Warum wird die Knockout-Effizienz von CD19 mittels Durchflusszytometrie gemessen?

Die Durchflusszytometrie quantifiziert CD19-negative Zellpopulationen, um die Funktionsverlust-bedingte Editierung zu validieren, wobei in Knockout-Proben eine 95 %ige Reduktion beobachtet wurde. Dies liefert einen direkten, quantitativen Nachweis von proteinbasierten Veränderungen nach der CRISPR/Cas9-Editierung. Die Methode ermöglicht den Vergleich zwischen Kontroll- und editierten Populationen, um die gezielte Wirkung zu bestätigen.

Wie beeinflusst die Multiplizität der Infektion mit rAAV6 die Integration des Transgens?

Um eine effiziente Transgenübertragung in elektroporierte B-Zellen zu erreichen, wurde eine Infektionsmultiplizität von 500.000 rAAV6-Vektorpartikeln verwendet. Diese hohe MOI fördert einen robusten Knock-in, was unter kombinierten CRISPR/Cas9- und rAAV6-Bedingungen zu 64 % EGFP-positiven Zellen führt. Die Methode ermöglicht eine stabile Transgenexpression zur therapeutischen Proteingewinnung.

Welche genomischen Sequenzierungsresultate bestätigen die CRISPR/Cas9-Bearbeitung?

Genomische Sequenzier-Chromatogramme zeigen Doppelpeaks an der CD19-Locusregion, was auf Insertionen oder Deletionen nach Doppelstrangbrüchen hinweist. Die Indel-Analyse bestätigt hohe Mutationsraten, die mit dem durch Durchflusszytometrie nachgewiesenen Proteinverlust korrelieren. Diese Ergebnisse liefern eine molekulare Bestätigung der Effizienz und Spezifität der Genom-Editierung.

Warum wird die Junction-PCR bei der Überprüfung von Knock-ins verwendet?

Die Junction-PCR amplifiziert ein 1,5 kb großes Amplikon nur dann, wenn eine erfolgreiche Transgenintegration mittels homologer Rekombination erfolgt ist. Bei Kontroll- oder Vektor-allein-Proben wird kein Produkt beobachtet, was die Spezifität des Knock-in-Ereignisses bestätigt. Dieser Test unterscheidet zufällige Integrationen von präzisen, standortspezifischen Kassetteninsertionen.

Wie beeinflussen die Kinetik der Wiederherstellung die Fertigungszeitpläne?

Obwohl die Genveränderung anfänglich die Zellrückgewinnung beeinflusst, erholen sich alle Proben innerhalb von drei Tagen nach der Transfektion. Diese schnelle Erholung unterstützt die Skalierung der Herstellung und reduziert Stillstandszeiten in therapeutischen Produktionsabläufen. Die Widerstandsfähigkeit der veränderten B-Zellen ermöglicht eine gleichmäßige Expansion für nachgeschaltete Anwendungen.

Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen mit CRISPR/Cas9

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08:20 Min.

3. November 2020

10.3791/61855-v

3. November 2020

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Kanut Laoharawee¹^,²^,³ , Matthew J. Johnson¹^,²^,³ , Walker S. Lahr¹^,²^,³ , Joseph J. Peterson¹^,²^,³ , Beau R. Webber¹^,²^,³ , Branden S. Moriarity¹^,²^,³

¹Department of Pediatrics, University of Minnesota, ²Center for Genomic Engineering, University of Minnesota, ³Masonic Cancer Center, University of Minnesota

Hier stellen wir ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die CRISPR/Cas9-basierte Genom-Engineering von primären menschlichen B-Zellen für Gen Knockout (KO) und Knock-in (KI) zur Untersuchung der biologischen Funktionen von Genen in B-Zellen und der Entwicklung von B-Zell-Therapeutika zur Verfügung.