Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Dieses Protokoll kann Hochdurchsatzmessungen der zellulären Elektrophysiologie in einer Weise liefern, die der sich schnell entwickelnden Technologie der induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten entspricht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie weniger komplex und weniger arbeitsintensiv ist als die traditionelle Patch-Clamp-Technik, aber dennoch in der Lage ist, gleichwertige Ergebnisse zu erzielen. So kann dieses Protokoll für groß angelegte Toxizitäts-Screening-Programme mit humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten erweitert werden.

Zum Beispiel der umfassende in vitro Proarrhythmie-Assay. Um induzierte pluripotente Stammzell-Kardiomyozytenkulturen für das Experiment vorzubereiten, beschichten Sie zunächst einzelne 10 Millimeter runde Glas-Abdeckgläser mit der Nummer Null mit 150 Mikrolitern 1:60 Basalmembranmatrix in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Deckgläser vier Stunden lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die überschüssige Matrix von den Deckgläsern und tragen Sie das entsprechende Zellvolumen auf jeden Deckglas auf.

Nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius füllen Sie jede Vertiefung vorsichtig mit Galvanikmedium und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Zur Vorbereitung auf die spannungsempfindliche Farbstoffbildgebung statten Sie ein inverses Epifluoreszenzmikroskop mit einer Linse mit 40-facher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur aus und koppeln Sie eine schnell schaltende warmweiße LED an den Durchlichtanschluss. Setzen Sie einen einfachen roten 660-Nanometer-Filter in den Durchlichtweg ein und montieren Sie einen schnell schaltenden 470-Nanometer-LED-Kopf für die Photometrie-Aufnahme.

Setzen Sie einen 470/40-Anregungsfilter an der Epifluoreszenzöffnung ein, um das von der LED erzeugte Licht zu reinigen, und setzen Sie einen Mikroskopwürfel mit einem 495-Nanometer-Langpass-Strahlteiler in das Karussell der Spiegeleinheit innerhalb des Mikroskops ein. Setzen Sie einen Detektionsarm mit einer einstellbaren Feldblende in den C-Mount-Anschluss ein, um die Auswahl des interessierenden Bereichs zu ermöglichen, und koppeln Sie einen PMT-Detektor und eine USB-Kamera an das Mikroskop. Setzen Sie einen Filterwürfel mit einem 565-Nanometer-Langpass-Strahlteiler und einem 535/50-Emissionsfilter in den PMT-Anschluss ein, um das Emissionslicht zwischen den beiden Detektoren aufzuteilen.

Koppeln Sie den PMT an ein Netzteil und einen PMT-Verstärker und verbinden Sie den Ausgang des PMT-Verstärkers mit einem analogen Eingangspin eines Datenerfassungssystems. Um die Nyquist-Kriterien zu erfüllen und Aliasing zu verhindern, filtern Sie die analogen Daten aus dem PMT bei einem Kilohertz oder höher und digitalisieren Sie die Daten mit einer Frequenz, die mindestens doppelt so hoch ist wie die höchste Frequenz im analogen Signal. Um die Zellen mit spannungsempfindlichem Farbstoff zu beladen, mischen Sie fünf Mikroliter 1000x FluoVolt und 50 Mikroliter Power Load Solution und fügen Sie drei Mikroliter der resultierenden Ladelösung zu drei Millilitern erwärmter Tyrodelösung in einer Petrischale hinzu.

Geben Sie ein einzelnes mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenes Kardiomyozyten-beschichtetes Deckglas in die Schale und stellen Sie die Schale 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf. Montieren Sie eine beheizte Kammer für die Bildgebung lebender Zellen auf dem Mikroskoptisch und füllen Sie die Kammer mit 500 Mikrolitern frischer Tyrodenlösung. Waschen Sie dann den Deckbezug mit frischer Tyrode-Lösung bei 37 Grad Celsius und übertragen Sie den Deckbezug vorsichtig mit einer feinen Pinzette in die vorgewärmte Badekammer.

Um die zelluläre Dynamik und die experimentellen Parameter zu standardisieren, führen Sie zwei Platinelektroden im Abstand von fünf Millimetern in die Kammer ein und verbinden Sie die Elektroden mit einem externen Stimulator. Stellen Sie den Stimulator auf fünf Millisekunden bipolare Feldimpulse bei 0,5 Hertz ein und erhöhen Sie den Stimulus von einem Volt, bis sich die Zellen zusammenzuziehen beginnen. Stellen Sie dann die Spannung auf etwa 25 % über diesem Schwellenwert ein.

Verwenden Sie für die Erfassung des optischen Aktionspotentials den transmittierten Lichtweg und die USB-Kamera, um die Myozyten unter Hellfeldbedingungen zu visualisieren. Wählen Sie eine isolierte Zelle aus und verwenden Sie die Feldblende, um den Strahlengang eng zu beschneiden, um sicherzustellen, dass nur das Licht der interessierenden Zelle überwacht wird. Aktivieren Sie den PMT-Verstärker und stellen Sie die PMT-Versorgung auf 750 Volt ein.

Führen Sie das Stimulationsprotokoll zusammen mit der Erfassungssoftware aus und aktivieren Sie gleichzeitig das 470-Nanometer-Anregungslicht. Zeichnen Sie 10 Sweeps auf und stellen Sie sicher, dass stabile Aktionspotentiale erkannt werden. Bewegen Sie den Mikroskoptisch nach dem letzten Sweep sofort während der Aufnahme, um kurz ein Hintergrundsignal aus einer zellfreien Region zu erfassen und das Anregungslicht auszuschalten.

Um die Aktionspotentialdaten zu analysieren, öffnen Sie eine gespeicherte Aufzeichnung in der entsprechenden Analysesoftware und mitteln Sie 10 Sweeps mit stimulierten Aktionspotentialen aus einer einzelnen Zelle. Subtrahieren Sie den Mittelwert des Basissignals, das den Fluoreszenzversatz von der durchschnittlichen Kurve darstellt, und verwenden Sie dann die Formel, um die Fluoreszenzänderung unter Verwendung der diastolischen Fluoreszenz als F0 zu berechnen. Identifizieren Sie die diastolischen und aktionspotentiellen Interessenbereiche und messen Sie die gewünschten kardialen Aktionspotentialparameter, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Dauer bei 50 % und 90 % Repolarisation. Exportieren Sie dann die Daten aus dieser einzelnen Zelle in ein Tabellenkalkulationsprogramm.

Diese Methode ermöglicht eine schnelle und präzise Quantifizierung der Repolarisationsmechanik, was wertvolle Einblicke in zelluläre Ionenanomalien liefern kann. Ausgeprägte Phase-I-Merkmale können in optischen Signalen von murinen Kardiomyozyten beobachtet werden, die sich morphologisch von denen von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unterscheiden. Darüber hinaus reagieren humane induzierte pluripotente Stammzellabgeleitete Kardiomyozyten auf pharmakologische Manipulation mit Nifedipin, einem bekannten Calciumkanalantagonisten vom L-Typ.

Während der kontinuierlichen Wirkstoffapplikation wurde eine Verringerung der Aktionspotentialdauer um 41,5 % bei 90 % Repolarisation beobachtet, was auf die Funktionalität der auf Fluoreszenzspannungsindikatoren basierenden Bildgebung als Plattform für prospektive kardiale Wirkstoffscreening-Studien mit hohem Durchsatz hindeutet. Es ist wichtig zu bedenken, dass, obwohl der in dieser Studie verwendete spannungsempfindliche Farbstoff weniger zytotoxisch ist als andere, das Anregungslicht dennoch sparsam eingesetzt werden sollte, um die zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten. Die in diesem Protokoll verwendeten modulatorischen Photometriegeräte sind unglaublich vielseitig.

So kann es beispielsweise für die gleichzeitige Messung anderer elektrophysiologischer Parameter, wie z.B. intrazelluläres Kalzium, verwendet werden.