><tr><td>Iod</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A500538</tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A507048</tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>LR Weißes Harz</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1281A</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co., Ltd.</td><td>9023A</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumiodid</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A100512</tr><tr><td>Slide</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>F518101</tr><tr><td>Pinzette</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>F519022</tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Dodecahydrat</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A607793</tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Dihydrat</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A502805</tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr></tbody></table>

eine einfache trockenschnittmethode zum erhalt von vollkornharzund und ihren anwendungen

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

Die Morphologie, Größe und Quantität der Zellen, Stärkegranulate und Proteinkörper im Saatgut bestimmen das Gewicht und die Qualität des Saatguts. Sie unterscheiden sich zwischen den verschiedenen Saatgutregionen erheblich. Um die Morphologien von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern klar zu betrachten und ihre Morphologieparameter quantitativ genau zu analysieren, wird der Abschnitt in vollwertiger Größe benötigt. Obwohl die Paraffin-Sektion in vollsamen Größe die Ansammlung von Lagermaterialien in Samen untersuchen kann, ist es aufgrund der geringen Auflösung des dicken Abschnitts sehr schwierig, die morphologischen Parameter von Zellen und Speichermaterialien quantitativ zu analysieren. Der dünne Harzabschnitt hat eine hohe Auflösung, aber die routinemäßige Harzschnittmethode ist nicht geeignet, den vollwertigen Abschnitt aus reifen Samen mit einem großen Volumen und hohem Stärkegehalt vorzubereiten. In dieser Studie stellen wir eine einfache Trockenschnittmethode zur Vorbereitung des gesamten Harzabschnitts vor. Die Technik kann die kreuz- und längsförmigen Ganzkernabschnitte von sich entwickelnden, reifen, gekeimten und gekochten Samen, die in LR White Harz eingebettet sind, auch für große Samen mit hohem Stärkegehalt vorbereiten. Der ganzaggroße Abschnitt kann mit fluoreszierendem Aufheller 28, Jod und Coomassie brillantblaur R250 gefärbt werden, um speziell die Morphologie von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern deutlich zu zeigen. Das erhaltene Bild kann auch quantitativ analysiert werden, um die morphologischen Parameter von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen zu zeigen.

Einfache Trockenschnittmethode zur Gewinnung eines Ganzaatschnitts Wir etablieren ein einfaches Trockenschnittverfahren zur Herstellung eines in LR-Weißharz eingebetteten Samenabschnitts in voller Saatgröße (Abbildung 1). Das Verfahren kann transversale und längsförmige Vollsaatschnitte mit einer Dicke von 2 m vorbereiten(Abbildung 2-5, Ergänzende Abbildung 1-4). Zum Beispiel kann der ausgereifte...

Diese Technik ermöglicht die schnelle und einfache Herstellung von Vollkornharzabschnitten für die Beobachtung und Analyse von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Bereichen des Saatguts.

Eine einfache Trockenschnittmethode zum Erhalt von Vollkornharzund und ihren Anwendungen

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Die Morphologiewissenschaft und die Qualität von Zellen, Stärkegranulaten und den Proteinkörpern im Kern bestimmen das Gewicht und die Qualität des Saatguts. In dieser Studie stellen wir als einfache Population eines ganzen Kerns dar, der in LR White Resin eingebettet ist, und etablieren eine einfache Trockensaugmethode für ganze Kerne. Wir wählen LR White Resin als eingebettetes Medium aus zwei Hauptgründen.Erstens ist es eine niedrige Viskosität und starke Durchlässigkeit, was zu seinen guten Anwendungen bei der Vorbereitung dieser mächtigen Samenabschnitte führt, insbesondere für Getreidereife Kerne mit einem großen Volumen und hohem Stärkegehalt. Zweitens kann die in LR White Resin eingebettete Probe leicht mit vielen chemischen Farbstoffen gefärbt werden, um die Morphologie von Proben unter Licht mit Fluoreszenzmikroskop deutlich zu zeigen. Die vorbereiteten Abschnitte können speziell gefärbt werden, um die Zellen, Stärkegranulate und Proteinkörper deutlich in der Entstehung eines ganzen Kerns auszustellen, und die Morphologieparameter können auch quantitativ analysiert werden.Die Methode enthält Studien. Hier verwenden wir ausgereifte Maiskerne mit größerem Volumen und hohem Stärkegehalt als Beispiel, um die Prozesse Schritt für Schritt auszustellen. Zunächst werden Die Kerne in eine einfache Flasche gesteckt.Fügen Sie etwa 10 Millimeter von 2,5%Phosphat-gepuffertes Glutaraldehyd hinzu. einen weiteren pH 7,2 und legen Sie es bei 4 Grad Celsius für 48 Stunden, um sie beide zu beheben. Nehmen Sie dann diese Kerne heraus und schneiden Sie sie längs oder quer, mit zwei bis drei Millimetern Dicke.Sie benötigen eine scharfe doppelseitige Klinge. Und fixieren Sie sie für weitere 48 Stunden. Als nächstes waschen Sie Ihre Proben dreimal mit etwa 10 Millimetern, also 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2 für 30 Minuten jedes Mal.Um die Proben Schritt für Schritt zu hydratisieren, tränken Sie sie zunächst in etwa 10 Millimeter 30% 30 Minuten wässrige Lösung für 30 Minuten und sukzessive in 10 Millimeter einweichen, also 50%70%90% einmal und 100% dreimal. Um eine Probe Schritt für Schritt zu infiltrieren, holen Sie sie sukzessive mit 10 Millimetern LR White HarzLösung mit Ethanol von 25%50%75% einmal verdünnt, und 100%zweimal bei vier Grad Celsius für 12 Stunden jedes Mal. Vor der Einbettung müssen wir die Sockel für Proben vorbereiten.250 Mikroliter reines LR-Weißharz in zwei Millimeter Zentrifugenrohr geben und 48 Stunden lang bei sechs Grad Celsius polymerisieren. Als nächstes sukzessive 500 Mikroliter reines LR-Weißharz hinzufügen und die Probe mit einem Sockel in das Zentrifugenrohr infiltrieren. Nach dem Richten der Proben mit anatomischer Nadel, legen Sie das Harz bei sechs Grad Celsius in einen Ofen für 48 Stunden.Nehmen Sie diese eingebetteten Kerne aus dem Zentrifugenrohr und schneiden Sie überschüssiges Harz um eine Probe mit einer scharfen Klinge aus. Legen Sie den Harzblock in den Probenhalter von Mikroton und schneiden Sie das überflüssige Harz auf der Oberfläche der Probe und um die Probe mit der Klinge ab. Die Oberfläche der Probe schließlich mit einem Glasmesser weiter polieren, bis ein vollständiger Abschnitt gebildet werden kann.Jetzt ist es Zeit, diesen erstaunlichen Abschnitt mit zwei Mikrometern Dicke vorzubereiten. Vor dem Schneiden, legte ein kleines Kupfer sprach etwa zwei Millimeter über klingenden Rand, um zu verhindern, dass ein Abschnitt krümmt. Wie der Abschnitt ländiert, setzen Sie eine Rede unter den Abschnitt, um es zu unterstützen.Als nächstes fügen Sie die 100 Mikroliter Wasser auf der unausstehenden Rutsche hinzu und übertragen Sie den kompletten und ungebrochenen Abschnitt vorsichtig mit den Bewirten ins Wasser. Erhitzen und trocknen Sie sie bei 50 Grad Celsius, um den faltigen Abschnitt zu glätten. Schließlich brauchen zwei wichtige Tipps Aufmerksamkeit.Erstens, wenn der Abschnitt bröckelt oder reißt, verlängern Sie die Zeit für jede Harzinfiltration der Probe. Zweitens, wenn der Abschnitt einige Linien parallel zum Messer hat, klemmen Sie den Probenblock fest. Wenn der Abschnitt einige Linien vertikal zum Messer hat, verwenden Sie bitte ein neues Messer.Um die Morphologie von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern zu beobachten, können wir die Abschnitte mit fluoreszierendem Aufheller 28, Jodlösung und Coomassie brillant blau R250 beflecken. Für andere spezifische Flecken, stützen Sie sich auf den Vorschlag Forschung. Hier verwenden wir Jodlösung, um Stärkegranulat als Beispiel zu färben.Fügen Sie 40 Mikroliter Jodlösung hinzu, um den Abschnitt einzutauchen. Und halten Sie es im Glas für eine Minute. Und dann die Probe mit einer Deckhülse bedecken.Und die überschüssige Agentenlösung um sie herum ausräumen. Beobachten und fotografieren Sie die Probe sofort unter einem beleuchteten Mikroskop, das mit einer CCTV-Kamera ausgestattet ist. Wir können die fotografierten Bilder für Flächen, langen oder kurzen Zugriff und Rundheit von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Regionen für den Kernel mit Morphologie-Analysesoftware verarbeiten und quantitativ analysieren.Wir etablieren eine einfache Trockenschnittmethode zur Aufbewahrung ganzer Kernabschnitte in LR White Resin. Die Methode kann Quer- und Längsabschnitte des gesamten Kerns mit zwei Mikrometern vorbereiten. oder Beispiele, kann der reife ganze Samen von Ölraps quer und längs geschnitten werden.Auch die Abschnitte eines ausgereiften ganzen Maiskerns mit größerem Volumen können erfolgreich vorbereitet werden. Darüber hinaus können der sich entwickelnde Kern, der gekochte Kern und der gekeimte Kern auch mit der Methode untersucht werden. Die vorbereiteten Abschnitte ganzer Kernel haben die folgenden Anwendungen.Zunächst können die Abschnitte des gesamten Kerns verwendet werden, um die Gewebestruktur von Samen zu beobachten. Zum Beispiel können die Abschnitte des ganzen Embryos von Ölraps, der mit Safranin gefärbt ist, deutlich zeigen, dass es sich um einen radikalen, hyperlässigen, inneren und äußeren Teil des ganzen Kerns handelt, der verwendet werden kann, um die Morphologie von Zellen zu beobachten und zu analysieren. Zum Beispiel sind die transversalen Abschnitte des ganzen Embryos von Ölraps mit fluoreszierendem Aufheller 28 gefärbt, und die Zellöle sind spezifisch gefärbt.Die Mikromorphologie von Zellen in allen Regionen des gesamten Embryos kann mit hoher Vergrößerung dargestellt werden. Die morphologischen Parameter von parenchymalen Zellen können mit Hilfe einer Morphologie-Analysesoftware quantitativ analysiert werden und zeigen einige Unterschiede in verschiedenen Regionen von Embryonen auf. Die transversalen Abschnitte des ganzen Maiskerns, der mit fluoreszierendem Aufheller 28 befleckt ist, können auch als Morphologie von Zellen aufweisen, und die morphologischen Parameter der Zellen sind in verschiedenen Regionen von Endosperm unterschiedlich.Abschnitte des ganzen Kerns können mit Jodlösung gefärbt werden, um ihre Morphologie von Stärkegranulaten zu zeigen, zum Beispiel können die transversalen und die Längsschnitte von mit Jod befleckten Maiskernen ihre Morphologie von Stärkegranulat deutlich aufweisen. Das Stärkegranulat in verschiedenen Regionen zeigt signifikant unterschiedliche Morphologie, Größe und Menge in Endospermzellen. Die quantitative Analyse morphologischer Parameter von Stärkegranulat zeigt, dass sie in verschiedenen Regionen für Endosperm signifikant unterschiedlich sind.Die Abschnitte können verwendet werden, um die Morphologie von Proteinkörpern zu beobachten und zu analysieren. Zum Beispiel ist das Stärkeprotein blau mit Coomassie brillant blau R250 gefärbt. Die räumliche Verteilung des Stärkeproteins im gesamten Embryo von Ölraps kann bei einer geringen Vergrößerung beobachtet werden, und die Mikrostruktur kann bei hoher Vergrößerung deutlich gezeigt werden.Darüber hinaus können auch der Zahlenfehlerindex und die Morphologieparameter von Proteinkörpern in ausgewählten Regionen quantitativ analysiert werden. Diese Technik ermöglicht die erste und einfache Herstellung von Harzabschnitten ganzer Kerne aus der Entwicklung und Reife von Samen. Die Abschnittsanwendungen in der Gewebestruktur des ganzen Kerns und dann die Untersuchung der Morphologie von Zellen, Stärkegranulat, und die Proteinkörper in verschiedenen Regionen eines ganzen Kerns.Die aufgenommenen Bilder können quantitativ analysiert werden, um die morphologischen Parameter von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern zu zeigen und sie in verschiedenen Regionen des gesamten Kerns weiter zu vergleichen.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

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Diese Studie bietet zuverlässige und einfache Verfahren zur Erlangung von ultradünnen Schnittserien eines Mikroorganismus ohne teure Ausrüstung im Transmissions-Elektronenmikroskopie.

Eine Methode für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen im Transmissions-Elektronenmikroskopie

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Verbesserung der Paraffin-Schnitt. Diese Methode verbindet schneiden und schweben mit einer einfachen thermostatischen Kammer, um den Transfer-Prozess erforderlich, nach der herkömmlichen Methode zu vermeiden. Infolgedessen wurden die Effizienz und die Anzahl der intakten Paraffin Abschnitte erheblich verbessert.

Das Schneiden und schwimmende Methode für Paraffin-eingebetteten Gewebe für Schneiden

Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung von Querschnitten von Getreidesamen (z. B. Reis) zur Analyse der Endosperm- und Stärkegranulatmorphologie mittels Rasterelektronenmikroskopie.

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, detaillierte Verfahren zum Sammeln, Fixieren und Pflegen mykoheterotropher Pflanzenproben bereitzustellen, wobei verschiedene Mikroskopietechniken wie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie, Licht-, Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie angewendet werden, um die Pilzbesiedlung in Pflanzengeweben und Samen zu untersuchen, die mit Mykorrhizapilzen gekeimt sind.

Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Die Beurteilung der anatomischen Unterschiede zwischen den Blattquerschnitten von C3 undC 4 hilft dabei, die Effizienz der Photosynthese zu verstehen. In dieser Arbeit werden die freihändige und halbdünne Blattquerschnittspräparation und -untersuchung sowie die Vorbehalte bei der Präparation für die Kulturarten Triticum aestivum und Zea mays beschrieben.

Bewertung der strukturellen Merkmale in Triticum aestivum und Zea mays für die photosynthetische Differenzierung von C3 und C4 mittels Freihand- und Halbdünnschliffen

Lernen Sie eine einfache Trockenschnittmethode zur Präparation ganzer Samen in LR White-Harz für die Untersuchung von Zellen, Stärkekörnern und Proteinbodies in Maiskörnern. Diese Technik ermöglicht präzise morphologische Analysen.

Eine einfache Trockenschnittmethode zum Erhalt von Vollkornharzund und ihren Anwendungen

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