Elektrisch-Feld-induzierte neuronale Vorläuferzelldifferenzierung in mikrofluidischen Geräten
14. April 2021
In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Differenzierung von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs) vor, das ausschließlich durch Gleichstrom-Pulsstimulation (DC) in einem mikrofluidischen System induziert wird.
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen vor, das ausschließlich durch Gleichstrompulsstimulation in einem mikrofluidischen System induziert wird. Diese Technik bietet einen vorteilhaften Ansatz zur Reduzierung der Versuchsaufbauzeit, des Probenvolumens und des Reagenzvolumens. Darüber hinaus eignet sich der MOE-Chip für konfokale Mikroskopiebeobachtungen.
Die einfache Gleichstrompulsbehandlung kann das Schicksal der neuronalen Vorläuferzellen der Maus steuern und könnte zur Entwicklung therapeutischer Strategien für Erkrankungen des Nervensystems verwendet werden. Zeichnen Sie zunächst Muster für einzelne PMMA-Schichten und das doppelseitige Band mit entsprechender Software. Schalten Sie den Kohlendioxid-Laserschreiber ein und schließen Sie ihn an einen PC an.
Öffnen Sie die entworfene Musterdatei mit der Software. Legen Sie die PMMA-Blätter oder das doppelseitige Band auf die Plattform des Laserschreibers und fokussieren Sie den Laser dann mit dem Autofokus-Werkzeug auf die Oberfläche der PMMA-Platten oder das doppelseitige Band. Wählen Sie den Laserschreiber als Drucker aus, und starten Sie dann den Laserschreiber, um die direkte Ablation auf dem PMMA-Blatt oder doppelseitigen Band zu starten.
Entfernen Sie die Schutzfolie von den PMMA-Platten und reinigen Sie die Oberfläche mit Stickstoffgas. Zum Verkleben mehrerer Schichten von PMMA-Platten drei Stücke von einem Millimeter PMMA-Platten stapeln und unter einem Druck von fünf Kilogramm pro Quadratzentimeter in einem thermischen Bonder für 30 Minuten bei 110 Grad Celsius verkleben, um die Strömungs- oder elektrische Stimulationskanal-Baugruppe zu bilden. 12 Stück Adapter in Schicht eins der MOE-Chip-Baugruppe mit schnell wirkendem Cyanoacrylatkleber an den einzelnen Öffnungen kleben.
Desinfizieren Sie die ein Millimeter PMMA-Substrate, das doppelseitige Band und das drei Millimeter optische PMMA mit ultravioletter Bestrahlung 30 Minuten lang, bevor Sie den Chip montieren. Verkleben Sie die ein Millimeter PMMA-Substrate auf dem drei Millimeter optischen PMMA mit dem doppelseitigen Klebeband, um die PMMA-Baugruppe zu vervollständigen. Das gereinigte Deckglas mit dem beidseitigen Klebeband an der PMMA-Baugruppe kleben.
Versiegeln Sie die Öffnungen der Agar-Brückenadapter mit weißen fingerdichten Steckern. Schließen Sie den flachen Bodenstecker über die mittleren Einlass- und Auslassadapter an die MOE-Chip-Baugruppe an, und schließen Sie dann den Kegel-Luer-Adapter an die Drei-Wege-Stoppcocks an. Fügen Sie zwei Milliliter 0,01%PLL-Lösung mit einer Drei-Milliliter-Spritze, die mit dem Drei-Wege-Stopcock des Mediums Einlass verbunden ist, und schließen Sie eine leere Drei-Milliliter-Spritze an den Drei-Wege-Hahn des Medium-Auslasses.
Füllen Sie die Zellkulturbereiche mit der PLL-Lösung, und pumpen Sie die Beschichtungslösung langsam hin und her. Schließen Sie die beiden Drei-Wege-Stoppcocks, um die Lösung innerhalb der Kulturregionen zu versiegeln. Inkubieren Sie den MOE-Chip über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator, der mit 5% Kohlendioxid-Atmosphäre gefüllt ist.
Öffnen Sie die beiden Drei-Wege-Stoppcocks und spülen Sie Blasen in den Kanälen weg, indem Sie die Beschichtungslösung mit den beiden Spritzen manuell hin und her in den Kanal pumpen. Zeichnen Sie drei Milliliter komplettes Medium in eine Drei-Milliliter-Spritze, die sich mit dem Drei-Wege-Stopphahn des Mediumeinlasses verbindet, und fügen Sie ihn hinzu, um die Beschichtungslösung in den Zellkulturbereichen zu ersetzen. Ersetzen Sie den weißen Finger-tight-Stecker durch den Luer-Adapter und injizieren Sie 3%heiße Agarose, um den Adapter zu füllen.
Schließen Sie die Luer-Sperrspritze an den Luer-Adapter an und injizieren Sie 3%heiße Agarose durch die schwarze Gummi-Bong, um die Luer-Sperrspritze zu füllen. 10 bis 20 Minuten für die Agarose abkühlen und erstarren lassen. Installieren Sie den zellsäenden MOE-Chip auf der transparenten ITO-Heizung, die auf einer programmierbaren XYZ-Motorbühne bei 37 Grad Celsius befestigt ist.
Infundieren Sie die mNPCs, indem Sie den MOE-Chip manuell über den mittleren Auslass in den MOE-Chip pumpen, und dann den zellgesäten MOE-Chip auf der ITO-Heizung vier Stunden lang inkubieren. Verwenden Sie elektrische Drähte, um einen EF-Multiplexer über die Elektroden auf dem Chip mit dem MOE-Chip zu verbinden. Schließen Sie einen EF-Multiplexer und einen Funktionsgenerator an einen Verstärker an, um quadratische Wellen-DC-Impulse auszugeben.
Entfernen Sie alle flachen Bodenstecker und Adapter auf dem MOE-Chip und füllen Sie die Adapter mit PBS, und versiegeln Sie dann die Adapteröffnungen mit Parafilm. Beobachten Sie die Zellen nach der Immunfärbung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Die DC-Pulsstimulation führte zu einer gleichzeitigen Unterscheidung von mNPCs in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten im Stammzellerhaltungsmedium.
Die Prozentsätze von Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten in der Kontrollgruppe und in der Stimulationsgruppe werden hier gezeigt. Nach der DC-Pulsbehandlung drückten die mNPCs signifikant hohe Anzahl von Neuronen bei DIV 7, Astrozyten an DIV 3 und Oligodendrozyten bei DIV 7 und DIV 14 waren in den Stimulationsgruppen relativ höher als in der Kontrollgruppe. Neurosphären, die durch 30 bis 40 Zellen gebildet werden, werden bevorzugt für die Initiierung der mNPC-Differenzierung.
Ein Überwuchern von mNPCs beeinträchtigt das Zellüberleben während des Differenzierungsprozesses.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll für die Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen vor, die durch gepulste Gleichstromstimulation in einem mikrofluidischen System induziert wird. Diese Technik reduziert die Zeit für den experimentellen Aufbau sowie das Proben- und Reagenzvolumen und ist daher effizient für Forschungsanwendungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Mikrofluidik
Hintergrund
- Neurale Vorläuferzellen (NPCs) sind entscheidend für das Verständnis der neuronalen Entwicklung.
- Die Stimulation mit Gleichstromimpulsen kann das Zellschicksal beeinflussen.
- Mikrofluidische Systeme ermöglichen eine präzise Kontrolle der experimentellen Bedingungen.
- Dieser Ansatz kann zur Entwicklung von Therapien für Erkrankungen des Nervensystems beitragen.
Zweck der Studie
- Etablierung eines zuverlässigen Protokolls für die Differenzierung von NPCs.
- Nutzung der Gleichstromstimulation als Methode zur Steuerung des Zellschicksals.
- Nachweis der Wirksamkeit eines mikrofluidischen Systems in der Neurowissenschaftsforschung.
Verwendete Methoden
- Entwurf von Mustern für PMMA-Schichten und doppelseitiges Klebeband.
- Verwendung eines CO2-Laserstichschreibers zur Herstellung.
- Durchführung elektrischer Gleichstrom-Impulsstimulation an NPCs.
- Durchführung von Beobachtungen mittels konfokaler Mikroskopie zur Analyse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Differenzierung von NPCs unter Verwendung des vorgeschlagenen Protokolls.
- Verkürzung der Zeit für die Versuchsvorbereitung und des Ressourcenverbrauchs.
- Durchführbarkeit der Nutzung des MOE-Chips für die Mikroskopie.
- Mögliche Anwendungen in therapeutischen Strategien bei Erkrankungen des Nervensystems.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen optimierten Ansatz für die Differenzierung von NPCs.
- Die Stimulation mit Gleichstrom ist wirksam bei der Steuerung des Zellschicksals.
- Mikrofluidische Systeme erhöhen die experimentelle Effizienz in der Neurowissenschaft.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese mikrofluidische Plattform ermöglicht eine präzise Steuerung der Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen mittels Gleichstrom-Impulsstimulation und bietet ein skalierbares und ressourcenschonendes Modell zur Zielvalidierung in der Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen. Durch die Verringerung der experimentellen Komplexität und des Reagenzienverbrauchs unterstützt sie die frühzeitige mechanistische Ent风险bewertung und erhöht die Vorhersagegenauigkeit bei Strategien zur Modulation des Zellschicksals. Die Kompatibilität des Systems mit Langzeitstimulation und automatisierter Bildgebung ermöglicht dessen Integration in Entdeckungsworkflows, die auf Therapeutika für das Nervensystem ausgerichtet sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung elektrischer Signale als Regulatoren des Zellschicksals neuraler Vorläuferzellen und unterstützt die Hypothesenprüfung in neurodevelopmentalen Signalwegen.
- Operativer Wert: Verringert Probenvolumina und Reagenzienmengen durch mikrofluidische Begrenzung und senkt so die Kosten in frühen Target-Screening-Kampagnen.
- Predictiver Wert: Liefert quantitative Messwerte der neuronalen, astrozytären und oligodendrozytären Differenzierung und ermöglicht datenbasierte Go/No-Go-Entscheidungen hinsichtlich modulatorischer Targets.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare Differenzierungsergebnisse unter kontrollierten elektrischen Feldparametern, geeignet für die Optimierung von Assays.
- Operativer Wert: Ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Bedingungen durch kanalbasierte Designs und erhöht so den Durchsatz bei der Evaluierung von Substanzen oder Stimuli.
- Einsatzbereitschaft für Assays: Unterstützt die Langzeitkultur und die zeilichte Aufnahme von Bildserien, wodurch kinetische Profilierung der Differenzierungsdynamik zur Validierung von Assays ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verwendet murine neuronale Vorläuferzellen in einem definierten Mikroumfeld, wodurch die Relevanz für in-vivo-Neurodifferenzierungsprozesse erhöht wird.
- Präklinische Modellierung: Ermöglicht die Generierung glialer und neuronaler Linien aus einem gemeinsamen Vorläufer, was für die Modellierung von Erkrankungen des Nervensystems nützlich ist.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die Beurteilung von Differenzierungstendenzen unter Stimulation und liefert damit Hinweise auf die mechanistische Sicherheit und Wirksamkeit.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein, insbesondere in die Phasen der Zielvalidierung und der Leitstruktur-Identifizierung, in denen ein mechanistisches Verständnis von Zellschicksalsregulatoren entscheidend ist. Sie unterstützt Screening-Kampagnen, indem sie ein kontrolliertes, quantifizierbares System zur Bewertung der biologischen Aktivität elektrischer oder pharmakologischer Modulatoren bereitstellt. Die Ausgabe der Plattform – differenzierungsspezifische Metriken – fließt in analytische Pipelines ein, die verwendet werden, um Zielstrukturen mit vorhersagbarer Zuverlässigkeit bezüglich neuraler Reparaturmechanismen zu priorisieren.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung bioelektrischer Signalwege in neuronalen Vorläuferzellen und verringert die Uneindeutigkeit bezüglich des Zielmechanismus.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare, quantitative Differenzierungsassays unter definierten elektrischen Reizen und verbessert so die Zuverlässigkeit des Assays.
- Analytik: Liefert messbare Endpunkte (z. B. % Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten) für den vergleichenden Analysen über verschiedene Bedingungen hinweg.
- Translationale Forschung: Modelliert Differenzierungsdynamiken, die für Erkrankungen des Nervensystems relevant sind, und unterstützt damit die präklinische Kontinuität.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Für die mehrfache Nutzung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen konzipiert, fördert die Standardisierung und Konsistenz über Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem elektrische Stimulation als definierte Variable bei der Zellschicksalsbestimmung isoliert wird.
- Operationaler Wert: Standardisiert Differenzierungsprotokolle durch mikrofluidische Präzision und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Standorten und Teams.
- Strategischer Wert: Beschleunigt Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige, mechanistische Aussagen zur Linienentscheidung bereitgestellt werden, wodurch das Risiko spätzeitiger Fehlschläge verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen, die die neuronale Differenzierung modulieren, und verbessert so die Kapitalnutzungseffizienz in Neurowissenschafts-Portfolios.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Montage mikrofluidischer Vorrichtungen, der Elektrophysiologie und der Kultur neuraler Stammzellen.
- Hängt vom Zugang zu Lasersystemen zur Strukturierung, ITO-Heizelementen, EF-Multiplexern und invertierten Mikroskopiesystemen ab.
- Erfordert die Standardisierung elektrischer Parameter (Pulsbreite, Frequenz, Amplitude) über verschiedene Experimente hinweg, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Die Anpassung an humane neuronale Vorläuferzellen könnte eine Optimierung der Stimulationsparameter und Kulturbedingungen erfordern.
- Die langfristige Stabilität der Elektroden und die Biofilmbildung bei chronischen Stimulationsstudien stellen praktische Limitationen dar, die berücksichtigt werden müssen.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Design and Fabrication of the Multichannel, Optically Transparent, Electrotactic Chip and Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions
2:49
Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions and Preparation of the Salt Bridge Network
4:47
Setup of the Microfluidic System for DC Pulse Stimulation
5:55
Results: Differentiation of the mNPC Cells in the Control Group and in the DC Pulse Stimulation Group at DIV 3, 7, and 14
6:43
Conclusion
