Name: Elektrisch-Feld-induzierte neuronale Vorläuferzelldifferenzierung in mikrofluidischen Geräten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen durch Gleichstrompulsstimulation in mikrofluidischen Systemen. Diese effiziente Methode reduziert Versuchsaufbauzeit und Reagenzienverbrauch erheblich.

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Die Autoren danken Professor Tang K. Tang, Institut für Biomedizinische Wissenschaften, Academia Sinica, für seine Unterstützung bei der Bereitstellung von mausneuralen Stamm- und Vorläuferzellen (mNPCs). Die Autoren danken auch Professor Tang K. Tang und Frau Ying-Shan Lee für ihre wertvolle Diskussion über die Differenzierung von mNPCs.

1. Design und Herstellung des MOE-Chips
<ol><li>Zeichnen Sie Muster für einzelne Polymethylmethacrylatschichten (PMMA) und das doppelseitige Band mit entsprechender Software (Abbildung 1A, Materialtabelle). Schneiden Sie sowohl die PMMA-Platten als auch das doppelseitige Band mit einem CO 2-Lasermaschinenschreiber (Abbildung 1B).<ol>
<li>Schalten Sie den CO 2-Laserschreiber ein und schließen Sie ihn an einen PC an. Öffnen Sie die entworfene Musterdatei mit der Software.</li>
		<li>Stellen Sie die PMMA-Platten (275 mm x 400 mm) oder das doppelseitige Klebeband (210 mm x 297 mm) auf die Plattform des Laserschreibers(Abbildung 2A). Richten Sie den Laser mit dem Autofokus-Werkzeug auf die Oberfläche der PMMA-Platten oder das doppelseitige Band.</li>
		<li>Wählen Sie den Laserschreiber als Drucker aus, und "drucken" Sie dann das Muster mit dem Laserschreiber, um die direkte Ablation auf dem PMMA-Blatt oder doppelseitigen Band zu starten und individuelle Muster auf dem PMMA-Blatt oder -Band zu erhalten (Abbildung 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie den Schutzfilm von den PMMA-Platten und reinigen Sie die Oberfläche mit Stickstoffgas. ANMERKUNG: Die Zeichnung des PMMA-Musters und die direkte Bearbeitung des PMMA-Blatts wurden gemäß einem früheren Bericht17durchgeführt.</li>
	<li>Zum Verkleben mehrerer Schichten von PMMA-Platten drei Stück von 1 mm PMMA-Platten (Schichten 1, 2 und 3) stapeln und unter einem Druck von 5 kg/cm2 in einem thermischen Bonder für 30 min bei 110 °C verkleben, um die Strömungs-/elektrische Stimulationskanalbaugruppe zu bilden (Abbildung 2C). HINWEIS: Verschiedene Chargen von kommerziell erhaltenen PMMA-Platten haben eine leicht unterschiedliche Glasübergangstemperatur (Tg). Die optimale Klebetemperatur muss in 5 °C-Schritten in der Nähe des Tg getestet werden.</li>
	<li>12 Stück Adapter an den einzelnen Öffnungen in Schicht 1 der MOE-Chip-Baugruppe mit schnell wirkendem Cyanoacrylatkleber kleben. HINWEIS: Die Adapter werden aus PMMA durch Spritzgießen hergestellt. Die flachen Flächen an der Unterseite sind für den Anschluss an den MOE-Chip. Die Adapter mit 1/4W-28 Innengewinde sind für den Anschluss von weißen fingerdichten Steckern, flachen Bodenverbindern oder Luer-Adaptern. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie schnell wirkenden Cyanoacrylatkleber verwenden. Vermeiden Sie es, in die Augen zu spritzen.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die 1 mm PMMA-Substrate (Schichten 1-3), das doppelseitige Band (Schicht 4) und das 3 mm optische PMMA (Schicht 5) mit ultravioletter (UV) Bestrahlung für 30 min vor der Montage des Chips (Abbildung 1A).</li>
	<li>Verkleben Sie die 1 mm PMMA-Substrate (Schichten 1-3) auf dem 3 mm optischen PMMA (Schicht 5) mit dem doppelseitigen Band (Schicht 4), um die PMMA-Baugruppe (Schichten 1-5) abzuschließen (Abbildung 1A).</li>
	<li>Bereiten Sie das saubere Deckglas für die Montage auf dem Chip vor.<ol>
<li>Füllen Sie eine zehnfache Verdünnung des Reinigungsmittels in ein Färbeglas (siehe Materialtabelle), und reinigen Sie das Deckglas in diesem Reinigungsmittel mit einem Ultraschallreiniger für 15 min.</li>
		<li>Spülen Sie das Färbeglas unter fließendem Leitungswasser gründlich ab, um alle Spuren des Reinigungsmittels zu entfernen.</li>
		<li>Spülen Sie mit destilliertem Wasser weiter, um alle Spuren von Leitungswasser zu entfernen, und wiederholen Sie Schritt 1.7.2 zweimal.</li>
		<li>Trocknen Sie das gereinigte Deckglas, indem Sie es mit Stickstoffgas blasen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desinfizieren Sie die PMMA-Baugruppe (Schichten 1-5), das doppelseitige Band (Schicht 6) und das Deckglas (Schicht 7) mit UV-Bestrahlung in einem Biosicherheitsschrank für 30 min vor der Montage des Chips (Abbildung 1A).</li>
	<li>Das gereinigte Deckglas (Schicht 7) mit dem doppelseitigen Klebeband (Schicht 6)(Abbildung 1A)an der PMMA-Baugruppe (Schichten 1-5) aufkleben</li>
	<li>Inkubieren Sie den MOE-Chip über Nacht in einer Vakuumkammer; verwenden Sie die MOE-Chip-Baugruppe für nachfolgende Verfahren (Abbildung 3).</li>
</ol>2. Beschichtung von Poly-L-Lysin (PLL) auf dem Substrat in den Zellkulturbereichen
<ol><li>Vorbereiten des Polytetrafluorethylen-Rohrs, des Flachbodensteckers, des Kegelverbinders, des Kegel-Luer-Adapters, des weißen Finger-Tight-Plugs (auch Stopper genannt), des Luer-Adapters, der Luer-Sperrspritze und der schwarzen Gummi-Bung (Abbildung 4A, Materialtabelle). Sterilisieren Sie alle oben genannten Komponenten in einem Autoklaven bei 121 °C für 30 min.</li>
	<li>Versiegeln Sie die Öffnungen der Agarbrückenadapter (Abbildung 1A) mit den weißen fingerdichten Steckern. Schließen Sie den Flachbodenstecker über die mittleren Ein- und Auslassadapter an die MOE-Chipbaugruppe an (Abbildung 4B). Schließen Sie den Kegel-Luer-Adapter an die 3-Wege-Stoppcocks an.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml 0,01% PLL-Lösung mit einer 3 ml Spritze hinzu, die mit dem 3-Wege-Stopphahn des mittleren Einlasses verbunden ist (Abbildung 4B- <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61917/1.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
	<li>Schließen Sie eine leere 3 ml Spritze an den 3-Wege-Stopphahn des mittleren Auslasses an (Abbildung 4B- <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61917/2.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
	<li>Füllen Sie die Zellkulturbereiche mit der PLL-Lösung. Die Beschichtungslösung langsam hin und her pumpen. Schließen Sie die beiden 3-Wege-Stoppcocks, um die Lösung innerhalb der Kulturregionen zu versiegeln.</li>
	<li>Inkubieren Sie den MOE-Chip bei 37 °C über Nacht in einem Inkubator, der mit 5%CO2-Atmosphäre gefüllt ist.</li>
</ol>3. Vorbereitung des Salzbrückennetzes
<ol><li>Öffnen Sie nach Schritt 2.6 die beiden 3-Wege-Stoppcocks und spülen Sie die Blasen in den Kanälen weg, indem Sie die Beschichtungslösung mit den beiden Spritzen manuell hin und her in den Kanal pumpen.</li>
	<li>Zeichnen Sie 3 ml komplettes Medium (Stammzellerhaltungsmedium bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium/Schinken-Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12), 2% B-27-Ergänzung, 20 ng/mL EGF und 20 ng/mL bFGF) in eine 3 ml Spritze, die sich mit dem 3-Wege-Stopphahn des Mittleren Einlasses verbindet(Abbildung 4B- <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61917/1.png" style="vertical-align: middle;"> und Abbildung 4B- <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61917/3.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
	<li>Fügen Sie 3 ml komplettes Medium hinzu, um die Beschichtungslösung in den Zellkulturbereichen zu ersetzen. Schließen Sie eine leere 5 ml Spritze an den 3-Wege-Stopphahn des mittleren Auslasses an (Abbildung 4B- <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61917/4.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
	<li>Vorbereiten des Salzbrückennetzes (Abbildung 5).<ol>
<li>Schneiden Sie die schwarze Gummi-Bung, um einen Spalt zu produzieren, und legen Sie die Silber (Ag)/Silberchlorid (AgCl) Elektroden durch die schwarze Gummi-Bung und in die Luer-Sperrspritze(Abbildung 4A).</li>
		<li>Ersetzen Sie den weißen fingerdichten Stecker durch den Luer-Adapter, und injizieren Sie 3% heiße Agarose, um den Luer-Adapter zu füllen. HINWEIS: Zur Herstellung der heißen Agarose 3 g Agarosepulver in 100 ml phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) auflösen und in einem Autoklaven bei 121 °C für 30 min sterilisieren.</li>
		<li>Schließen Sie die Luer-Verriegelungsspritze an den Luer-Adapter an. Injizieren Sie 3% heiße Agarose durch den schwarzen Gummi-Bung, um die Luer-Sperrspritze mit der Spritze mit Nadel zu füllen. 10 bis 20 Min. für die Agarose abkühlen und erstarren lassen. HINWEIS: Um die Volumenkapazität der Agarose zu erhöhen, ist die Luer-Schlossspritze am Luer-Adapter montiert(Abbildung 4 und Abbildung 5). Anschließend werden die großen Elektroden in die Luer-Sperrspritze eingeführt. Die Elektrode ist in der Lage, eine stabile elektrische Stimulation für das Langzeitexperiment zu bieten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Vorbereitung von mNPCs
<ol><li>Kultur die mNPCs1 im gesamten Medium in einem 25T Zellkulturkolben bei 37 °C in einem Inkubator mit 5%CO2-Atmosphäre gefüllt. Subkultur die Zellen alle 3-4 Tage, und führen Sie alle Experimente mit Zellen, die 3-8 Passagen aus der ursprünglichen Quelle durchlaufen haben.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr und spinnen Sie die Neurosphären bei 100 × g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Neurosphären mit 1x Dulbecco s PBS (DPBS). Spin-down der Neurosphären bei 100 × g für 5 min.</li>
	<li>Aspirieren Sie die 1x DPBS und setzen Sie dann die Neurosphären im gesamten Medium wieder aus. Gründlich und sanft mischen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml der Neurosphäresuspension mit einer 1 ml Spritze hinzu, die mit dem 3-Wege-Hahn des Auslasses verbunden ist (Abbildung 4B- <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61917/2.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
</ol>5. Einrichtung des mikrofluidischen Systems zur DC-Pulsstimulation (Abbildung 6)
<ol><li>Installieren Sie den zellsäenden MOE-Chip auf der transparenten ITO-Heizung, die auf einer programmierbaren X-Y-Z motorisierten Bühne befestigt ist. HINWEIS: Die ITO-Oberflächentemperatur wird von einem proportional-integral-derivative-controller gesteuert und bei 37 °C gehalten. Ein K-Thermoelement wird zwischen dem Chip und der ITO-Heizung eingeklemmt, um die Temperatur der Zellkulturbereiche innerhalb des Chips zu überwachen. Der MOE-Chip ist auf einer programmierbaren X-Y-Z motorisierten Bühne installiert und eignet sich für die automatische Zeitraffer-Bildaufnahme an einzelnen Kanalabschnitten. Die Herstellung der ITO-Heizung und der Aufbau der Zellkulturheizung wurden zuvor beschrieben18,19.</li>
	<li>Infundieren Sie die mNPCs durch manuelles Pumpen in den MOE-Chip über den mittleren Auslass. Inkubieren Sie den zellsamen MOE-Chip auf dem 37 °C ITO-Heizer für 4 h.</li>
	<li>Nach 4 h das komplette Medium mit einer Spritzenpumpe über den mittleren Einlass mit einer Durchflussrate von 20 l/h durch den MOE-Chip pumpen. HINWEIS: Die mNPCs werden im Chip für weitere 24 h vor der EF-Stimulation angebaut und gewartet, um Zellanhaftung und Wachstum zu ermöglichen. Die Abfallflüssigkeit wird in einer leeren 5 ml Spritze gesammelt, die mit dem 3-Wege-Hahn des Auslasses verbunden ist, der in Abbildung 6Aals "Abfall" dargestellt ist. Die MOE mikrofluidische Systemkonfiguration ist in Abbildung 6dargestellt. Dieses mikrofluidische System versorgt die Zellen kontinuierlich mit Nahrung. Das komplette frische Medium wird kontinuierlich in den MOE-Chip gepumpt, um einen konstanten pH-Wert zu halten. Daher können die Zellen außerhalb eines CO2-Inkubators kultiviert werden.</li>
	<li>Verwenden Sie elektrische Drähte, um einen EF-Multiplexer über die Ag/AgCl-Elektroden auf dem Chip mit dem MOE-Chip zu verbinden. Schließen Sie einen EF-Multiplexer und einen Funktionsgenerator an einen Verstärker an, um rechteckige DC-Impulse mit einer Magnitude von 300 mV/mm bei einer Frequenz von 100 Hz bei 50 % Betriebszyklen (50 % Time-on und 50% Time-off) auszugeben (Abbildung 6B).<ol>
<li>Schließen Sie die elektrischen Drähte an den EF-Multiplexer an. Schließen Sie die elektrischen Drähte über die Ag/AgCl-Elektroden an den MOE-Chip an.</li>
		<li>Schließen Sie den EF-Multiplexer über elektrische Drähte an den Verstärker an. Schließen Sie den Funktionsgenerator an den Verstärker und das digitale Oszilloskop an. HINWEIS: Der EF-Multiplexer ist eine Schaltung, die die Impedanz der Kulturkammer in der Schaltung enthält und alle einzelnen Kammern in einem parallelen elektronischen Netzwerk verbindet. Jede der drei Kulturkammern ist seriell mit einem variablen Widerstand (Vr) und einem Amperemeter (in Abbildung 6Adargestellt) im Multiplexer elektrisch verbunden. Der elektrische Strom durch jede Kulturkammer wird durch Die Steuerung des Vr variiert, und der Strom wird auf dem entsprechenden Amperemeter angezeigt. Die elektrische Feldstärke in jeder Zellkulturregion wurde durch Das Ohm-Gesetz I= EA berechnet, wobei ich der elektrische Strom bin, σ (eingestellt auf 1,38 Sm-1 für DMEM/F1220)die elektrische Leitfähigkeit des Kulturmediums ist, E das elektrische Feld und A der Querschnittsbereich der elektrotaktischen Kammer. Für die in Abbildung 1dargestellte Dimension des Zellkulturbereichs beträgt der elektrische Strom 87 mA bzw. 44 mA für DC- und DC-Puls bei 50 % Betriebszyklus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Unterziehen Sie die mNPCs quadratischen DC-Impulsen mit einer Magnitude von 300 mV/mm bei einer Frequenz von 100 Hz für 48h. Das gesamte Medium kontinuierlich mit einer Rate von 10 l/h pumpen, um die Zellen ausreichend mit Nahrung zu versorgen und einen konstanten pH-Wert im Medium aufrechtzuerhalten.</li>
</ol>6. Immunfluoreszenz-Assays von mNPCs nach gepulsten DC-Stimulation
HINWEIS: In diesem Schritt wird das gesamte Reagenz über den mittleren Einlass mit einer Spritzenpumpe gepumpt.
<ol><li>Nach 3, 7 oder 14 Tagen in vitro (DIV) Kultivierung nach der Aussaat1,waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 25 l/min für 20 min.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA). Pumpen Sie 4% PFA in den Chip mit einer Durchflussrate von 25 l/min für 20 min, um die 1x PBS zu ersetzen. Um die 4% PFA zu ersetzen, waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 25 l/min für 20 min.</li>
	<li>Pumpe 0,1% Triton X-100 in den Chip mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min, um die Zellen zu permeabilisieren. Reduzieren Sie den Durchfluss auf 50 l/h, damit weitere 30 min mit den Zellen reagieren. Um den 0,1% Triton X-100 zu ersetzen, waschen Sie die Zellen mit 1x PBS bei einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min.</li>
	<li>Blockieren Sie die Zellen mit PBS, die 1% Rinderserumalbumin (BSA) enthalten, um die unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren. Pumpe 1% BSA in den Chip mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min. Reduzieren Sie den Durchfluss auf 100 l/h und pumpen Sie 1 h.</li>
	<li>Die Antikörper zur doppelten Immunfärbung mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min in den Chip pumpen und den Chip für 18 h bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 15 min.</li>
	<li>Pumpen Sie die Alexa Fluor-konjugierten Sekundärantikörper mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min in den Chip. Reduzieren Sie den Durchfluss auf 50 l/h, und pumpen Sie die Antikörper bei Raumtemperatur im Dunkeln 1 h. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 15 min.</li>
	<li>Für die Kernfärbung, pumpe Hoechst 33342 in den Chip mit einer Durchflussrate von 20 l/min für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 15 min.</li>
	<li>Beobachten Sie die Zellen nach der Immunfärbung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>7. Bildanalyse und Datenverarbeitung
<ol><li>Analysieren Sie die fluoreszierenden Bilder mit Software mit integrierten Messwerkzeugen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Vergleichen Sie die Hoechst-counterstainierten Kerne (Gesamtanzahl der Zellen) in den Kontroll- und Behandlungsgruppen, und berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen, die jeden phänotypchenden Marker exemittieren.</li>
</ol>

<ol><li>Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+DC+electric+field-induced+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells.</a> PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).</li>
<li>Li, S., Li, H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+spiral+ganglion+neurite+extension+in+electrical+fields+of+charge-balanced+biphasic+pulses+and+direct+current+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro.</a> Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).</li>
<li>Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direction+of+neurite+growth+in+a+weak+DC+electric+field+depends+on+the+substratum%3A+contributions+of+adhesivity+and+net+surface+charge%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge.</a> Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).</li>
<li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+proliferation+and+differentiation+in+neural+precursor+cells+by+the+Jak+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway.</a> Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).</li>
<li>Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+directs+migration%2C+enhances+and+orients+cell+division+and+upregulates+the+chemokine+receptors+CXCR4+and+CXCR2+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).</li>
<li>Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inhibits+electric+field-induced+migration+of+non-small+cell+lung+cancer+%28NSCLC%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 8094(2019).</li>
<li>Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+oral+squamous+cell+carcinoma+cells+in+a+multiple-electric-field+chip+with+uniform+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field.</a> Biomicrofluidics. 6 (3), 34116(2012).</li>
<li>Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).</li>
<li>Jing, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+electrical+stimulation+with+different+electric-field+intensities+in+the+regulation+of+the+differentiation+of+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells.</a> American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).</li>
<li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-powered+electrical+stimulation+for+enhancing+neural+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+on+graphene-poly%283%2C4-ethylenedioxythiophene%29+hybrid+microfibers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Nano%22%5BJournal%5D)">Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers.</a> American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).</li>
<li>Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+electrical+stimulation+and+cisplatin+in+HeLa+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+moderate+exogenous+electric+field+stimulation+on+activating+netrin-1%2FDCC+expression+against+mechanical+stretch-induced+injury+in+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicity+Research%22%5BJournal%5D)">Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons.</a> Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).</li>
<li>Haan, N., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+application+of+electric+fields+in+the+injured+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system.</a> Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).</li>
<li>Ariza, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+electric+fields+on+hippocampal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).</li>
<li>Huang, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+human+lung+cancer+cell+line+CL1-5+in+response+to+a+direct+current+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field.</a> PLoS One. 6 (10), e25928(2011).</li>
<li>Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+ordered+three-dimensional+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).</li>
<li>Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+studies+of+lung+cancer+cells+using+a+multichannel+dual-electric-field+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip.</a> Journal of Visualized Experiments. 106, e53340(2015).</li>
<li>Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITO+patterning+by+a+low+power+Q-switched+green+laser+and+its+use+in+the+fabrication+of+a+transparent+flow+meter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).</li>
<li>Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+cell-culture+microchamber+with+a+variably+controlled+concentration+gradient+generator+and+flow+field+rectifier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier.</a> Biomicrofluidics. 2 (2), 24105(2008).</li>
<li>Fuhr, G., Shirley, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+handling+and+characterization+using+micron+and+submicron+electrode+arrays%3A+state+of+the+art+and+perspectives+of+semiconductor+microtools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).</li>
<li>AChang, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+electrical+currents+stimulation+promotes+both+proliferation+and+differentiation+of+fetal+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells.</a> PLoS One. 6 (4), e18738(2011).</li>
<li>Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+current+electric+fields+of+varying+frequencies%3A+effects+on+proliferation+and+differentiation+of+porcine+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells.</a> Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Bei der Herstellung des MOE-Chips werden die Adapter mit schnell wirkendem Cyanoacrylatkleber am Layer 1 des MOE-Chips befestigt. Der Kleber wird auf 4 Ecken der Adapter aufgetragen, und dann wird der Druck gleichmäßig über die Adapter aufgebracht. Überschüssige Klebstoffmenge muss vermieden werden, um eine vollständige Polymerisation des Klebers zu gewährleisten. Darüber hinaus wird die fertige MOE-Chip-Montage in einer Vakuumkammer inkubiert. Dieser Schritt hilft, die Blasen zwischen der PMMA-Schicht, dem doppelseitige...

Neurale Vorläuferzellen (NPCs, auch bekannt als neuronale Stamm- und Vorläuferzellen) können ein vielversprechender Kandidat für neurodegenerative therapeutische Strategiesein 1. Die undifferenzierten NPCs haben Selbsterneuerungskapazität, Multipotenz und proliferative Fähigkeit2,3. Eine frühere Studie hat berichtet, dass die extrazelluläre Matrix und molekulare Mediatoren die Differenzierung von NPC regulieren. Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der grundlegende Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) fördern die NPC-Proliferation und behalten so den undifferenzierten Zustandbei 4.
Frühere Studien haben berichtet, dass elektrische Stimulation zellphysiologische Aktivitäten wie Abteilung5,Migration6,7,8, Differenzierung1,9,10und Zelltod11regulieren kann. Elektrische Felder (EFs) spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Regeneration der Entwicklung des zentralen Nervensystems12,13,14. Von 2009 bis 2019 hat dieses Labor zelluläre Reaktionen auf die Anwendung von EF im mikrofluidischen System1,6,7,8,15,16,17untersucht. Ein mehrkanalig, optisch transparenter, elektrotaktischer (MOE) Chip wurde entwickelt, um für die Immunfluoreszenzfärbung für die konfokale Mikroskopie geeignet zu sein. Der Chip hatte eine hohe optische Transparenz und eine gute Haltbarkeit und ermöglichte die gleichzeitige Durchführung von drei unabhängigen Stimulationsexperimenten und mehreren immunbefleckten Bedingungen in einer einzigen Studie. Das mikrofluidische System ist vorteilhaft bei der Vereinfachung des gesamten Versuchsaufbaus und damit des Reagenz- und Probenverbrauchs. Dieser Beitrag beschreibt die Entwicklung eines mikrofluidischen Zellkultursystems, das für eine Langzeit-Zelldifferenzierungsstudie verwendet wurde.

<table><tbody><tr><td>1 mm PMMA-Substrate (Schichten 1-3)</td><td>BHT</td><td>K2R20</td><td>Polymethylmethacrylat (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html</td></tr><tr><td>15 mL Kunststoffröhrchen</td><td>Protech Technology Enterprise Co., Ltd</td><td>CT-15-PL-TW</td><td>Röhrchen mit konischem Boden und Kappe, montiert, vorsterilisiert</td></tr><tr><td>3 mL Spritze</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>3 mL Spritzen zum Einnehmen, ohne Nadel</td></tr><tr><td>3 mm optisches PMMA (Schicht 5)</td><td>CHI MEI Corporation</td><td>ACRYPOLY PMMA Sheet</td><td>Optical grade PMMA</td></tr><tr><td>3-Wege-Absperrhahn</td><td>NIPRO</td><td>NCN-3L</td><td>Sterile Einweg-3-Wege-Absperrhahn</td></tr><tr><td>5 mL</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3410</td><td>5 mL Spritzen zum Einnehmen, ohne Nadel</td></tr><tr><td>Adapter</td><td>Dong Zhong Co., Ltd.</td><td>Kundenspezifischer</td><td>PMMA-Adapter</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Agarose, niedrige Geliertemperatur</td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>A.A. Lab Systems Ltd</td><td>A-304</td><td>Hochspannungsverstärker</td></tr><tr><td>AutoCAD-Software Autodesk</td><td></td><td>Educational Version</td><td>Drafting</td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>B-27 Ergänzung (50x), abzüglich Vitamin A</td></tr><tr><td>Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>Auch rekombinant humanes FGF-basic</td></tr><tr><td>genannt Schwarzer Gummistopfen</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>Aus 3 mL Spritzen zum Einnehmen, ohne Nadel</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td>Blockierungsreagenz&nbsp;</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>HSIANGTAI</td><td>CV2060</td><td>Zentrifuge</td></tr><tr><td>CO2 Laserritzer</td><td>Laser Tools and Technics Corp.&nbsp;</td><td>ILS-II</td><td>Gekauft von http://www.lttcorp.com/index.htm</td></tr><tr><td>Konus-Steckverbinder</td><td>IDEX Health & Science</td><td>F-120X</td><td>Einteiliger fingerenger 10-32 Konus, für 1/16" OD natürlicher</td></tr><tr><td>Cone-Luer-Adapter</td><td>IDEX Gesundheit & Gesundheit Science</td><td>P-659</td><td>Luer-Adapter 10-32 Buchse auf Buchse Luer, PEEK</td></tr><tr><td>Konfokales Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td>Leica TCS SP5 Benutzerhandbuch, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf</td></tr><tr><td>Digitalkamera</td><td>OLYMPUS</td><td>E-330</td><td>Automatische Zeitraffer-Bilderfassung</td></tr><tr><td>Digitales Oszilloskop</td><td>Tektronix</td><td>TDS2024</td><td>Messen Sie Spannungs- oder Stromsignale über die Zeit in einer elektronischen Schaltung oder Komponente, um Amplitude und Frequenz anzuzeigen.</td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>3M&nbsp;</td><td>PET 8018</td><td>Gekauft bei http://en.thd.com.tw/</td></tr> <tr><td>Dulbecco" s modifizierter Eagle" s medium/Schinkennährstoffmischung F-12 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>12400024</td><td>DMEM/F-12, Pulver, HEPES</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21600010</td><td>DPBS, Pulver, kein Kalzium, kein Magnesium</td></tr><tr><td>EF Multiplexer</td><td>Asiatic Sky Co., Ltd.</td><td></td><td>Kundenspezifisch Überwachung und Steuerung des elektrischen Stroms in einzelnen Kanälen</td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Auch rekombinanter humaner EGF genannt</td></tr><tr><td>Schnell wirkender Cyanacrylatkleber</td><td>3M&nbsp;</td><td>7004T</td><td>Stärke Sofortklebstoff (flüssig)</td></tr><tr><td>Flacher Bodenverbinder</td><td>IDEX Gesundheit & Gesundheit Science</td><td>P-206</td><td>Flanschlose Außenmutter Delrin, 1/4-28 flacher Boden, für 1/16" AD blau</td></tr><tr><td>Funktionsgenerator</td><td>Agilent Technologies</td><td>33120A</td><td>Hochleistungsmutter 15 MHz synthetisiert&nbsp; Funktionsgenerator&nbsp; mit eingebauter Arbiträrsignalfunktion</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150117</td><td>Ziege Anti-Maus IgG H& L (Alexa Fluor 488) präadsorbiertes</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H& L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150086</td><td>polyklonaler Ziegen-Sekundärantikörper gegen Kaninchen-IgG - H& L (Alexa Fluor 555), voradsorbiert</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Kernfärbung</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.48v</td><td>Analysieren Sie die Fluoreszenzbilder&nbsp;</td></tr><tr><td>Indium&ndash; tin&ndash; Oxid (ITO)-Glas</td><td>Merck</td><td>300739</td><td>Für ITO-Heizung</td></tr><tr><td>Inverses Phasenkontrastmikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>CKX41</td><td>Für die Beobachtung der Zellmorphologie</td></tr><tr><td>K-Typ-Thermoelement</td><td>Tecpel</td><td>TPK-02A</td><td>Temperatur&nbsp; Thermoelemente</td></tr><tr><td>Luer-Adapter</td><td>IDEX Gesundheit & Gesundheit Science</td><td>P618-01</td><td>Luer-Adapter weiblich Luer auf 1/4-28 männlich Polypropylen</td></tr><tr><td>Luer-Lock-Spritze</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>Für Agar-Salzbrücken</td></tr><tr><td>Maus Anti-GFAP</td><td>eBioscience</td><td>14-9892</td><td>Astrozyten-Marker</td></tr><tr><td>Oligodendrozyten &nbsp; Markierung&nbsp; O4&nbsp; Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1326</td><td>Oligodendrozyten-Marker</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Fixierung&nbsp; Mittel</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Basic Life</td><td>BL2651</td><td>Waschlösung</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin (PLL)</td><td>SIGMA</td><td>P4707</td><td>Beschichtungslösung</td></tr><tr><td>Präzisionsdeckgläser Dicke Nr. 1,5H</td><td>MARIENFELD</td><td>107242</td><td>https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html</td></tr><tr><td>Programmierbarer X-Y-Z Motortisch</td><td>Tanlian Inc</td><td>Customized</td><td>Gekauft von http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm</td></tr><tr><td>Proportional&ndash; integral&ndash; abgeleiteter (PID) Regler</td><td>Toho Electronics</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>Temperaturregler&nbsp;</td></tr><tr><td>PTFE-Schlauch</td><td>Professional Plastics Inc. Taiwan Zweig</td><td>Außendurchmesser 1/16 Zoll</td><td>Weiß durchscheinender PTFE-Schlauch</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Tuj1</td><td>Abcam</td><td>ab18207</td><td>Neuron Marker</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>New Era Systems Inc</td><td>NE-1000</td><td>NE-1000 programmierbare Einzelspritzenpumpe</td></tr><tr><td>TFD4 Reinigungsmittel</td><td>FRANKLAB</td><td>TFD4</td><td>Deckglasreiniger</td></tr><tr><td>Thermischer Bonder</td><td>Kuan-MIN Tech Co.</td><td>Kundenspezifisch</td><td>Gekauft von http://kmtco.com.tw/</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Permeabilisierte Lösung</td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>LEO</td><td>LEO-300S</td><td>Ultraschall-Steri-Reiniger</td></tr><tr><td>Vakuumkammer</td><td>DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.</td><td>DOV-30</td><td>Vakuumtrockenschrank</td></tr><tr><td>Weißer Fingerstopfen</td><td>IDEX Health & Science</td><td>P-316</td><td>1/4-28 Flachboden, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html</td></tr></tbody></table>

elektrisch-feld-induzierte neuronale vorläuferzelldifferenzierung in mikrofluidischen geräten

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

Physiologische elektrische Felder (EF) spielen eine wichtige Rolle bei der Zellmigration, Differenzierung, Teilung und tod. Dieses Papier beschreibt ein mikrofluidisches Zellkultursystem, das für eine Langzeit-Zelldifferenzierungsstudie mittels Mikroskopie verwendet wurde. Das mikrofluidische System besteht aus folgenden Hauptkomponenten: einem optisch transparenten elektrotaktischen Chip, einer transparenten Indium-Zinnoxid-Heizung (ITO), einer Kulturmedienfüllpumpe, einer elektrischen Stromversorgung, einem Hochfrequenz-Leistungsverstärker, einem EF-Multiplexer, einer programmierbaren X-Y-Z-Motorbühne und einem invertierten Phasenkontrastmikroskop mit Digitalkamera. Das mikrofluidische System ist vorteilhaft bei der Vereinfachung des gesamten Versuchsaufbaus und damit des Reagenz- und Probenverbrauchs. Diese Arbeit beinhaltet die Differenzierung von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs), die durch Gleichstrom-Pulsstimulation (DC) induziert werden. Im Stammzellerhaltungsmedium unterschieden sich die Maus-NPCs (mNPCs) nach der DC-Pulsstimulation in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine einfache DC-Pulsbehandlung das Schicksal von mNPCs steuern und zur Entwicklung therapeutischer Strategien für Erkrankungen des Nervensystems verwendet werden könnte. Das System kann für die Zellkultur in mehreren Kanälen, für die langfristige EF-Stimulation, für die zellmorphologische Beobachtung und für die automatische Zeitrafferbildaufnahme verwendet werden. Dieses mikrofluidische System verkürzt nicht nur die benötigte Versuchszeit, sondern erhöht auch die Genauigkeit der Kontrolle auf der Mikroumgebung.

Die detaillierte Konfiguration des MOE-Chips ist in Abbildung 1dargestellt. Der mikrofluidische Chip bietet einen vorteilhaften Ansatz zur Reduzierung der Versuchsaufbaugröße, des Probenvolumens und des Reagenzvolumens. Der MOE-Chip wurde entwickelt, um drei unabhängige EF-Stimulationsexperimente und mehrere Immunflecken gleichzeitig in einer einzigen Studie durchzuführen (Abbildung 3). Darüber hinaus eignet sich der MOE-Chip mit...

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Differenzierung von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs) vor, das ausschließlich durch Gleichstrom-Pulsstimulation (DC) in einem mikrofluidischen System induziert wird.

Elektrisch-Feld-induzierte neuronale Vorläuferzelldifferenzierung in mikrofluidischen Geräten

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

Diese Studie stellt ein Protokoll zur Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen vor, das ausschließlich durch Gleichstrompulsstimulation in einem mikrofluidischen System induziert wird. Diese Technik bietet einen vorteilhaften Ansatz zur Reduzierung der Versuchsaufbauzeit, des Probenvolumens und des Reagenzvolumens. Darüber hinaus eignet sich der MOE-Chip für konfokale Mikroskopiebeobachtungen.Die einfache Gleichstrompulsbehandlung kann das Schicksal der neuronalen Vorläuferzellen der Maus steuern und könnte zur Entwicklung therapeutischer Strategien für Erkrankungen des Nervensystems verwendet werden. Zeichnen Sie zunächst Muster für einzelne PMMA-Schichten und das doppelseitige Band mit entsprechender Software. Schalten Sie den Kohlendioxid-Laserschreiber ein und schließen Sie ihn an einen PC an.Öffnen Sie die entworfene Musterdatei mit der Software. Legen Sie die PMMA-Blätter oder das doppelseitige Band auf die Plattform des Laserschreibers und fokussieren Sie den Laser dann mit dem Autofokus-Werkzeug auf die Oberfläche der PMMA-Platten oder das doppelseitige Band. Wählen Sie den Laserschreiber als Drucker aus, und starten Sie dann den Laserschreiber, um die direkte Ablation auf dem PMMA-Blatt oder doppelseitigen Band zu starten.Entfernen Sie die Schutzfolie von den PMMA-Platten und reinigen Sie die Oberfläche mit Stickstoffgas. Zum Verkleben mehrerer Schichten von PMMA-Platten drei Stücke von einem Millimeter PMMA-Platten stapeln und unter einem Druck von fünf Kilogramm pro Quadratzentimeter in einem thermischen Bonder für 30 Minuten bei 110 Grad Celsius verkleben, um die Strömungs- oder elektrische Stimulationskanal-Baugruppe zu bilden. 12 Stück Adapter in Schicht eins der MOE-Chip-Baugruppe mit schnell wirkendem Cyanoacrylatkleber an den einzelnen Öffnungen kleben.Desinfizieren Sie die ein Millimeter PMMA-Substrate, das doppelseitige Band und das drei Millimeter optische PMMA mit ultravioletter Bestrahlung 30 Minuten lang, bevor Sie den Chip montieren. Verkleben Sie die ein Millimeter PMMA-Substrate auf dem drei Millimeter optischen PMMA mit dem doppelseitigen Klebeband, um die PMMA-Baugruppe zu vervollständigen. Das gereinigte Deckglas mit dem beidseitigen Klebeband an der PMMA-Baugruppe kleben.Versiegeln Sie die Öffnungen der Agar-Brückenadapter mit weißen fingerdichten Steckern. Schließen Sie den flachen Bodenstecker über die mittleren Einlass- und Auslassadapter an die MOE-Chip-Baugruppe an, und schließen Sie dann den Kegel-Luer-Adapter an die Drei-Wege-Stoppcocks an. Fügen Sie zwei Milliliter 0,01%PLL-Lösung mit einer Drei-Milliliter-Spritze, die mit dem Drei-Wege-Stopcock des Mediums Einlass verbunden ist, und schließen Sie eine leere Drei-Milliliter-Spritze an den Drei-Wege-Hahn des Medium-Auslasses.Füllen Sie die Zellkulturbereiche mit der PLL-Lösung, und pumpen Sie die Beschichtungslösung langsam hin und her. Schließen Sie die beiden Drei-Wege-Stoppcocks, um die Lösung innerhalb der Kulturregionen zu versiegeln. Inkubieren Sie den MOE-Chip über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator, der mit 5% Kohlendioxid-Atmosphäre gefüllt ist.Öffnen Sie die beiden Drei-Wege-Stoppcocks und spülen Sie Blasen in den Kanälen weg, indem Sie die Beschichtungslösung mit den beiden Spritzen manuell hin und her in den Kanal pumpen. Zeichnen Sie drei Milliliter komplettes Medium in eine Drei-Milliliter-Spritze, die sich mit dem Drei-Wege-Stopphahn des Mediumeinlasses verbindet, und fügen Sie ihn hinzu, um die Beschichtungslösung in den Zellkulturbereichen zu ersetzen. Ersetzen Sie den weißen Finger-tight-Stecker durch den Luer-Adapter und injizieren Sie 3%heiße Agarose, um den Adapter zu füllen.Schließen Sie die Luer-Sperrspritze an den Luer-Adapter an und injizieren Sie 3%heiße Agarose durch die schwarze Gummi-Bong, um die Luer-Sperrspritze zu füllen. 10 bis 20 Minuten für die Agarose abkühlen und erstarren lassen. Installieren Sie den zellsäenden MOE-Chip auf der transparenten ITO-Heizung, die auf einer programmierbaren XYZ-Motorbühne bei 37 Grad Celsius befestigt ist.Infundieren Sie die mNPCs, indem Sie den MOE-Chip manuell über den mittleren Auslass in den MOE-Chip pumpen, und dann den zellgesäten MOE-Chip auf der ITO-Heizung vier Stunden lang inkubieren. Verwenden Sie elektrische Drähte, um einen EF-Multiplexer über die Elektroden auf dem Chip mit dem MOE-Chip zu verbinden. Schließen Sie einen EF-Multiplexer und einen Funktionsgenerator an einen Verstärker an, um quadratische Wellen-DC-Impulse auszugeben.Entfernen Sie alle flachen Bodenstecker und Adapter auf dem MOE-Chip und füllen Sie die Adapter mit PBS, und versiegeln Sie dann die Adapteröffnungen mit Parafilm. Beobachten Sie die Zellen nach der Immunfärbung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. Die DC-Pulsstimulation führte zu einer gleichzeitigen Unterscheidung von mNPCs in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten im Stammzellerhaltungsmedium.Die Prozentsätze von Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten in der Kontrollgruppe und in der Stimulationsgruppe werden hier gezeigt. Nach der DC-Pulsbehandlung drückten die mNPCs signifikant hohe Anzahl von Neuronen bei DIV 7, Astrozyten an DIV 3 und Oligodendrozyten bei DIV 7 und DIV 14 waren in den Stimulationsgruppen relativ höher als in der Kontrollgruppe. Neurosphären, die durch 30 bis 40 Zellen gebildet werden, werden bevorzugt für die Initiierung der mNPC-Differenzierung.Ein Überwuchern von mNPCs beeinträchtigt das Zellüberleben während des Differenzierungsprozesses.

electric-field-induced-neural-precursor-cell-differentiation

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen (NSCs) unter Verwendung eines neuartigen Agarosegel basierten mikrofluidischen Gerät verbessert. Diese Technologie kann ohne weiteres auf andere Säugetierzellen Systeme, bei denen Zellen Quellen sind rar, wie menschliche neurale Stammzellen, und die Umdrehung um Zeit ist von entscheidender Bedeutung.

Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

Dieses Protokoll zeigt Methoden verwendet werden, um 2D-und 3D-Umgebungen in speziell angefertigten electrotactic Kammern einzurichten, die Zellen verfolgen...

Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Sie benutzerdefinierte Kammern, die die Anwendung eines Gleichstrom elektrisches Feld an Zeitraffer-Aufnahmen von erwachsenen Gehirn abgeleitete neurale Vorläuferzellen Translokation während Galvanotaxis ermöglichen ermöglichen konstruieren.

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

Dieses Video demonstriert die Verwendung eines extrazellulären Matrix-beschichteten Mikrofluidik-Chips zur Unterscheidung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen oder NPCs durch elektrische Stimulation. Nach der Aussaat und dem Anhaften an der beschichteten Region wachsen NPCs, und die Anwendung eines Gleichstroms löst ihre Differenzierung in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten aus.

Elektrostimulationsinduzierte Differenzierung von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen

Das Video zeigt die Bildung von neuromuskulären Verbindungen mit Hilfe eines mikrofluidischen Geräts. Neuronale Vorläuferzellen und Muskelvorläuferzellen werden in verschiedene Vertiefungen innerhalb des Geräts ausgesät und zu Motoneuronen bzw. Myotuben reifen gelassen. Die Bildung eines Volumens und eines chemischen Gradienten führt zur Entwicklung aktiver neuromuskulärer Verbindungen.

Erzeugung neuromuskulärer Verbindungen mit einem mikrofluidischen Gerät

Das Video zeigt die Differenzierung von neuralen Stammzellen (NSCs) mit Hilfe eines mikrofluidischen Geräts, das aus einem somatischen und einem axonalen Kompartiment besteht, die durch eine Mikrorillenbarriere getrennt sind. NSCs werden in das somatische Kompartiment eingebracht und dürfen dort haften. Die NSCs differenzieren sich innerhalb des somatischen Kompartiments in Neuronen und verlängern Axone durch die Mikrorillenbarriere bis zum axonalen Kompartiment.

Differenzierung von neuralen Stammzellen zu Neuronen mit Hilfe eines kompartimentierten mikrofluidischen Geräts

Protokolle für die einzelnen Neurons mikrofluidischen Anordnungs und Wasser für die Maskierung in dem Chip Plasma Strukturierung der Biomaterial-Beschichtungen beschrieben. Sehr verbunden Co-Kulturen können mit minimalem Ein-Zelle hergestellt werden.

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung von kompartalisierten mikrofluidischen Chips, die in einem zyklischen Olefin-Copolymer in kultivierte Neuronen gegossen werden, die von menschlichen Stammzellen unterschieden werden. Diese Chips sind vormontiert und einfacher zu verwenden als herkömmliche, kompartalisierte Polygeräte (Dimethylsiloxan). Mehrere gängige experimentelle Paradigmen werden hier beschrieben, einschließlich viraler Etikettierung, fluidischer Isolation, Axotomie und...

Unterteilung menschlicher Stammzellen-abgeleiteter Neuronen in vormontierte Mikrofluidchips aus Kunststoff

Wir präsentieren ein mikrofluidisches System für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter Peristaltikpumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Der mikrofluidische Chip ermöglicht die Analyse der hochkomplexen und dynamischen Mikro-Umgebungsbedingungen in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung menschlicher motorischer Einheiten in kommerziell erhältlichen mikrofluidischen Geräten durch Kokulturierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Motoneuronen mit humanen primären Mesoangioblasten-abgeleiteten Myotuben, was zur Bildung funktionell aktiver neuromuskulärer Verbindungen führt.

Erzeugung humanmotorischer Einheiten mit funktionellen neuromuskulären Verbindungen in mikrofluidischen Geräten

Brustkrebszellen zeigen unterschiedliche dielektrische Eigenschaften im Vergleich zu Nicht-Tumor-Brustepithelzellen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass aufgrund dieses Unterschieds in den dielektrischen Eigenschaften die beiden Populationen für Immuntherapiezwecke getrennt werden können. Um dies zu unterstützen, modellieren wir ein mikrofluidisches Gerät zur Sortierung von MCF-7- und MCF-10A-Zellen.

Mikrofluidisches Gerät zur Trennung von nicht-metastasierten (MCF-7) und nicht-tumoralen (MCF-10A) Brustkrebszellen mittels AC-Dielektrophorese

Erfahren Sie die Differenzierung neuronaler Vorläuferzellen durch Gleichstrompulsstimulation in mikrofluidischen Systemen. Diese effiziente Methode reduziert Versuchsaufbauzeit und Reagenzienverbrauch erheblich.

Elektrisch-Feld-induzierte neuronale Vorläuferzelldifferenzierung in mikrofluidischen Geräten

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