Ein DNA/Ki67-basierter Durchflusszytometrie-Assay zur Zellzyklusanalyse von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen bei geimpften Mäusen
5. Januar 2021
Die klonale Expansion ist ein Schlüsselmerkmal der antigenspezifischen T-Zell-Antwort. Der Zellzyklus von Antigen-reagierenden T-Zellen wurde jedoch schlecht untersucht, teilweise aufgrund technischer Einschränkungen. Wir beschreiben eine durchflusszytometrische Methode zur Analyse klonal expandierender Antigen-spezifischer CD8-T-Zellen in Milz und Lymphknoten geimpfter Mäuse.
Unser Protokoll bietet einen praktischen Ansatz, mit dem Milz und Lymphknoten der Maus verwendet werden können, um die Dynamik der T-Zell-Antwort stärker widerzuspiegeln als eine phänotypische Momentaufnahme im stationären Zustand. Unsere Technik detektiert empfindlich antigenspezifische CD8-T-Zellen, die an einer laufenden Reaktion beteiligt sind. Proliferierende CD8-T-Zellen werden ohne die möglicherweise verwirrenden Wirkungen einer In-vivo-Medikamentbehandlung oder eines Zelltransfers gemessen.
Unsere Technik kann in verschiedenen Situationen ein Fenster in der Immundynamik bieten. Zum Beispiel in Bezug auf das Ansprechen auf Impfungen und Infektionen, Autoimmunerkrankungen und Krebsimmuntherapie. Bereiten Sie frischen 1x Permeabilisierungswaschpuffer vor, indem Sie 10x Permeabilisierungspuffer mit destilliertem Wasser verdünnen und durch einen 0,45 Mikrometer Filter filtern, um Aggregate zu entfernen.
Verdünnter monoklonaler Antikörper Ki67 FITC in 1x Permeabilisierungs-Waschpuffer, bestimmt mit einem Titrationsexperiment für ein Endvolumen von 100 Mikrolitern pro Probe. 3 Milliliter des 1x Permeabilisierungs-Waschpuffers in jedes Röhrchen mit Zellen geben und bei 400 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
Fügen Sie erneut den 1x Permeabilisierungs-Waschpuffer hinzu und zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren. Verwerfen Sie dann den Überstand. 100 Mikroliter des verdünnten monoklonalen Antikörpers Ki67 FITC in das Pellet geben, dann wirbeln und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren.
Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal mit 4 Millilitern 1x Permeabilisierungspuffer, zentrifugieren Sie nach jeder Wäsche und verwerfen Sie den Überstand. Geben Sie 350 Mikroliter PBS in das Zellpellet für Proben, die direkt am Durchflusszytometer entnommen werden sollen, und 250 Mikroliter PBS in das Zellpellet für Proben, die mit Hoechst für die DNA-Färbung inkubiert werden sollen. Hoechst- und PBS-Lösung vorbereiten und zu jeder Probe geben, so dass die Endkonzentration zwei Mikrogramm pro Milliliter beträgt.
Wirbeln und inkubieren Sie die Proben für 15 Minuten im Dunkeln. Dann zentrifugieren Sie die Proben für fünf Minuten und geben Sie 350 Mikroliter PBS in das Zellpellet. Öffnen Sie die Software und erstellen Sie verschiedene Gruppen, die den verschiedenen zu analysierenden Organen entsprechen, indem Sie im Menübandbereich des Arbeitsbereichs auf "Gruppe erstellen" klicken.
Öffnen Sie das geänderte Gruppenfenster durch Doppelklick auf den Gruppennamen und synchronisieren Sie die neu erstellten Gruppen, indem Sie ein Häkchen an der Funktion synchronisiert setzen. Ziehen Sie jede FCS-Datei in die entsprechende Gruppe und erstellen Sie dann eine Gating-Strategie, beginnend mit der a-LN-Gruppe. Öffnen Sie das Diagrammfenster, indem Sie auf die vollständig gebeizte Probe doppelklicken, um die für die Stichprobe erfassten ungefüllten Ereignisse in einem Punktdiagramm anzuzeigen.
Beachten Sie, dass die x- und y-Achse wie in den FCS-Dateien beschriftet sind, wie in Tabelle zwei der Durchflusszytometer-Einstellungsdatei dieses Manuskripts angegeben. Überprüfen Sie, ob eine ausreichende Anzahl von Ereignissen angezeigt wird, um eine geeignete Visualisierung zu ermöglichen. Öffnen Sie ggf. die Voreinstellungen, indem Sie auf das Herzsymbol im Arbeitsbereichsmenüband klicken, "Diagramme" und dann "Punktdiagramm" als Diagrammtyp auswählen und überprüfen Sie, ob die Anzahl der im entsprechenden Feld gezeichneten Punkte korrekt ist, oder ändern Sie sie.
Zeigen Sie die uneinheitlichen Ereignisse im Diagrammfenster in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und DNA-W auf der y-Achse an. Verwenden Sie lineare Skalierung für beide Achsen. Ändern Sie bei Bedarf die Skalierung von logarithmisch zu linear, indem Sie auf das mit einem T gekennzeichnete Kästchen in der Nähe jeder Achse im Diagrammfenster klicken.
Wählen Sie eine einzelne Zellpopulation aus, indem Sie im Gating-Werkzeugabschnitt auf rechteck klicken und dann in die Mitte des rechteckigen Tors doppelklicken, um einzelne Zellen in einem Punktdiagramm mit FSC-A-Parameter auf der x-Achse und totem Zellchip auf der y-Achse anzuzeigen. Klicken Sie auf das Polygon, um die lebende Zellpopulation auszuwählen, die negativ für den Totzellabster ist. Doppelklicken Sie in die Mitte des Polygongaters, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit dem Parameter FSC-A auf der x-Achse und dem Parameter SSC-A auf der y-Achse anzuzeigen.
Klicken Sie auf das Rechteck und erstellen Sie ein entspanntes Tor, um alle einzelnen lebenden Zellen in diesem Diagramm einzuschließen. Doppelklicken Sie in die Mitte des entspannten Tores, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit CD3 auf der x-Achse und CD8 auf der y-Achse anzuzeigen. Verwenden Sie die entsprechende Zugriffsskala für die Visualisierung im Diagrammfenster.
Ändern Sie bei Bedarf die x- und y-Skala, indem Sie auf das Kästchen klicken, das mit einem T in der Nähe jeder Achse gekennzeichnet ist, wählen Sie Zugriffsfunktion anpassen und ändern Sie bei Bedarf zusätzliche Neg-Jahrzehnte mit Basen und positiven Jahrzehnten. Markieren Sie die Zellen CD3+CD8+, indem Sie auf Polygon klicken. Doppelklicken Sie in die Mitte des CD3+CD8+-Gatters, um die Zellen in einem Punktplot mit Tetr-Gag auf der x-Achse und Pent-Gag auf der y-Achse anzuzeigen.
Wählen Sie die antigenspezifischen CD8 T-Zellen aus, indem Sie auf Polygon klicken. Doppelklicken Sie in die Mitte des Gag-spezifischen Tors, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und Ki67 auf der y-Achse anzuzeigen. Markieren Sie die Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen, indem Sie im Abschnitt "Gating-Werkzeug" des Diagrammfensters auf "Quad" klicken.
Kopieren Sie die in einem Beispiel erstellte Gating-Strategie in die entsprechende Gruppe, um die Gatter auf alle Stichproben der Gruppe anzuwenden. Kopieren Sie dann Gating-Strategien für die b-Milz- und CBM-Gruppen, wie im Textmanuskript beschrieben. Stellen Sie sicher, dass alle Gates für jede Stichprobe der drei Gruppen geeignet sind.
Bei Bedarf desynchronisieren Sie die Gruppe und ändern Sie die Gatter wie im Manuskript beschrieben. Zeigen Sie die BM-Zellen des entspannten Tores in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und Ki67 auf der y-Achse an. Visualisieren Sie die Ergebnisse, indem Sie im Menübandbereich des Arbeitsbereichs auf "Layout-Editor" klicken.
Ziehen Sie jedes Gate der Gating-Strategie im Beispielbereich in den Layout-Editor, und platzieren Sie die Plots entsprechend der Reihenfolge des Gatings. Ändern Sie bei Bedarf den Diagrammtyp, indem Sie auf das entsprechende Diagramm im Layout doppelklicken und den entsprechenden Typ im Diagrammdefinitionsfenster auswählen. Klicken Sie auf die Gruppe und iterieren Sie nach Funktionen auf dem Layoutband, um die Ergebnisse zu visualisieren, die in antigenspezifischen CD8-T-Zellen aus jedem Organ erhalten wurden, und verschiedene Proben zu vergleichen.
Visualisieren Sie die Ergebnisse von Knochenmarkzellen, die eine Positivkontrolle darstellen. Ein typisches Beispiel für die Zellzyklusanalyse von Knochenmarkzellen wird hier gezeigt. Das Protokoll ergab einen niedrigen Variationskoeffizienten von G0 bis G1 und G2 bis M DNA-Peaks, was auf eine ausgezeichnete Qualität der DNA-Färbung hinweist.
Eine fünfstufige Gating-Strategie wurde angewendet, um antigenspezifische CD8-Zellen zu identifizieren. Zwei Multimere wurden verwendet, um die Empfindlichkeit des Gag-spezifischen CD8-T-Zellnachweises bei geimpften Mäusen zu verbessern, ohne den Färbehintergrund bei unbehandelten Mäusen zu erhöhen. Gag-spezifische CD8-T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten und in der Milz enthalten einen hohen Anteil an Zellen in den S-G2/M-Phasen am dritten Tag nach dem Boost.
Darüber hinaus wiesen Gag-spezifische CD8-T-Zellen in den S-G2/M-Phasen einen hohen FSC-A und SSC-A auf, wenn sie auf die gesamten CD8-T-Zellen desselben Organs überlagert wurden. Offset-Histogramme zeigten, dass die CD62L-Expression durch Gag-spezifische CD8-T-Zellen niedrig war, wie für aktivierte T-Zellen erwartet, mit Ausnahme einiger Zellen in G0 in den Lymphknoten. Diese Methode wurde für T-Zellen entwickelt, um eine hervorragende Qualität der DNA-Färbung zusammen mit der Membran und der Ki67-Färbung zu erreichen.
Die Analyse der Durchflusszytometrie ist ein Schlüsselpunkt. Stellen Sie sicher, dass Sie die entsprechende Steuerung für die Gate-Positionierung verwenden. Mit dieser Methode entdeckten wir T-Zellen in S-G2/M-Phasen des Zellzyklus im peripheren Blut der Maus und des Menschen.
Diese Technik war nützlich bei Immunüberwachungsstudien bei Typ-1-Diabetes, infektiöser Mononukleose und COVID-19.
Übersicht
Diese Studie stellt eine Durchflusszytometrie-Methode zur Analyse klonal expandierender, antigenspezifischer CD8-T-Zellen in der Milz und den Lymphknoten geimpfter Mäuse vor. Die Technik ermöglicht die Detektion von T-Zell-Antworten ohne die störenden Effekte einer In-vivo-Behandlung mit Medikamenten oder einer Zellübertragung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Durchflusszytometrie
- T-Zell-Biologie
Hintergrund
- Die klonale Expansion ist entscheidend für antigenspezifische T-Zell-Antworten.
- Der Zellzyklus reagierender T-Zellen wurde aufgrund technischer Herausforderungen bisher wenig erforscht.
- Das Verständnis der Dynamik von T-Zellen ist wesentlich, um Einblicke in Immunantworten zu gewinnen.
- Diese Studie adressiert die Notwendigkeit einer Methode zur Echtzeitanalyse von T-Zell-Antworten.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Analyse antigenspezifischer CD8-T-Zellen in vivo.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Proliferation von T-Zellen während immunologischer Reaktionen.
- Erleichterung der Untersuchung der Dynamik von T-Zellen in verschiedenen immunologischen Kontexten.
Verwendete Methoden
- Herstellung eines frischen Permeabilisierungspuffer für die Zellfärbung.
- Verwendung des monoklonalen Antikörpers Ki67 FITC zum Nachweis proliferierender T-Zellen.
- Durchflusszytometrische Analyse zur Beurteilung von T-Zellpopulationen und deren Aktivierungsstatus.
- Strategien zur Gating von antigen-spezifischen CD8-T-Zellen aus gemischten Populationen.
Hauptergebnisse
- Die Methode weist erfolgreich antigen-spezifische CD8-T-Zellen nach, die an aktiven Immunantworten beteiligt sind.
- Die Proliferation von CD8-T-Zellen kann präzise und ohne störende Variablen gemessen werden.
- Die Technik liefert Erkenntnisse über die Dynamik von T-Zellen während Impfungen und Infektionen.
- Die Ergebnisse zeigen die Nützlichkeit dieser Methode bei der Erforschung von Autoimmunerkrankungen und der Krebsimmuntherapie auf.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Durchflusszytometriemethode eignet sich zur Analyse von T-Zell-Antworten.
- Dieser Ansatz verbessert das Verständnis der Immunantwortdynamik in verschiedenen Kontexten.
- Zukünftige Studien können diese Technik nutzen, um das Verhalten von T-Zellen in Gesundheit und Krankheit zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine präzise Quantifizierung der antigenspezifischen CD8-T-Zell-Proliferation in vivo und schließt damit eine wichtige Lücke im Immunmonitoring für die Entwicklung von Impfstoffen und Immuntherapien. Durch die Unterscheidung der Phasen G0, G1 sowie S-G2/M ohne Verwendung von Nukleotidanaloge oder Farbstoffverdünnung liefert sie einen mechanistischen Überblick über die Dynamik der klonalen Expansion. Dies unterstützt die Target-Validierung und die Identifizierung führender Kandidaten, indem Antigenbindung mit funktionellen proliferativen Zuständen in präklinischen Modellen verknüpft wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Korrelation der Antigenspezifität mit dem Zellzyklusfortschritt in reagierenden T-Zellen.
- Operativer Wert: Bietet einen reproduzierbaren Durchflusszytometrie-Endpunkt für die funktionelle Zielstrukturvalidierung, unabhängig von den Einschränkungen von BrdU oder CFSE.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem der Anteil antigenspezifischer T-Zellen, die sich zur Mitose verpflichtet haben, im Vergleich zu solchen in G1 oder G0 quantifiziert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantitative Ausgaben (DNA-A vs. Ki67), die für das Hochdurchsatz-Screening von Impfstoffkandidaten oder Immunmodulatoren geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Verwendet Hoechst 33342 zur hochauflösenden Unterscheidung von DNA-Peaks und gewährleistet eine konsistente Trennung von G0/G1 und G2/M über alle Proben hinweg.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit der Analyse mehrerer Organe (Milz, Lymphknoten, Knochenmark) und an präklinische Arten anpassbar, um vergleichende Studien zu ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Bedeutung für die Krankheit: Anwendbar auf Impfstoffwirksamkeitsstudien, wie anhand von HIV-gag-Vektor-geimpften Mäusen gezeigt, bei denen eine Anreicherung in der S-G2/M-Phase in antigenspezifischen CD8-T-Zellen beobachtet wurde.
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Phase, indem eine kinetisch aufgelöste Messung der T-Zell-Expansion bereitgestellt wird, die die Stärke der Immunantwort vorhersagt.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Ermöglicht Go/No-Go-Kriterien basierend auf der proliferativen Kinetik antigenspezifischer Klone und verringert dadurch die alleinige Abhängigkeit von Endpunkt-Phänotyp-Markern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich nahtlos in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase ein und ermöglicht eine frühe Beurteilung der proliferativen Kapazität von T-Zellen nach der Immunisierung sowie die Ableitung von Hinweisen zur Optimierung führender Wirkstoffe durch funktionelle Immunprofilerstellung.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die Antigenerkennung (über MHC-Multimer) mit dem Zellzyklusstatus verknüpft wird, um zu klären, ob die Bindung Proliferation oder Anergie auslöst.
- Screening: Liefert direkt auswertbare, quantitative Daten zur Verteilung des Zellzyklus, um Impfstoffplattformen oder die Wirkung von Adjuvantien auf die T-Zell-Expansion zu vergleichen.
- Analytik: Erzeugt multiparametrische Messgrößen (DNA-Gehalt, Ki67, Streulicht, Antigenspezifität), die statistische Vergleiche von Proliferationsindizes unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die präklinische Validierung, indem aktivierten, proliferierenden T-Zell-Subpopulationen identifiziert werden, die mit schützender Immunität in Infektions- und Krebsmodellen korrelieren.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die immunologische Überwachung in Langzeitstudien innerhalb von Pipelines zur Autoimmunität, Infektionskrankheiten und Immuno-Onkologie.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem die proliferative Heterogenität innerhalb antigenspezifischer T-Zell-Populationen aufgeklärt wird.
- Operationaler Wert: Bietet Standardisierung durch eine feste Gating-Strategie und DNA-Färbung auf Basis von Hoechst und verringert so die Variabilität zwischen Assays.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühzeitige Risikominderung immunmodulatorischer Kandidaten auf Grundlage der funktionellen T-Zell-Kinetik ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem der proliferative Anteil antigenspezifischer T-Zellen als Biomarker der Reaktionsqualität quantifiziert wird.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der mehrfarbigen Durchflusszytometrie, einschließlich Kompensationskontrollen für FITC-Ki67- und Hoechst-Signale.
- Setzt den Zugang zu einem Durchflusszytometer voraus, das über UV-Anregung für die Detektion von Hoechst 33342 und geeignete Filteranordnungen verfügt.
- Erfordert standardisierte Permeabilisierungs- und Waschprotokolle, um die Epitopintegrität für Ki67, Multimer und Oberflächenmarker zu bewahren.
- Beinhaltet die Optimierung der Hoechst-Konzentration (2 µg/mL) und der Inkubationszeit, um Zytotoxizität zu vermeiden und gleichzeitig eine optimale Auflösung der DNA-Peaks zu erreichen.
- Basiert auf einer korrekten Gating-Hierarchie, beginnend mit der Ausschließung von Singuletts und toten Zellen, um eine genaue Identifizierung antigenspezifischer T-Zellen sicherzustellen.
