Name: Aufbau eines einfachen und vielseitigen Beleuchtungssystems für optogenetische Experimente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Lernen Sie den Aufbau eines vielseitigen Beleuchtungssystems für optogenetische Experimente mit rotem und infrarotem Licht. Diese Methode ermöglicht die präzise Steuerung der Genexpression in verschiedenen Proben.

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Wir möchten uns bei Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang und Molly Allen dafür bedanken, dass sie während der Entwicklung verschiedene Versionen des LED-Systems getestet haben. Diese Arbeit wurde vom Kavli Institute for Brain and Mind an der UC San Diego und dem Salk Institute, National Science Foundation durch das NSF Center for Science of Information unter Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 und NIH Grant R21DC018237 unterstützt.

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<li>Khamo, J. S., Krishnamurthy, V. V., Sharum, S. R., Mondal, P., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+optobiology+in+intact+cells+and+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Applications of optobiology in intact cells and multicellular organisms.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (20), 2999-3017 (2017).</li>
<li>Mansouri, M., Strittmatter, T., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-controlled+mammalian+cells+and+their+therapeutic+applications+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Light-controlled mammalian cells and their therapeutic applications in synthetic biology.</a> Advanced Science. 6 (1), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 1800952(2019).</li>
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<li>Allen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AND-gated+drug+and+photoactivatable+Cre-loxP+system+for+spatiotemporal+control+in+cell-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An AND-gated drug and photoactivatable Cre-loxP system for spatiotemporal control in cell-based therapeutics.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (10), electronic resource 2359-2371 (2019).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+light-controllable+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Science Advances. 6 (8), (2020).</li>
<li>Mancinelli, A. L., Rossi, F., Moroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptochrome%2C+phytochrome%2C+and+anthocyanin+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cryptochrome, phytochrome, and anthocyanin production.</a> Plant Physiology. 96 (4), 1079-1085 (1991).</li>
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<li>Bugaj, L. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+multicolor+optogenetics+in+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates.</a> Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).</li>
<li>Repina, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+illumination+devices+for+optogenetic+control+of+cellular+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics.</a> Cell Reports. 31 (10), 107737(2020).</li>
<li>Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gene+expression+using+a+red-+and+far-red+light-responsive+bi-stable+toggle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Control of gene expression using a red- and far-red light-responsive bi-stable toggle switch.</a> Nature Protocols. 9 (3), 622-632 (2014).</li>
<li>Gerhardt, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-hardware+platform+for+optogenetics+and+photobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An open-hardware platform for optogenetics and photobiology.</a> Scientific Reports. 6, 35363(2016).</li>
<li>Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet-B-mediated+induction+of+protein-protein+interactions+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells.</a> Nature Communications. 4, 1779(2013).</li>
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<li>Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+pairs+of+distinct+photoswitches+for+optogenetic+control+of+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins.</a> Nature Communications. 6, 6256(2015).</li>
<li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-stable+neural+state+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bi-stable neural state switches.</a> Nature Neuroscience. 12 (2), 229-234 (2009).</li>
<li>Gong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-sensitive+step-function+opsin+for+minimally+invasive+optogenetic+stimulation+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation in mice and macaques.</a> Neuron. 107 (1), 38-51 (2020).</li>
<li>Kennedy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+second-generation+CRY2-CIB+dimerizers+and+photoactivatable+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 425-430 (2016).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Das hier beschriebene LED-System wurde in unserem Labor verwendet, um verschiedene optogenetische Werkzeuge zu optimieren, zu charakterisieren und mit ihnen zu arbeiten. In Kyriakakis et al.4 haben wir viele Kombinationen von PhyB-PIF-Genschaltern parallel getestet. Wir haben dieses System dann verwendet, um Lichtimpulse mit verschiedenen Frequenzen zu testen, um die Genschalterkinetik und die effektive Lichtintensität zu messen. Dieses System wurde auch verwendet, um zwei optogenetische Systeme zu optimieren und zu charakterisieren, die blaues Licht für die Stimulation 5,6 verwenden. Da nur eine LED hell genug sein muss, um die meisten optogenetischen Werkzeuge zu aktivieren, ist es nicht immer notwendig, ein System mit einer großen Anzahl von LEDs über jeder Vertiefung zu kaufen. Dieses Setup ist kostengünstig, zuverlässig, einfach zu rekonfigurieren und erfordert keine elektrischen Vorkenntnisse, um das Montageprotokoll zu befolgen.
In den ergänzenden Ergänzungsabbildungen 31–38 beschreiben wir, wie bis zu vier LEDs in das System integriert werden können. Während dies einige Experimente einschränken kann, die eine große Anzahl von parallelen Bedingungen erfordern, können mehr LEDs hinzugefügt werden, indem die in diesem Protokoll verwendete 9-Volt-Stromversorgung durch eine höhere Wattzahl ersetzt wird. Ebenso können mehrere LEDs mit geringerer Leistung parallel zu jedem Stromkreis angeschlossen werden. In dieser letzteren Anordnung werden einige LEDs nicht einzeln angesteuert, aber dies kann nützlich sein, wenn viele LEDs benötigt werden, um einen größeren Bereich abzudecken. Sobald Sie mit der Elektronik dieses Systems vertraut sind, gibt es viele Möglichkeiten, es anzupassen. Weitere Strategien zur Anpassung des Systems umfassen die Platzierung der LED weiter oder näher an der Probe und die Beleuchtung durch Filter/Diffusoren für homogene Beleuchtungsbedingungen oder zur Verhinderung von Erwärmung wie in (ergänzende Abbildung 23) und Allen et al.5. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal unseres LED-Designs ist, dass es in Epoxidharz gekapselt ist und einen Touch-Verschluss auf der Rückseite hat. Dadurch kann die LED praktisch überall sicher und einfach platziert werden: in Inkubatoren, Aquarien, Tierkäfigen, Wänden usw.
Viele Experimente, die Optogenetik verwenden, um Gene, Signalwege und andere zelluläre Aktivitäten zu kontrollieren, erfordern oft Pulse, erstrecken sich über große Zeitskalen oder müssen in einem Inkubator durchgeführt werden, was eine Automatisierung oder Fernmanipulation ohne Mikroskop erfordert. Dieses LED-System wurde über mehrere Monate kontinuierlich in einem befeuchteten CO2 -Inkubator ohne Probleme getestet. Darüber hinaus muss der Experimentator bei reversiblen Systemen wie optogenetischen PhyB-Systemen möglicherweise spezifische pulsierende Beleuchtungspläne programmieren. In unserer vorherigen Arbeit4 haben wir pulsierende Programme verwendet, um die Reversibilitätsdynamik eines PhyB-PIF3-Schalters in Säugetierzellen über die Benutzeroberfläche zu testen. Mit der in diesem Manuskript beschriebenen Methodik ist die Programmierung eines Pulsprotokolls einfach und bietet die Flexibilität und Autonomie, die für viele Arten von optogenetischen Experimenten auf benutzerfreundliche Weise erforderlich sind.
Zu den wichtigsten Schritten beim Aufbau dieses Systems gehören das Zusammensetzen der elektrischen Schaltung auf der Leiterplatte und das Anschließen der Komponenten, die in Abschnitt 1 und Abschnitt 2 beschrieben sind. Es ist wichtig, jeden Schritt in diesen Abschnitten sorgfältig zu befolgen und die Lochnummern Zeile für Zeile zu überprüfen, bevor jede Komponente gelötet wird. In Abschnitt 2 wird erläutert, wie die Komponenten eingerichtet werden, die an den Stromkreis angeschlossen werden. Damit sich die Komponenten in der richtigen Ausrichtung verbinden, ist es besonders wichtig, darauf zu achten, dass die Farben der schwarzen und roten Drähte an den Wire-to-Wire-Steckverbindern übereinstimmen. Kleine Versäumnisse in diesen beiden Abschnitten werden sich sehr wahrscheinlich auf die Funktionalität des Systems auswirken. In der Tat besteht der erste Schritt bei der Fehlerbehebung dieser Methode darin, zu überprüfen, ob die Schaltung korrekt aufgebaut wurde und ob alle Verbindungen vorhanden sind. Zweitens ist die Überprüfung der Lötqualität auf lose Verbindungen und der Drähte auf aufplatzende Drahthaare, die den Stromkreis kurzschließen können, von besonderer Bedeutung. Ein dritter Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass die LEDs korrekt funktionieren, was über ein Netzteil oder eine 1,5-V-Batterie erfolgen kann, indem die beiden Anschlüsse der LED mit Krokodilklemmen beschnitten werden. Eine weitere potenziell kritische Überlegung ist die Vermeidung von Erwärmung (wenn die LEDs mit hoher Leistung verwendet werden) oder die Streuung des Lichts für eine breitere Beleuchtung. Um diesen Überlegungen Rechnung zu tragen, können die LEDs außerhalb einer Blackbox mit "Sichtschutzfolie" auf der Innenseite montiert werden, wie in Ergänzende Abbildung 23 und Allen et al.5 beschrieben. Aufgrund der Einfachheit dieses Systems ist es nicht schwierig, es auseinanderzunehmen, um modulare Komponenten zu überprüfen, zu modifizieren, zu aktualisieren oder zu reparieren.
Ein weiterer kritischer Faktor für induzierbare Gensysteme ist die Überlegung, wie viel Aktivierung erforderlich ist oder wie viel Undichtigkeit für das zu kontrollierende biologische System akzeptabel ist. Wie in Abbildung 6 dargestellt, können diese mit der Menge an Reporter-DNA variieren. Darüber hinaus variiert die Transfektionseffizienz und damit die Kopienanzahl der Reporterkonstrukte in jeder Zelle. Es kann für einige Experimente vorteilhaft sein, eine Zelllinie mit einer festen Menge an Reporter- oder PhyB-Genschalterkomponenten herzustellen und nach Klonen mit dem gewünschten induzierten Expressionsbereich zu suchen, wie es üblicherweise bei medikamenteninduzierbaren Systemen der Fall ist. Aufgrund der Größe und Instabilität des lentiviralen Plasmids pPK-2304 haben wir auch nicht-lentivirale Plasmidversionen des PhyB-Schalters im pcDNA-Backbone pPK-351 (Addgene #157921) und pPK-352 (Addgene #157922) hergestellt.
Durch den Bau dieses LED-Beleuchtungssystems nach diesem Protokoll verfügen die Benutzer über alle notwendigen Komponenten, um eine Vielzahl von optogenetischen Experimenten in vitro und in vivo durchzuführen. In Kombination mit den Anweisungen für die Verwendung von PhyB-PIF3 in Säugetierzellen wird dieses Protokoll es Nicht-Ingenieuren und Biologen ermöglichen, die PhyB-basierte Optogenetik flexibel und effektiv in einer Vielzahl von Kontexten einzusetzen.

Optogenetische Werkzeuge werden allgegenwärtig und es werden ständig neue Technologien entwickelt, um biologische Prozesse wie Genexpression, Zellsignalisierung und vieles mehr optisch zu steuern 1,2,3. Die Fähigkeit, zelluläre Prozesse mit Licht zu steuern, ermöglicht eine schnelle Kinetik, eine enge räumliche Kontrolle und eine dosisabhängige Regulierung, die durch Lichtintensität und Belichtungszeit gesteuert werden kann. Um diese Werkzeuge verwenden zu können, ist ein Gerät zur Steuerung dieser Parameter erforderlich. Wir haben kürzlich einen genetisch kodierten PhyB-PIF3-Genschalter für Säugetiere entwickelt, der Gene mit rotem/tiefrotem Licht reversibel aktiviert und deaktiviert4. Dieses System wurde in mehreren Säugetierzelllinien getestet und ermöglichte die beispiellose Induktion der Genexpression auch bei sehr geringen Lichtmengen, einschließlich Lichtimpulsen. Forscher, die den PhyB-Schalter und ähnliche Werkzeuge 5,6 verwenden möchten, fragen häufig nach Informationen über Methoden zur Steuerung der Beleuchtungsintensität und -dauer. Daher haben wir dieses Protokoll mit Schritt-für-Schritt-Anleitungen entwickelt, um eine breitere Akzeptanz dieser Werkzeuge für die Optogenetik zu ermöglichen.
Vor der weit verbreiteten Verwendung von LEDs wurden breitbandige Lichtquellen mit Filtern verwendet, um lichtempfindliche Proteine wie Phytochromezu untersuchen 7. In jüngster Zeit wurden einige LED-Beleuchtungssysteme zusammen mit optogenetischen Werkzeugen 8,9,10,11,12 veröffentlicht, aber diese Protokolle können erhebliche Fachkenntnisse in Elektronik / Software erfordern, spezielle Ausrüstung erfordern (z. B. 3D-Drucker, Laserschneidemaschinen oder Fotomasken) oder nicht die Schritt-für-Schritt-Anweisungen liefern, die einige Forscher für ihre Forschungsbedürfnisse einsetzen müssten. Während die unabhängige Kontrolle einzelner Vertiefungen in einer Multiwell-Platte nützlich sein kann, ist sie oft unnötig, wenn Forscher nur mehrere verschiedene Proben in hellem und dunklem oder rotem Licht im Vergleich zu dunkelrotem Licht vergleichen müssen. Außerdem sind viele bestehende kommerzielle Systeme teuer und können nur eingeschränkt angepasst werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen LEDs sind jedoch kostengünstig, hell und können auf viele Arten montiert werden. Daher können sie verwendet werden, um verschiedene Arten von Proben zu beleuchten. Mit dem mitgelieferten Protokoll und der mitgelieferten Software können LEDs im Bereich von Ultraviolett (UV) bis NIR verwendet und mit Software gesteuert werden, um optogenetische Experimente mit UVR8 13,14, Dronpa 15,16, LOV-Domänen 17,18, Step Function Opsins 19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 durchzuführen ,25, bakterielle Phytochrome26,27,28,29 und andere lichtempfindliche Systeme 30,31,32.
Dieses Protokoll stellt ein Tutorial für den Aufbau der Schaltkreise und anderer Hardware dar, die zur Steuerung verschiedener Parameter für die Lichtstimulation benötigt werden, sowie für die molekularen / zellulären Werkzeuge zur Durchführung eines optogenetischen Experiments. Darüber hinaus berichten wir über Plasmide, die von Kyriakakis et al.4 optimiert wurden und für das Klonen kleiner und stabiler sind. Durch dieses Protokoll können Biologen ohne Erfahrung in Elektronik und Optik Beleuchtungssysteme bauen, die flexibel und robust sind. In einer Schritt-für-Schritt-Art zeigen wir, wie man LED-Systeme baut, um den technischen Engpass für die breitere Einführung optogenetischer Werkzeuge zu beseitigen. Dieses System kann problemlos in den meisten Zellkultur-Inkubatoren verwendet werden, auch wenn sie keine Drahtanschlüsse enthalten. Zum Beispiel haben wir das LED-System in einem befeuchteten CO2 -Inkubator für mehr als 6 Monate kontinuierlich ohne Leistungseinbußen gehalten. Wir erklären auch, wie Sie das LED-System an einen Computer anschließen und mit Open-Source-Software verbinden, die wir auf GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces) zur Verfügung stellen. Der Aufbau eines Systems mit diesem Protokoll bietet Forschern das grundlegende Wissen, um potenzielle Probleme zu beheben, Teile zu ersetzen und Funktionalitäten zu verbessern / zu erweitern.
Systemübersicht
Der Aufbau des Beleuchtungssystems umfasst (1) den Aufbau der elektronischen Schaltung, (2) den Aufbau der Peripheriegeräte (Netzkabel, Netzschalter usw.), (3) den Aufbau der LEDs, (4) den Zusammenbau all dieser Komponenten und (5) die Installation der Software zur Steuerung der LEDs mit einer Benutzeroberfläche (Abbildung 1A). Nach der Fertigstellung kann das Beleuchtungssystem bis zu vier LEDs unabhängig voneinander über eine Benutzeroberfläche steuern (Abbildung 1B). Die Benutzeroberfläche ermöglicht es, dass jede LED in bestimmten Zeitintervallen pulsiert und nach einer bestimmten Zeit abschaltet. Es gibt auch eine Startverzögerung, um Beleuchtungsprogramme zu einem bestimmten Zeitpunkt zu starten. Potentiometer (POTs) regeln die Intensität jeder LED unabhängig voneinander oder können zur manuellen LED-Steuerung ohne Computer verwendet werden. Die Drähte zu den LEDs können beliebig lang sein, so dass sie einfach in einem Inkubator oder Laborraum platziert werden können. Aufgrund der hohen Leistung dieser LEDs können sie verwendet werden, um eine große Fläche mit einer einzigen LED aus der Ferne zu beleuchten.
Beschreibung des LED-Treibers
Um die Intensität der LEDs mit Strom zu versorgen und zu steuern, durchläuft dieses Protokoll Schritte, um einen "LED-Treiber" zu erstellen. Jede LED hat einen bestimmten Spannungsbereich, in dem sie arbeitet (Abbildung 1C). Während des Betriebs kann die Ausgangsspannung des Reglers, die die Lichtintensität steuert, über ein Potentiometer eingestellt werden. Der POT variiert den Widerstand und passt die Ausgangsspannung / Helligkeit an. Das Tuning mit einem 1kΩ (1 Kiloohm) POT ergibt das, was wir als "Hochspannungsschaltung" bezeichnen und einen Bereich von 1,35 V bis 2,9 V haben. Da 2,9 V für den Betrieb der LEDs mit niedrigerer Spannung zu hoch sind (Abbildung 1C), zeigen wir eine einzelne Modifikation (Widerstand 3 oder "R3" Zusatzabbildung 1A), die den Bereich auf die Niederspannungs-LEDs begrenzt. R3 dient dazu, die maximale Spannung, die an die LEDs angelegt wird, auf 1,85 V zu senken (Baugruppe siehe ergänzende Abbildung 8), wenn sie parallel zum Potentiometer angeordnet ist. Durch die Verwendung von Spannung zur Steuerung der Helligkeit anstelle von Strom ist das System flexibler für LEDs mit unterschiedlichen Betriebsspannungen. Abbildung 1C enthält eine Liste der Hoch- und Niederspannungs-LEDs, um die optimale Schaltungsauswahl zu unterstützen. Dieses Design hält die Mindestspannung niedrig genug, so dass die LED vollständig ausgeschaltet ist, wenn das Potentiometer ausgeschaltet ist und die Spannung nicht über die typische Betriebsspannung der LED steigt. Für die PhyB-Optogenetik verwenden wir tiefrote und tiefrote LEDs, die die Niederspannungsschaltung nutzen.
Beschreibung des LED-Computersteuerungssystems
Das LED-Beleuchtungssystem kann für eine konstante Beleuchtung ohne Computer oder Mikrocontroller verwendet werden. Für pulsierende Programme und für die Steuerung einzelner LED-Timings muss jedoch ein Mikrocontroller installiert werden. Um einen Mikrocontroller zur Steuerung der LEDs zu verwenden, wird ein Transistor benötigt, um den Mikrocontroller mit der Schaltung zu verbinden. Dieser Transistor erfasst die Spannung des Mikrocontrollers und schaltet von leitfähig oder isolierend um. Um das "Ein" und "Aus" zu steuern, verwenden wir einen sogenannten "NPN-Schalttransistor" (2N2222) als steuerbaren Shunt über R2 (ergänzende Abbildung 1A). Wenn die Spannung des Mikrocontrollers an die Transistorbasis angelegt wird, wird der Transistor leitfähig und macht die LED-Spannung niedrig, wodurch die LED ausgeschaltet wird. So werden die Ein- und Ausschaltzustände von LED und Transistor direkt vom Mikrocontroller gesteuert, der von der auf dem PC installierten Software gesteuert wird.
Für die Herstellung des Beleuchtungssystems sind die folgenden Schritte erforderlich: Bauen Sie den Stromkreis auf; Aufbau der Stromversorgung, des manuellen Netzschalters, der POTs und der Mikrocontroller-Verbindung; bauen Sie die LEDs; Platz für eine Blackbox für das Beleuchtungssystem; Schließen Sie alle Kabel und Geräte an. Installieren Sie die LED-Steuerungssoftware, stimulieren Sie die Zellen mit Licht; Messen Sie die Genexpression mit einem dualen Luciferase-Assay.

<table><tbody><tr><td>18AWG 2pin ROT Schwarzes Kabel</td><td>Amazon</td><td>15M-28AWG-2468</td><td>Preiswertes Kabel zum Anschluss von LEDs an den Stromkreis. https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>1K Ohm Potentiometer</td><td>Amazon</td><td>52161500</td><td>2 x 1K Ohm Potentiometer Potential + 2 x schwarzer Drehknopf. https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>20 Gauge Silikon JST Steckverbinder</td><td>Amazon</td><td>SIM& NAT 5,9 Zoll 2-polige männliche JST RCY-Steckverbinder</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>22 AWG massive Überbrückungsdrähte</td><td>Amazon</td><td>WJW-60B-R</td><td>Jameco Valuepro WJW-60B-R Drahtüberbrückungssatz 350 je 22 AWG, 14 Längen 10 Farben 25 von jeder Länge. https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>560 Ohm 1/2Watt 1% Toleranz</td><td>Amazon</td><td>a14051600ux0301</td><td>Uxcell a14051600UX0301 60 Stück axiale Leitung 1% Toleranz Farbiger Ring Metallfilm Widerstandswiderstand, 560 Ohm 1/2W. https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN</td></tr><tr><td>820 Ohm 1/2Watt 1% Toleranz</td><td>Amazon</td><td>TTL-A-8035-50Ea</td><td>Satz mit 50Ea Metallfilmwiderstand 820 Ohm 1% 1/2W (0,5W). https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor</td></tr><tr><td>A Stecker auf B Stecker Kabel (10 Fuß)</td><td>Amazon</td><td>Teil# 30-001-10B</td><td>Das Kabel, das mit dem Arduino geliefert wird, passt nicht gut in die Box. https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Ardiuino UNO äquivalent</td><td>Amazon</td><td>Elegoo EL-CB-001</td><td>UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 mit USB Kabel für Arduino. https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Arduino Halterung</td><td>Digikey</td><td>X000018</td><td>Passt sehr eng anliegend. https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632</td></tr><tr><td>Black Boxen für Stromkreise und Lichtkammern</td><td>Amazon</td><td>1591ESBK</td><td>Hammond 1591ESBK ABS Project Box Schwarz. https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Blaue LED</td><td>Digikey</td><td>LXML-PB01-0040</td><td>LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Verwendet "Saber 20 mm Star Base" https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134</td></tr><tr><td>Kabelbinder</td><td>Amazon</td><td>sd027</td><td>Tarvol Nylon Kabelbinder (100er Pack) 8 Zoll mit selbstsichernden Kabelbindern (Weiß). https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Command Fridge Clips</td><td>Amazon</td><td>17210CLR</td><td>Clips zum Halten der Platine im Inneren der Blackbox. Es können auch Befehlsstreifen verwendet werden. https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Cyan LED</td><td>Digikey</td><td>LXML-PE01-0070</td><td>LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Verwendet "Saber 20 mm Star Base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd</td></tr><tr><td>Isolierband - 3M Scotch #35 Isolierband Value Pack</td><td>Amazon</td><td>03429NA</td><td>Scotch 700 Isolierband, 03429NA, 3/4 Zoll x 66 ft. https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK</td></tr><tr><td>Farred LED 720nm</td><td>Luxeon Star LEDs</td><td>LXML-PF01</td><td>Fernrot (720 nm) LUXEON Rebel LED. Verwendet "Saber 20 mm Star Base" https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW</td></tr><tr><td>Farred LED 740nm</td><td>Ushio</td><td>EDC740D-1100-S5</td><td>Verwendet "STAR XP 3535" Base https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf</td></tr><tr><td>Farred LED 780nm</td><td>Ushio</td><td>EDC780D-1100</td><td>Verwendet "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf</td></tr><tr><td>Farred LED 810nm</td><td>Ushio</td><td>EDC810D-1100</td><td>Verwendet "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf</td></tr><tr><td>Farred LED 850nm</td><td>Ushio</td><td>EDC850D-1100</td><td>Verwendet "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf</td></tr><tr><td>Ösen</td><td>Amazon</td><td>Pico 6120D</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G</td></tr><tr><td>Haar-/Krokodilklemmen</td><td>Amazon</td><td></td><td>1-3/4 Zoll (45 mm)- Haarspangen Single Prong Metall Krokodil Clips Haarschleife Zubehör - Silber, 50 Stk. https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>LED-Basis</td><td>Luxeon Star LEDs</td><td>LXB-RS20A</td><td>Säbel 20 mm Star Blank Aluminium MCPCB Basis für Rebel LEDs https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds</td></tr><tr><td>LED PCB für Ushio LEDs</td><td>Adura LED-Lösungen</td><td>STAR XP 3535 Package LED</td><td>Passend für viele andere LEDs von Ushio http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led</td></tr><tr><td>Loctite Epoxy Clear Mehrzweckspritze mit 0,85 Unzen</td><td>Amazon</td><td>1943587</td><td>Loctite Epoxy Clear Mehrzweckspritze mit 0,85 Unzen. https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C</td></tr><tr><td>NTE Schrumpfschlauch 2:1 Verschiedene Farben und Größen 160 Stück</td><td>Amazon</td><td>B000FIDTYG</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Bild hängende Velcro Streifen</td><td>Amazon</td><td>PH204-16NA</td><td>Mit diesen können Sie die LEDs an vielen Stellen aufhängen. https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H</td></tr><tr><td>Netzteil</td><td>Amazon</td><td>tb013</td><td>Jeder andere 9V 1,5Z AC/DC-Wandler reicht aus, da wir das Ende sowieso abschneiden. https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Netzschalter Wippschalter</td><td>Amazon</td><td>SIXQJZML</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011</td></tr><tr><td>Rechtecksteckverbinder - für gecrimpte Drähte</td><td>Digikey</td><td>2183-1905-ND</td><td>6 rechteckige Steckverbinder - Gehäuse schwarz 0,100" (2,54 mm) https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB</td></tr><tr><td>Rote LED</td><td>Digikey</td><td>LXM3-PD01</td><td>LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Verwendet "Säbel 20 mm Sternbasis" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd</td></tr><tr><td>Schleifpapier</td><td>Amazon</td><td>B002NEV6GS</td><td>3M Wetordry Schleifpapier, 03022, 800 Körnung, 3 2/3 Zoll x 9 Zoll. https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1</td></tr><tr><td>Lötmittel zum Löten von Drähten und Schaltungskomponenten</td><td>Amazon</td><td>Mudder Bleifreier Lötdraht Sn99 Ag0,3 Cu0,7 mit Kolophoniumkern zum elektrischen Löten 0,22 lbs (0,6 mm)</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY</td></tr><tr><td>lötbares Steckbrett zum Aufbau der Schaltung</td><td>Amazon</td><td>GK1007</td><td>Gikfun lötbares Steckbrett mit vergoldetem Finish Proto-Platine PCB DIY Kit für Arduino (Packung mit 5 Stück) GK1007. https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1</td></tr><tr><td>Spatenbohrer</td><td>Amazon</td><td>Irwin 88811</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit</td></tr><tr><td>Transistor</td><td>Newark</td><td>2N2222A</td><td>Kann an vielen Orten gekauft werden. http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197</td></tr><tr><td>Spannungsregler</td><td>Newark</td><td>LM317T</td><td>Entspricht NTE956. https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|gleiten||Produkt||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|& s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!! g!! LM317T& CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC</td></tr><tr><td>Windows 10 Tablet</td><td>Amazon</td><td>B08BYTT79Y</td><td>Jeder Windows 10 PC ist geeignet.<br/</td></tr><tr><td>> https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1Zellkulturreagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menschliche embryonale Niere 293 Zellen HEK293</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1573</td><td>Gemeinsame Zelllinie. https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher</td><td>26140079</td><td>Diese sind sehr häufig und es gibt viele Äquivalente. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079</td></tr><tr><td>Dulbecco" s Modifizierter Eagle</td><td>ThermoFisher</td><td>11965 mit mittlerem Glukosegehalt&minus; 092</td><td>Diese sind sehr häufig und es gibt viele Äquivalente. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118</td></tr><tr><td>10.000 Einheiten/ml Penicillin und 10.000 & Mikro; g/ml Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122</td></tr><tr><td>Weiße Corning 96-Well Festplatten aus schwarzem oder weißem Polystyrol</td><td>ThermoFisher</td><td>07-200-589</td><td>Weiße Teller werden bevorzugt. Verwenden Sie keine durchsichtigen Platten. https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852</td></tr><tr><td>PEI MAX - Transfektionsqualität Lineares Polyethyleniminhydrochlorid (MW 40.000)</td><td>PolySciences</td><td>24765-1</td><td>Kann durch ein anderes Transfektionsreagenz ersetzt werden. https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name des Geräts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zenitschneiderzange (110mm)</td><td>Amazon</td><td>Proskit 1PK-037S</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11</td></tr><tr><td>Dremil 3000 mit Schneidwerkzeug und Schleifmaschine</td><td>Amazon</td><td>Dremel 3000</td><td>Dremel 3000-2/28 Rotationswerkzeugsatz mit variabler Drehzahl - 1 Aufsätze & 28 Zubehör- Schleifer, Schleifer, Polierer, Fräser und Gravierer. https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3</td></tr><tr><td>Dremil Schneid- und Schleifwerkzeug</td><td>Amazon</td><td>Dremel 200-1/15</td><td>Jedes ähnliche Dremil funktioniert. https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Dremil Schleifspitze</td><td>Amazon</td><td>Dremel 84922</td><td>Siliziumkarbid-Schleifstein. https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922</td></tr><tr><td>EDSYN Das Original Deluxe SOLDAPULLT</td><td>Amazon</td><td>DS017</td><td>Zum Entfernen von Löten/Fehlern. https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI</td></tr><tr><td>Helfende Hand mit Lupe</td><td>Amazon</td><td>SE MZ101B</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Spitzzange</td><td>Amazon</td><td>Hakko CHP PN-20-M</td><td>Stahl Super Specialty Mikrozange mit spitzer Nase und glatten Backen, 1,0 mm Nase. https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch</td></tr><tr><td>Kleine Schraube Treiber</td><td>Amazon</td><td>Wiha 26197</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set</td></tr><tr><td>Lötkolben</td><td>Amazon</td><td>Yihua 939D+ Digitale Lötstation</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR</td></tr><tr><td>TraceTech No-Clean Flussmittel-Stift</td><td>Amazon</td><td>2507-N</td><td>Tech Spray 2507-N No-Clean Flussmittel-Dosierstift, 11,5 mL. https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1</td></tr><tr><td>Weller WSA350 120V Tisch-Rauchabsorber</td><td>Amazon</td><td>WSA350</td><td>Für die Sicherheit beim Löten. https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK</td></tr><tr><td>Abisolierzange</td><td>Amazon</td><td>CSP-30-7</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7--Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG</td></tr><tr><td>IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm&sup2; 32-20AWG</td><td>Amazon</td><td>IWS-3220M</td><td>Diese sind sehr verbreitet und es gibt viele Äquivalente. https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1</td></tr></tbody></table>

aufbau eines einfachen und vielseitigen beleuchtungssystems für optogenetische experimente

Building a Simple and Versatile Illumination System for Optogenetic Experiments

Die Steuerung biologischer Prozesse mit Licht hat die Genauigkeit und Geschwindigkeit erhöht, mit der Forscher viele biologische Prozesse manipulieren können. Die optische Kontrolle ermöglicht eine beispiellose Fähigkeit, Funktionen zu analysieren, und birgt das Potenzial, neuartige Gentherapien zu ermöglichen. Optogenetische Experimente erfordern jedoch geeignete Lichtquellen mit räumlicher, zeitlicher oder Intensitätskontrolle, was für die Forscher oft ein Engpass darstellt. Hier erfahren Sie, wie Sie ein kostengünstiges und vielseitiges LED-Beleuchtungssystem bauen, das leicht an verschiedene verfügbare optogenetische Werkzeuge angepasst werden kann. Dieses System ist konfigurierbar für manuelle oder Computersteuerung mit einstellbarer LED-Intensität. Wir bieten eine illustrierte Schritt-für-Schritt-Anleitung für den Aufbau der Schaltung, die computergesteuerte Schaltung und den Aufbau der LEDs. Um die Montage dieses Geräts zu erleichtern, besprechen wir auch einige grundlegende Löttechniken und erklären die Schaltung, die zur Steuerung der LEDs verwendet wird. Mit unserer Open-Source-Benutzeroberfläche können Benutzer das präzise Timing und Pulsieren des Lichts auf einem PC oder einem kostengünstigen Tablet automatisieren. Diese Automatisierung macht das System nützlich für Experimente, die LEDs verwenden, um Gene, Signalwege und andere zelluläre Aktivitäten zu steuern, die sich über große Zeitskalen erstrecken. Für dieses Protokoll sind keine Vorkenntnisse in der Elektronik erforderlich, um alle benötigten Teile zu bauen oder das Beleuchtungssystem zur Durchführung optogenetischer Experimente zu verwenden.

Dieses Protokoll beschreibt, wie optogenetische Experimente zur Kontrolle der Genexpression mit rotem und tiefrotem Licht unter Verwendung von PhyB und PIF3 durchgeführt werden können. Enthalten sind Schritt-für-Schritt-Anleitungen für den Aufbau eines einfachen und flexiblen Beleuchtungssystems, das die Steuerung der Genexpression oder anderer Optogenetik mit einem Computer ermöglicht.

Aufbau eines einfachen und vielseitigen Beleuchtungssystems für optogenetische Experimente

Controlling biological processes using light has increased the accuracy and speed with which researchers can manipulate many biological processes. Optical ...

Das System ermöglicht es den Forschern, auf einfache Weise ein kostengünstiges und vielseitiges Beleuchtungssystem für optogenetische Experimente zu konstruieren. Zu den Vorteilen dieser Technik gehört die Möglichkeit, das LED-Beleuchtungstiming mit verfügbaren Wellenlängen zu programmieren, die sich über das sichtbare nahe IR-Spektrum erstrecken, und dass die LEDs in einer Vielzahl von Kontexten verwendet werden können. Um eine elektrische Schaltung zu erstellen, befestigen Sie die Leiterplatte an den helfenden Händen und führen Sie die Überbrückungsdrähte ein, um die A1- und A3-Löcher mit dem Boden zu verbinden. das D2-Überbrückungskabel in die D6-Lochblende und das Netzteil sowie die Nummer sieben Überbrückungsdrähte in die A7-Lochblende. Biegen Sie die Klemmen um 45 Grad und fügen Sie Flussmittel hinzu.Schneiden Sie nach dem Löten die Rückseiten der Drähte ab. Stecken Sie ein Ende der gelöteten Draht-zu-Draht-Buchse in die A5-Bohrung. Verbinden Sie dann ein Ende des Widerstands mit der A5-Bohrung.Verbinden Sie das andere Ende des Steckers mit der Erde. Verbinden Sie dann das andere Ende des Widerstands mit der Masse und löten Sie die Verbindung. Crimpen Sie beim Arduino-Anschluss die Enden der Draht-an-Draht-Steckverbinder und schieben Sie die gecrimpten Enden durch den rechteckigen Steckverbinder.Um die LEDs einzurichten, verzinnen Sie einen Draht, indem Sie ihn von unten erhitzen, während Sie von oben Lot hinzufügen. Legen Sie eine großzügige Menge Lot über die große Lötspitze und erwärmen Sie mit der Spitze den LED-Sockel an dem Kontakt, der den Fluss enthält. Ziehen Sie nach einigen Sekunden das Lot einzeln über jeden Kontakt und fixieren Sie den schwarzen Draht mit einer Haarspange auf der Kathode.Legen Sie eine großzügige Menge Lot auf die große Lötspitze und drücken Sie die Spitze auf den Draht, bis das Lot auf dem LED-Sockel schmilzt. Halten Sie den Draht fest und entfernen Sie den Lötkolben, während Sie den Draht an Ort und Stelle halten. Legen Sie eine kleine Menge Lötpaste auf die Pads für die LED-Anschlüsse und verwenden Sie eine Pinzette, um die LED über die Pads zu legen.Halten Sie den vorverzinnten roten Draht auf die Anode und verwenden Sie eine Haarspange, um den Draht zu befestigen. Fügen Sie Lot auf die große Spitze wie gezeigt hinzu und drücken Sie die Spitze auf die Verbindung, bis das Lot auf dem LED-Sockel schmilzt und die Lötpaste schmilzt und silbern wird. Um die LED-Drähte herzustellen, legen Sie einen 4,76-Millimeter-Schrumpfschlauch über den abgelängten Draht und einen 3,18-Millimeter-Schrumpfschlauch über den Draht-zu-Draht-Stecker.Streifen Sie die Drahtenden ab und fügen Sie Flussmittel hinzu. Verwenden Sie die helfenden Hände, um den Draht-zu-Draht-Stecker zu befestigen und das Steckerende mit einem Drahtende zu verdrehen. Löten Sie die Materialien zusammen und befestigen Sie den anderen Draht auf die gleiche Weise an der Einrichtung und löten Sie sie.Befestigen Sie dann die LED-Drähte mit Klebeband unter dem LED-Sockel an den helfenden Händen. Als nächstes mischen Sie Epoxidharz gemäß den Anweisungen des Herstellers und verteilen Sie das Epoxidharz auf der Oberseite der gelöteten LED. Bohren Sie mit dem Spatenbohrer ein 1,5 Zentimeter großes Loch durch die Oberseite des Gehäuses, auf dem die LED platziert wird, und verwenden Sie ein Hochgeschwindigkeits-Drehwerkzeug, um auf einer Seite des Lochs eine Kerbe zu machen, um Platz für den LED-Draht zu schaffen.Kleben Sie ein 25 bis 30 Millimeter großes Stück Sichtschutzfolie auf die Blackbox, die das Loch abdeckt, durch das die LED leuchtet, und kleben Sie die LED außerhalb der Blackbox auf das Loch. Bohren Sie für ein Vier-LED-Steuerungssystem vier 0,83 Zentimeter große Löcher im Abstand von 3,81 Zentimetern in den Deckel der Box und schneiden Sie mit einem Hochgeschwindigkeits-Rotationswerkzeug ein rechteckiges Loch von 1,19 x 1,90 Zentimetern in die obere linke Ecke. Bohren Sie mit einem Spatenbohrer ein 1,5 Zentimeter großes Loch in die Rückseite der Box und führen Sie eine Tülle in das Loch ein.Für die computergesteuerten LEDs schleifen Sie den Bereich, in dem der Mikrocontroller in die Box geklebt wird, sowie die Unterseite des Mikrocontrollerhalters. Befestigen Sie den Mikrocontroller an der Halterung und befestigen Sie die Halterung und die Box mit Epoxidharz, bevor Sie die Halterung in der schwarzen Box befestigen. Legen Sie dann doppelseitiges Klebeband auf den Clip und befestigen Sie den Clip in der Box.In Proben, die transfiziert wurden, um Phytochrom B, aber nicht Phycocyanin bilin zu exprimieren, nimmt die Undichtigkeit mit zunehmender Menge an Reporter-DNA zu. Wenn der gesamte Phytochrom-B-Genschalter, einschließlich des Phycocyanin-Bilin-Chromovier-produzierenden Plasmids, mit fernrotem Licht beleuchtet wird, steigt auch die Luciferase-Expression mit zunehmender Menge an Reporterkonstrukt innerhalb der Transfektionsmischung. Wenn die lichtempfindlichen Zellen mit rotem Licht beleuchtet werden, steigt auch die Luciferase-Expression mit zunehmender Reportermenge.Beim Vergleich der Induktionsniveaus der mit Rotlicht behandelten Zellen mit den mit fernem Rotlicht behandelten Zellen wird eine geringe Abnahme der Faltenaktivierung mit zunehmender Menge an Reporter festgestellt. Es ist wichtig, jeden Schritt beim Aufbau der elektrischen Schaltung sorgfältig zu befolgen und die Lochzahlen Zeile für Zeile zu überprüfen, bevor jede Komponente gelötet wird. Dieses Protokoll kann für die optische Stimulation vieler Arten von Proben oder optogenetischen Werkzeugen mit einer Vielzahl von Wellenlängen verwendet werden und ermöglicht die Programmierung von Beleuchtungsplänen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Aufbau eines einfachen und vielseitigen Beleuchtungssystems für optogenetische Experimente

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