Name: Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Lernen Sie die optische Aktionspotentialmessung in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten. Diese Hochdurchsatzmethode vereinfacht die Elektrophysiologie für Toxizitätsscreenings.

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Die Autoren danken Cairn Research Ltd. für ihren freundlichen finanziellen Beitrag, der die Produktionskosten dieser Veröffentlichung gedeckt hat. Darüber hinaus danken wir Frau Ines Mueller und Frau Stefanie Kestel für die hervorragende technische Unterstützung.
Die Forschung der Autoren wird vom Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Vo 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 und im Rahmen der Exzellenzstrategie - EXC 2067/1- 390729940) und der Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20) unterstützt.

1. Zelluläre Präparate
HINWEIS: Menschliche iPSCs, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurden von gesunden Spendern abgeleitet und in Monoschichten unter Verwendung vollständig definierter niedermolekularer Modulations- von WNT-Signal- und Laktatreinigungstechniken wie zuvor beschrieben12,13,14unterschieden. iPSC-CMs wurden alle 2-3 Tage mit einem unten beschriebenen Kulturmedium gepflegt.
<ol><li>Bereiten Sie ein Kulturmedium aus Basalmedium (RPMI 1640) und 2% Ergänzung (B27) vor. Bei 4 °C lagern. Bei Raumtemperatur (RT) verwenden.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Beschichtungsmedium aus Basalmedium (RPMI 1640), 2% Ergänzung (B27) und 1:2000 ROCK-Inhibitor vor. Bei 4 °C lagern. Verwendung bei RT.</li>
	<li>Beschichtet sterilisierte 10 mm Runde Glas #0 Decklippen mit 150 μL 1:60 Faktor freie Basalmembranmatrix und inkubieren bei 4 °C für 4 h. HINWEIS: Die Optimierung des Deckabdeckelvolumens ist notwendig, um sicherzustellen, dass das gesamte Glas bedeckt ist, während eine ausreichende Oberflächenspannung erhalten bleibt, um ein Verschütten zu verhindern. 150 μL wird für 10 mm runde Abdecklippen empfohlen. Losgröße, Abdeckscheintyp, Abdeckvolumen und Kulturplattentyp können für die Bedürfnisse der Experimentatoren geeignet sein.</li>
	<li>Beginnen Sie die iPSC-CM-Dissoziation mit einem EDTA-basierten Zelldissoziationsreagenz. Stellen Sie sicher, dass sich die Monoschicht vollständig löst, indem Sie mit einer 1.000 μL-Pipette vorsichtig spülen.</li>
	<li>Die Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen geben und doppeltes Beschichtungsmedium hinzufügen. Zentrifuge für 10 min bei 100 x g.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet mit einem gewünschten Volumen (Resuspensionsvolumen) des Beschichtungsmediums. Zellen manuell oder elektronisch zählen.</li>
	<li>Wählen Sie die optimale Dichte pro Abdecklippe (15.000), die später die isolierte Zellanalyse ermöglicht.</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen der "aktiven" Zellsuspension (A), das benötigt wird, um alle Abdeckungslippen mit dieser gewünschten Dichte zu plattieren. Die folgende Formel auftragen und in ein separates Röhrchen zurückziehen: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ01v2.jpg">
</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen des zusätzlichen Beschichtungsmediums (B), das erforderlich ist, um jeden Abdeckrutsch in einem gewünschten Volumen unterzubringen. Wenden Sie die folgende Formel an und fügen Sie das resultierende Volumen in das Rohr der aktiven Suspension hinzu: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ02v2.jpg">
</li>
	<li>Entfernen Sie die Matrix von den Coverlips und tragen Sie das "Coverslip Volume" der Zellsuspension (A + B) auf jeden Coverslip auf. Regelmäßig in der Röhre resuspendieren, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten.</li>
	<li>Bei 37 °C für 1 h inkubieren. Füllen Sie den Brunnen vorsichtig mit Beschichtungsmedium.</li>
	<li>Tauschen Sie nach 24 Stunden die Medien mit dem normalen Kulturmedium aus und pflegen Sie es alle 2-3 Tage.</li>
</ol>2. Versuchsaufbau
<ol><li>Rüsten Sie ein invertiertes Epifluoreszenzmikroskop mit einer 40-fachen Vergrößerung, Linse mit hoher numerischer Apertur (N.A:&gt; 0,75) aus, um Experimente durchzuführen.</li>
	<li>Koppeln Sie eine schnell umschaltend warmweiße LED an den durchgelassenen Beleuchtungsanschluss des Mikroskops. Setzen Sie einen einfachen roten 660-nm-Filter in den Durchlichtpfad ein. HINWEIS: Dieses Licht kann während photometrischer Experimente aktiviert werden, um die Probe zu beobachten, ohne das grün fluoreszierende Signal zu kontaminieren.</li>
	<li>Montieren Sie einen schnell schaltenden 470 nm LED-Kopf für die Photometrieaufzeichnung. Setzen Sie einen 470/40-Anregungsfilter am Epifluoreszenzanschluss des Mikroskops ein, um das von der LED erzeugte Licht zu reinigen. HINWEIS: Für eine optimale Signalquantifizierung wird ein Beleuchtungssystem mit Hochgeschwindigkeits-Feedback-Steuerung der optischen Ausgabe empfohlen.</li>
	<li>Setzen Sie einen Mikroskopwürfel mit einem 495 nm langen Passstrahlteiler in das Spiegeleinheitskarussell innerhalb des Mikroskops ein.</li>
	<li>Passen Sie einen Detektionsarm mit einer einstellbaren Feldmembran an den C-Mount-Anschluss des Mikroskops an, um die Auswahl der interessierenden Bereiche zu ermöglichen.</li>
	<li>Koppeln Sie separat einen Photomultiplierdetektor (PMT) und eine USB-Kamera an das Mikroskop. Dies wird die Grundlage für das Emissionsdetektionssystem bilden.</li>
	<li>Setzen Sie einen Filterwürfel mit einem 565 nm langen Passstrahlteiler und einem 535/50-Emissionsfilter in den PMT-Anschluss ein. Dadurch wird das Emissionslicht zwischen den beiden Detektoren aufgeteilt. HINWEIS: Eine Kamera, die an den Sendeanschluss des Emissionserkennungssystems angeschlossen ist, kann während aller Experimente durchgelassenes Licht unter Hellfeld erkennen.</li>
	<li>Koppeln Sie das PMT an ein Netzteil und einen PMT-Verstärker. Schließen Sie den PMT-Verstärkerausgang an einen analogen Eingangspin eines Datenerfassungssystems an.</li>
	<li>Filtern Sie analoge Daten aus dem PMT bei 1 kHz oder höher.</li>
	<li>Digitalisieren Sie Daten mit einer Frequenz, die mindestens doppelt so hoch ist wie die höchste Frequenz, die im analogen Signal vorhanden ist (2 kHz oder höher), um die Nyquist-Kriterien zu erfüllen und Aliasing zu verhindern.</li>
</ol>3. Mobilfunkladung mit VF2.1Cl
HINWEIS: Alle Schritte mit diesem Farbstoff müssen bei schlechten Lichtverhältnissen durchgeführt werden.
<ol><li>Bereiten Sie eine Tyrode-Badelösung von (in mM) vor: 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glucose, 4 KCl, 1MgCl2,2 CaCl2,pH = 7,35 und warm auf 37 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Aliquot-Ladelösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor, indem Sie 5 μL 1.000x VF2.1Cl und 50 μL 20% lösliche Poloxamerlösung mischen.</li>
	<li>5 μL der Ladelösung auf 5 ml erwärmte Tyrode-Lösung (insgesamt 0,1-fache Farbstoffkonzentration) in einer 20 mm Petrischale auftragen. HINWEIS: Die endgültige Farbstoffkonzentration beträgt 0,1x. Dies ist 1/10der vom Hersteller vorgeschlagene. Dies schont Ressourcen, sorgt für eine vernachlässigbare Zytotoxizität und vor allem für klare optische Signale von geladenen Zellen mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis.</li>
	<li>Einen einzelnen iPSC-CM-Deckelr in die Schüssel geben und bei 37 °C für 20 min inkubieren.</li>
	<li>Bauen Sie eine beheizte Lebendzell-Bildgebungskammer zusammen. Auf den Mikroskopstand montieren und mit 500 μL frischer Tyrode-Lösung füllen.</li>
	<li>Waschen Sie den Abdecklappen mit frischer Tyrode-Lösung bei 37 °C.</li>
	<li>Tragen Sie den iPSC-CM-Abdeckr vorsichtig mit einer Feinpunktzette auf die vorgewärmte Badkammer auf. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Kammer und ihr Inhalt immer bei physiologischen Temperaturen erhitzt werden. Falls gewünscht, beginnen Sie mit der kontinuierlichen Perfusion der erwärmten Tyrode-Lösung.</li>
</ol>4. Elektrische Feldstimulation
HINWEIS: Die externe Triggerung von iPSC-CM ist optional, aber nützlich für die Standardisierung der zellulären Dynamik und experimenteller Parameter. Es erhöht die Analysefreundlichkeit und ermöglicht die Untersuchung frequenzabhängiger Effekte.
<ol><li>Befestigen Sie einen Stimulationseinsatz mit zwei Platinelektroden im Abstand von 5 mm in der Aufnahmekammer.</li>
	<li>Schließen Sie einen externen Stimulator an den Stimulationseinsatz an. Eingestellt auf 5 ms bipolare Feldimpulse bei 0,5 Hz.</li>
	<li>Bestimmen Sie die optimale Stimulationsspannung, indem Sie den Reiz von 1 V nach oben erhöhen. Der Schwellenreiz ist definiert als die niedrigste Spannung, bei der sich die Zellen zusammenzuziehen beginnen. Wenden Sie Spannungen etwa 25% über diesem Schwellenwert an. Der normale Bereich liegt zwischen 1 V und 30 V.</li>
	<li>Fixieren Sie die Stimulationsfrequenz mit dem externen Stimulator oder lösen Sie sie mit einer Erfassungssoftware aus.</li>
</ol>5. Optische Wirkungspotenzialerfassung
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet eine kommerzielle Software für die Erfassung und Analyse.
<ol><li>Visualisieren Sie die Myozyten in der Hellfeldansicht mit dem durchgelassenen Lichtweg und der USB-Kamera.</li>
	<li>Wählen Sie eine isolierte Zelle aus und schneiden Sie ihren optischen Weg mit der Feldmembran eng zu, um sicherzustellen, dass nur das Licht der interessierenden Zelle überwacht wird.</li>
	<li>Aktivieren Sie den PMT-Verstärker und stellen Sie die PMT-Versorgung auf 750 V ein.</li>
	<li>Führen Sie das Stimulationsprotokoll (siehe Schritt 4) zusammen mit der Erfassungssoftware aus und aktivieren Sie gleichzeitig das 470 nm Anregungslicht. Letzteres kann über ein Remote-Panel erfolgen oder mit einer festen Intensität (TTL-Signal) automatisiert werden.</li>
	<li>Passen Sie die Verstärkung und den Offset des PMT-Verstärkers an, um sicherzustellen, dass das Signal nicht sättigt und für den Erfassungsbereich des Aufnahmesystems optimiert ist.</li>
	<li>Zeichnen Sie 10 Sweeps auf, um sicherzustellen, dass stabile Aktionspotentiale erkannt werden.</li>
	<li>Setzen Sie die Aufnahme fort und bewegen Sie sofort den Mikroskopstand, um kurz das Hintergrundsignal aus einer Region ohne Zellen zu erfassen. Schalten Sie die Erregerleuchte aus. HINWEIS: Dieser Hintergrundwert(F-Offset) wird verwendet, um jede Hintergrundfluoreszenz zu berücksichtigen.</li>
	<li>Falls gewünscht, lokal Referenzarzneimittel wie 1 μM Nifedipin perfundieren, um zelluläre Reaktionen auf pharmakologische Manipulationen zu identifizieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie sequenziell die Schritte 5.2 bis 5.7, wobei Sie jedes Mal eine neue Zelle auswählen. Tauschen Sie auf Wunsch Coverlips aus, um einen hohen experimentellen Umsatz in einer einzigen Sitzung zu gewährleisten. HINWEIS: Lade- und Bilderfassungsprotokolle sind in Abbildung 2beschrieben.</li>
</ol>6. Datenanalyse
<ol><li>Öffnen Sie eine gespeicherte Aufzeichnung mit der Analysesoftware und durchschnittlich 10 Sweeps mit stimulierten Aktionspotentialen aus einer einzelnen Zelle.</li>
	<li>Nehmen Sie einen Mittelwert des Basisliniensignals, das denF-Offset darstellt, und subtrahieren Sie diesen von der gemittelten Spur.</li>
	<li>Berechnen Sie ∆F/F0 mit der folgenden Formel (wobei F fluoresziert und F0 diastolische Fluoreszenz ist): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ03v2.jpg">
</li>
	<li>Identifizieren Sie die Trace-Baseline (diastolisch) und das Interessengebiet (AP) und messen Sie die gewünschten Parameter des Kardipotenzials. Dies beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf die Zerfallszeit für 50% (APD50)und 90% (APD90)Repolarisation.</li>
	<li>Exportieren Sie die Daten aus dieser einzelnen Zelle in eine Tabellenkalkulationssoftware.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 6.1 – 6.5 für alle Aufzeichnungen. Bewerten Sie die Ergebnisse mit geeigneten ungepaarten Tests oder varianzanalysen.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Lade- und Bilderfassungsprotokolle. (A) Flussdiagramm des vollständigen VF2.1Cl-Ladeprotokolls für iPSC-CMs und native Kardiomyozyten. (B) Ein vereinfachtes Schema der Strahlteiler- (BS) und Filterkonfigurationen, die in diesem Protokoll zur Anregung und Detektion von VF2.1Cl-Emissionen als Reaktion auf Änderungen der Transmembranspannung verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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<li>Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+optical+reporting+of+membrane+potential+in+situ+using+a+neuronal+tracer+dye%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye.</a> The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).</li>
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</ol>

Cairn Research Ltd unterstützte diese Veröffentlichung durch die Übernahme der Produktionskosten der Videodatei.

Hier beschreiben wir ein grundlegendes Protokoll, um auf einfache Weise detaillierte AP-Profile von isolierten iPSC-CMs zu erfassen, die für die elektrophysiologische Modellierung und das kardiale Drogenscreening geeignet sind. Wir erkennen regelmäßige, robuste APs aus unseren spärlich gesäten iPSC-CMs, was sowohl auf Indikatorfunktionalität als auch auf methodische Genauigkeit hindeutet.
Aufgrund des breiten Spektrums kommerzieller Methoden für die iPSC-Reprogrammierung und der fehlenden Stan...

Die elektrophysiologische Modellierung von Kardiomyozyten und der Aufbau effizienter Plattformen für das kardiale Arzneimittelscreening sind essentiell für die Entwicklung therapeutischer Strategien für eine Vielzahl von Arrhythmusstörungen. Die rasche Expansion der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) hat vielversprechende Fortschritte in der Modellierung menschlicher Krankheiten und pharmakologischen Untersuchungen mit isolierten patientenbasierten Kardiomyozyten (iPSC-CM) ermöglicht. "Goldstandard" -Techniken zur elektrophysiologischen Charakterisierung dieser Zellen durch Patch-Clamp (Strom-Clamp) können die Morphologie und Dauer des Aktionspotentials (AP) quantifizieren, diese Methode ist jedoch unglaublich komplex und langsam und nicht gut für die Datenerfassung mit hohem Durchsatz geeignet1. Es wird regelmäßig berichtet, dass iPSC-CMs im Vergleich zu adulten nativen Kardiomyozyten ein erhöhtes diastolisches Membranpotenzial und einen erhöhten Ableitstrom aufweisen2. Es wird vermutet, dass eine kleinere Zellgröße und eine reduzierte Membrankapazität, die in iPSC-CMs beobachtet werden, bei der Verwendung der Strom-Klemm-Technik zu systematischen Fehlern führen können, was vielleicht diese Abweichungen erklärt3. Um die Nützlichkeit einer iPSC-CM-Plattform zu maximieren, ist eine zusätzliche Methode wertvoll, um den Durchsatz zu erhöhen und die Datengenauigkeit bei der Charakterisierung von Transmembranspannungsänderungen auf Einzelzellenebene in iPSC-CMs sicherzustellen.
Spannungsempfindliche Farbstoffe (VSD) sind seit langem eine vorgeschlagene Methode, um eine schnellere, nicht-invasive und gleichwertige Analyse der kardialen AP-Kinetik im Vergleich zu denen herkömmlicher Techniken zu ermöglichen4. Eine aktuelle Studie hat die Eignung der ratiometrischen spannungsempfindlichen Sondenphotometrie zur genauen Quantifizierung des kardialen AP5nachgewiesen. Darüber hinaus verleiht die Fähigkeit, optische Photometrieansätze leicht zu skalieren, diese Technik für groß angelegte Kardiotoxizitätsbildschirme, die für die Entwicklung therapeutischer Medikamente (z. B. CiPA) von entscheidender Bedeutung sind. Die Entwicklung standardisierter Kardiotoxizitätsprotokolle in einer verblindeten Multi-Site-Studie unter Verwendung von Mikroelektrodenarrays und optischen Spannungssensoren hat den Schlüsselwert dieses Ansatzes gezeigt6.
Viele potentiometrische Farbstoffe sind kommerziell erhältlich, und die laufende synthetische Entwicklung neuer Sonden zeigt ein aufregendes Potenzial, ihre Wirksamkeit über eine Vielzahl von kardialen und neuronalen Konstrukten hinweg zu rationalisieren. Der ideale VSD hat eine erhöhte Kinetik und Empfindlichkeit und zeigt gleichzeitig eine verminderte kapazitive Belastung, Photobleaching und Zytotoxizität. Das kürzlich synthetisierte VF2.1Cl (FluoVolt) drückt viele dieser vorteilhaften Eigenschaften aus, hauptsächlich aufgrund seiner neuartigen drahtbasierten Molekülstruktur, die von anderen Mitgliedern der neuen VoltageFluor (VF) -Familie geteilt wird7. Im Gegensatz zu herkömmlichen elektrochromen VSDs, bei denen einfache Sonden molekular und elektrisch mit der Plasmamembran konjugieren, besteht dieser Farbstoff aus einem passiv eingefügten, membranübergreifenden synthetischen Draht, der einen elektronenreichen Donor mit einem modifizierten Fluoreszeinfluorophor (FITC) paart. Mechanistische Details sind in Abbildung 1 dargestellt. Dieser Farbstoff zeigt eine ausgezeichnete Empfindlichkeit gegenüber Membranspannungsschwankungen und zeigt eine Änderung der Emissionsintensität um 27% pro 100 mV im Gegensatz zu ~ 10% bei anderen gängigen Sonden bei vergleichbaren Geschwindigkeiten7. Darüber hinaus interagieren drahtbasierte PeT-Systeme nicht direkt mit dem zellulären elektrischen Feld, was zu minimalen elektrischen Störungen und vernachlässigbaren Änderungen der zellulären kapazitiven Last führt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig01.jpg"> Abbildung 1: Chemische, spektrale und mechanistische Parameter des VF2.1Cl-Farbstoffs. (A) Chemische Struktur von VF2.1Cl. Zu den zu beachtenen molekularen Merkmalen gehören mehrere Alkylgruppen innerhalb des molekularen Phenylenvinylendrahtes, die das Einsetzen in die Plasmamembran erleichtern. Eine negativ geladene Sulfonsäuregruppe, die mit der FITC-Sonde konjugiert ist, sorgt für eine Fluorophorstabilisierung auf der extrazellulären Oberfläche und unterstützt die nahezu senkrechte Insertion relativ zum elektrischen Feld der Lipiddoppelschicht. (B) Vereinfachtes Schema der senkrechten VF2.1Cl-Einbettung in die Plasmamembran einer Zielzelle. (C) Absorptions- und Emissionsspektren des VF2.1Cl-Farbstoffs. Spectra ist identisch mit denen von Standard-FITC- und GFP-Sonden. (D) Darstellung der mechanistischen Wirkungsweise von VF2.1Cl. Unter Ruhebedingungen (hyperpolarisiert) treiben negative intrazelluläre Spannungen freie Elektronen in Richtung des rostralen Fluorophors. Die Elektronenhäufigkeit stellt sicher, dass der photoinduzierte Elektronentransfer (PeT) als Weg aus dem angeregten Zustand nach der optischen Anregung bevorzugt wird, wodurch die Fluoreszenz effektiv abgeschreckt wird. Im Gegensatz dazu beeinflusst ein depolarisiertes Membranpotential die Elektronenbewegung nach unten und begünstigt die Fluoreszenz bei optischer Anregung. Die resultierende Fluoreszenzantwort ist linear mit der Membranspannung verbunden und kann präzise genutzt werden, um detaillierte zeitliche Informationen über die zelluläre elektrophysiologische Kinetik zu sammeln. (E) Repräsentative Hellfeld- (obere) und Fluoreszenzaufnahmen bei 470 nm (unten) von Leporin-Kardiomyozyten, die mit VF2.1Cl. (F) Z-Stapel eines einzelnen geladenen Kardiomyozyten beladen sind. Pfeile zeigen Bereiche mit klarer Lokalisation von VF2.1Cl auf der Zellmembran an. Die Bilder wurden mit einem konfokalen System mit rotierender Scheibe aufgenommen, das aus einem konfokalen X-lightv3-Spinnscheibenkopf mit einem 50 μm-Lochmuster besteht. LDI-7 Beleuchtung; Prime95B Kamera und ein PlanApo Lambda 100x Objektiv. Maßstabsleiste: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die mit VF2.1Cl konjugierte FITC-Sonde stellt sicher, dass sie effektiv unter Standard- und GFP-Filterkonfigurationen eingesetzt werden kann und nur ein Einkanalerfassungssystem benötigt, die beide gemeinsame Merkmale von fluoreszierenden Bildgebungsplattformen sind. Die Analyse dichter menschlicher iPSC-CM-Monoschichten mit diesem Farbstoff wurde kürzlich berichtet8,9,10,11. Unser Protokoll unterscheidet sich von diesen Studien aufgrund unserer Untersuchung einzelner, isolierter iPSC-CMs, die von den elektrischen und parakrinen Einflüssen dichter synzytriler Monoschichten unbeirrt sind, und unserer Verwendung eines erschwinglichen und anpassbaren Photometriesystems im Gegensatz zu komplexen konfokalen oder Weitfeld-Bildgebungsanordnungen.
Hier beschreiben wir unser Protokoll zur schnellen Erfassung und Analyse robuster optischer APs aus isolierten humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und nativen Kardiomyozyten (siehe Ergänzungsdatei). Wir verwenden VF2.1Cl in Verbindung mit einer anpassbaren State-of-the-Art-Plattform für Einzelzell-Photometrie-Messungen. Diese Versuchsprotokolle wurden von der Ethikkommission der Universitätsmedizin Göttingen genehmigt (Nr. 09.10.15).

<table><tbody><tr><td><stark>Reagenzien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 Trypsin EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>B27 Beilage&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>HN04.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukose wasserfrei&nbsp; BioChemica</td><td>ITW Reagenzien</td><td>A1422</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt Membran-Potential-Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>HN77.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Lamanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Nifedipin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21829-25-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor Y27632</td><td>Stemolekül</td><td>04-0012-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>61870010</tr><tr><td>Versene EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15040033</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>495LP Dichroitischer Strahlteiler&nbsp;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B Verstärker&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circle Deckgläser, Dicke 0</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual-OptoLED-Netzteil&nbsp;</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET470/40x Anregungsfilter&nbsp;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET535/50m</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geätztes Neubauer Hämazytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterwürfel&nbsp;</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX73 Inverses Mikroskop&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MonoLED</td><td>Cairn Forschung&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiport-Adapter&nbsp;</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myopacer Zellstimulator&nbsp;</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optomask Verschluss&nbsp;</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optoscan-Systemsteuerung</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH-1 Temperaturgesteuerte Plattform&nbsp; &nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier-Detektor&nbsp;</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT Verstärker Einsatz</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT Supply Insert</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC-26G Kammer mit offenem Bad&nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SA-OLY/2AL Tischadapter&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T565lpxr Dichroitischer Strahlteiler&nbsp;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T660lpxr Dichroitischer Strahlteiler</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-20 Zweikanal-Temperaturregler</td><td>npi Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLFLN 40X Objektiv</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>USB 3.0 Farbkamera&nbsp;</td><td>Imaging Source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex 11.1</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampfit 11.1</td><td>Molekulare Bauelemente&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IC Capture 2.4&nbsp;</td><td>Bildquelle&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 8</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einzelzellige optische aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten stammzell-abgeleiteten kardiomyozyten

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Herkömmliche intrazelluläre Mikroelektrodentechniken zur Quantifizierung der Kardiomyozyten-Elektrophysiologie sind extrem komplex, arbeitsintensiv und werden typischerweise bei niedrigem Durchsatz durchgeführt. Die schnelle und kontinuierliche Expansion der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) stellt einen neuen Standard in der kardiovaskulären Forschung dar, und alternative Methoden sind jetzt notwendig, um den Durchsatz elektrophysiologischer Daten auf Einzelzellebene zu erhöhen. VF2.1Cl ist ein kürzlich abgeleiteter spannungsempfindlicher Farbstoff, der eine schnelle einkanalige, hohe Reaktion auf Schwankungen des Membranpotentials bietet. Es verfügt über eine Kinetik, die der anderer vorhandener Spannungsindikatoren überlegen ist, und stellt funktionale Daten zur Verfügung, die denen herkömmlicher Mikroelektrodentechniken entsprechen. Hier demonstrieren wir eine vereinfachte, nicht-invasive Charakterisierung des Aktionspotentials in extern beschleunigten menschlichen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mit einem modularen und äußerst erschwinglichen Photometriesystem.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig03.jpg"> Abbildung 3: Profile des optischen Aktionspotentials (AP) isolierter nativer Kardiomyozyten und humaner induzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteter Kardiomyozyten (iPSC-CM). (A) Repräsentativer optischer AP eines einzelnen murinen Kardiomyozyten (Mitte) mit mittlerer ± SEM von APD50 und APD90 (n = 7, rechts). (B) Repräsentativer...

Hier beschreiben wir die optische Erfassung und Charakterisierung von Aktionspotentialen aus induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit einem modularen Hochgeschwindigkeits-Photometriesystem.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Dieses Protokoll kann Hochdurchsatzmessungen der zellulären Elektrophysiologie in einer Weise liefern, die der sich schnell entwickelnden Technologie der induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten entspricht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie weniger komplex und weniger arbeitsintensiv ist als die traditionelle Patch-Clamp-Technik, aber dennoch in der Lage ist, gleichwertige Ergebnisse zu erzielen. So kann dieses Protokoll für groß angelegte Toxizitäts-Screening-Programme mit humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten erweitert werden.Zum Beispiel der umfassende in vitro Proarrhythmie-Assay. Um induzierte pluripotente Stammzell-Kardiomyozytenkulturen für das Experiment vorzubereiten, beschichten Sie zunächst einzelne 10 Millimeter runde Glas-Abdeckgläser mit der Nummer Null mit 150 Mikrolitern 1:60 Basalmembranmatrix in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Deckgläser vier Stunden lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die überschüssige Matrix von den Deckgläsern und tragen Sie das entsprechende Zellvolumen auf jeden Deckglas auf.Nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius füllen Sie jede Vertiefung vorsichtig mit Galvanikmedium und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Zur Vorbereitung auf die spannungsempfindliche Farbstoffbildgebung statten Sie ein inverses Epifluoreszenzmikroskop mit einer Linse mit 40-facher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur aus und koppeln Sie eine schnell schaltende warmweiße LED an den Durchlichtanschluss. Setzen Sie einen einfachen roten 660-Nanometer-Filter in den Durchlichtweg ein und montieren Sie einen schnell schaltenden 470-Nanometer-LED-Kopf für die Photometrie-Aufnahme.Setzen Sie einen 470/40-Anregungsfilter an der Epifluoreszenzöffnung ein, um das von der LED erzeugte Licht zu reinigen, und setzen Sie einen Mikroskopwürfel mit einem 495-Nanometer-Langpass-Strahlteiler in das Karussell der Spiegeleinheit innerhalb des Mikroskops ein. Setzen Sie einen Detektionsarm mit einer einstellbaren Feldblende in den C-Mount-Anschluss ein, um die Auswahl des interessierenden Bereichs zu ermöglichen, und koppeln Sie einen PMT-Detektor und eine USB-Kamera an das Mikroskop. Setzen Sie einen Filterwürfel mit einem 565-Nanometer-Langpass-Strahlteiler und einem 535/50-Emissionsfilter in den PMT-Anschluss ein, um das Emissionslicht zwischen den beiden Detektoren aufzuteilen.Koppeln Sie den PMT an ein Netzteil und einen PMT-Verstärker und verbinden Sie den Ausgang des PMT-Verstärkers mit einem analogen Eingangspin eines Datenerfassungssystems. Um die Nyquist-Kriterien zu erfüllen und Aliasing zu verhindern, filtern Sie die analogen Daten aus dem PMT bei einem Kilohertz oder höher und digitalisieren Sie die Daten mit einer Frequenz, die mindestens doppelt so hoch ist wie die höchste Frequenz im analogen Signal. Um die Zellen mit spannungsempfindlichem Farbstoff zu beladen, mischen Sie fünf Mikroliter 1000x FluoVolt und 50 Mikroliter Power Load Solution und fügen Sie drei Mikroliter der resultierenden Ladelösung zu drei Millilitern erwärmter Tyrodelösung in einer Petrischale hinzu.Geben Sie ein einzelnes mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenes Kardiomyozyten-beschichtetes Deckglas in die Schale und stellen Sie die Schale 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf. Montieren Sie eine beheizte Kammer für die Bildgebung lebender Zellen auf dem Mikroskoptisch und füllen Sie die Kammer mit 500 Mikrolitern frischer Tyrodenlösung. Waschen Sie dann den Deckbezug mit frischer Tyrode-Lösung bei 37 Grad Celsius und übertragen Sie den Deckbezug vorsichtig mit einer feinen Pinzette in die vorgewärmte Badekammer.Um die zelluläre Dynamik und die experimentellen Parameter zu standardisieren, führen Sie zwei Platinelektroden im Abstand von fünf Millimetern in die Kammer ein und verbinden Sie die Elektroden mit einem externen Stimulator. Stellen Sie den Stimulator auf fünf Millisekunden bipolare Feldimpulse bei 0,5 Hertz ein und erhöhen Sie den Stimulus von einem Volt, bis sich die Zellen zusammenzuziehen beginnen. Stellen Sie dann die Spannung auf etwa 25 % über diesem Schwellenwert ein.Verwenden Sie für die Erfassung des optischen Aktionspotentials den transmittierten Lichtweg und die USB-Kamera, um die Myozyten unter Hellfeldbedingungen zu visualisieren. Wählen Sie eine isolierte Zelle aus und verwenden Sie die Feldblende, um den Strahlengang eng zu beschneiden, um sicherzustellen, dass nur das Licht der interessierenden Zelle überwacht wird. Aktivieren Sie den PMT-Verstärker und stellen Sie die PMT-Versorgung auf 750 Volt ein.Führen Sie das Stimulationsprotokoll zusammen mit der Erfassungssoftware aus und aktivieren Sie gleichzeitig das 470-Nanometer-Anregungslicht. Zeichnen Sie 10 Sweeps auf und stellen Sie sicher, dass stabile Aktionspotentiale erkannt werden. Bewegen Sie den Mikroskoptisch nach dem letzten Sweep sofort während der Aufnahme, um kurz ein Hintergrundsignal aus einer zellfreien Region zu erfassen und das Anregungslicht auszuschalten.Um die Aktionspotentialdaten zu analysieren, öffnen Sie eine gespeicherte Aufzeichnung in der entsprechenden Analysesoftware und mitteln Sie 10 Sweeps mit stimulierten Aktionspotentialen aus einer einzelnen Zelle. Subtrahieren Sie den Mittelwert des Basissignals, das den Fluoreszenzversatz von der durchschnittlichen Kurve darstellt, und verwenden Sie dann die Formel, um die Fluoreszenzänderung unter Verwendung der diastolischen Fluoreszenz als F0 zu berechnen. Identifizieren Sie die diastolischen und aktionspotentiellen Interessenbereiche und messen Sie die gewünschten kardialen Aktionspotentialparameter, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Dauer bei 50 % und 90 % Repolarisation. Exportieren Sie dann die Daten aus dieser einzelnen Zelle in ein Tabellenkalkulationsprogramm.Diese Methode ermöglicht eine schnelle und präzise Quantifizierung der Repolarisationsmechanik, was wertvolle Einblicke in zelluläre Ionenanomalien liefern kann. Ausgeprägte Phase-I-Merkmale können in optischen Signalen von murinen Kardiomyozyten beobachtet werden, die sich morphologisch von denen von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unterscheiden. Darüber hinaus reagieren humane induzierte pluripotente Stammzellabgeleitete Kardiomyozyten auf pharmakologische Manipulation mit Nifedipin, einem bekannten Calciumkanalantagonisten vom L-Typ.Während der kontinuierlichen Wirkstoffapplikation wurde eine Verringerung der Aktionspotentialdauer um 41,5 % bei 90 % Repolarisation beobachtet, was auf die Funktionalität der auf Fluoreszenzspannungsindikatoren basierenden Bildgebung als Plattform für prospektive kardiale Wirkstoffscreening-Studien mit hohem Durchsatz hindeutet. Es ist wichtig zu bedenken, dass, obwohl der in dieser Studie verwendete spannungsempfindliche Farbstoff weniger zytotoxisch ist als andere, das Anregungslicht dennoch sparsam eingesetzt werden sollte, um die zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten. Die in diesem Protokoll verwendeten modulatorischen Photometriegeräte sind unglaublich vielseitig.So kann es beispielsweise für die gleichzeitige Messung anderer elektrophysiologischer Parameter, wie z.B. intrazelluläres Kalzium, verwendet werden.

single-cell-optical-action-potential-measurement-human-induced

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die elektrophysiologische Charakterisierung von Kardiomyozyten, die aus menschlichen Pluripotenten Stammzellen (hPSC-CMs) stammen, ist entscheidend für die Modellierung von Herzkrankheiten und für die Bestimmung von Arzneimittelwirkungen. Dieses Protokoll liefert die notwendigen Informationen, um hPSC-CMs auf Multi-Elektroden-Arrays zu dissoziieren und zu plattieren, ihr Feldpotential zu messen und ein Verfahren zur Analyse von QT- und RR-Intervallen zu verwenden.

Elektrophysiologische Analyse von humanen Pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Kardiomyozyten (hPSC-CMs) unter Verwendung von Multi-Elektroden-Arrays (MEAs)

Hier präsentieren wir eine Methode, um optisch Bild Aktionspotentiale, insbesondere ventrikuläre erinnernden induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Kardiomyozyten. Die Methode basiert auf der Projektträger-gesteuerte Ausdruck eines Spannung-empfindlichen fluoreszierenden Proteins.

Subtyp-spezifische optische Aktionspotential Aufnahmen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet ventrikuläre Kardiomyozyten

Dieser Artikel enthält eine Reihe von Protokollen für die Entwicklung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CM) Netzwerken, die auf Multiwell-MEA-Platten kultiviert werden, um die Zellmembran für Aktionspotenzialmessungen reversibel zu elektroporatieren. Hochdurchsatzaufzeichnungen werden von denselben Zellstandorten wiederholt über Tage hinweg abgerufen.

Human iPSC-Derived Cardiomyozyte Networks auf Multiwell Micro-Elektroden-Arrays für recurrent Action Potential Recordings

Human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) haben sich als vielversprechendes In-vitro-Modell für das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Krankheitsmodellierung herausgestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der Kontraktilität und Elektrophysiologie von hiPSC-CMs.

Technische Anwendungen von Mikroelektrodenarray- und Patch-Clamp-Aufnahmen an humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Die Kombination aus Laserporation und Mikroelektrodenarrays (MEA) ermöglicht aktionspotentialartige Aufnahmen von kultivierten Primär- und Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten. Die Wellenformform bietet einen besseren Einblick in die Wirkungsweise von Testverbindungen als Standardaufzeichnungen. Es verbindet Patch-Clamp und MEA-Anzeige, um die kardiosichere Forschung in Zukunft weiter zu optimieren.

Laserinduzierte Aktionspotential-ähnliche Messungen von Kardiomyozyten an Mikroelektrodenarrays für erhöhte Vorhersagbarkeit der Sicherheitspharmakologie

Humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) bieten eine Alternative zur Verwendung von Tieren für das präklinische Kardiotoxizitäts-Screening. Eine Einschränkung für die weit verbreitete Einführung von hiPSC-CMs im präklinischen Toxizitätsscreening ist der unreife, fetale Phänotyp der Zellen. Hier werden Protokolle für eine robuste und schnelle Reifung von hiPSC-CMs vorgestellt.

Hochdurchsatz-Kardiotoxizitäts-Screening unter Verwendung von reifen, humaninduzierten pluripotenten Stammzell-Kardiomyozyten-Monoschichten

Hier demonstrieren wir eine nicht-invasive Methode zur Bewertung der Kontraktilität von Herzmedizinprodukten unter Verwendung von 2D-Monoschichten aus humanen pluripotenten Stammzellen (hiPSC-CM), die auf einem flexiblen Substrat plattiert und mit videobasierter Mikroskopie gekoppelt sind. Dieses Tool wird für die In-vitro-Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von kardialen Elektrophysiologiegeräten nützlich sein.

Evaluierung der kardialen Kontraktilitätsmodulationstherapie in 2D-Kardiomyozyten aus humanen Stammzellen

Hier wird eine etablierte Methode beschrieben, um Kontraktilitäts- und Kalziummessungen in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unter Verwendung einer optischen Plattform durchzuführen. Diese Plattform ermöglicht es den Forschern, die Auswirkungen von Mutationen und die Reaktion auf verschiedene Reize schnell und reproduzierbar zu untersuchen.

Echtzeitmessungen von Kalzium- und Kontraktilitätsparametern in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Die Steuerung von Herzzellen und -gewebe mit Licht ermöglicht eine berührungslose Stimulation, wodurch der natürliche Zustand und die Funktion der Zellen erhalten bleiben, was sie zu einem wertvollen Ansatz sowohl für die Grundlagenforschung als auch für therapeutische Anwendungen macht.

Ein kardiales mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Ca2+ -Ausbreitung durch nicht-genetische optische Stimulation

Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie (OR-PAM) ist eine aufstrebende Technologie, mit der abbildenden optischen Absorption...

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Lernen Sie die optische Aktionspotentialmessung in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten. Diese Hochdurchsatzmethode vereinfacht die Elektrophysiologie für Toxizitätsscreenings.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

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