Name: Sandfliege (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjektion für CRISPR/Cas9 Mutagenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Lernen Sie CRISPR/Cas9-Mutagenese bei Sandfliegen durch Embryo-Mikroinjektion. Diese Methode ermöglicht gezielte Genomeditierung in Phlebotomus papatasi für die Erforschung von Vektorgenetik.

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Die Autoren danken Vanessa Meldener-Harrell für die kritische Lektüre des Manuskripts.

Die Verwendung von Mäusen als Blutquelle für die Sandfliegenfütterung erfolgte in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health (NIH). Das Protokoll wurde vom Animal Care and Use Committee des NIAID, NIH (Protokollnummer LPD 68E) genehmigt. Wirbellose fallen nicht unter die NIH-Richtlinien.
1. Nadelpräparation (Abbildung 1)
<ol><li>Ziehen Sie Nadeln und Abschrägung, wie in Meuti und Harrell19beschrieben. Kurz, ziehen Sie Nadeln auf einem zweistufigen Glas Mikropipette Puller, mit Borosilikat Glas Kapillaren.</li>
	<li>Schärfen Sie die Nadeln durch nasses Abschrägen auf dem Micropipette-Abschräger mit einem extra feinen Stein.</li>
</ol>2. Embryo-Sammlung und Mikromanipulation (Abbildung 2)
<ol><li>Fünf Tage vor dem Tag der Injektion, Blut-Feed-Sand fliegen Weibchen wie routinemäßig für die Pflege der Kolonie durchgeführt. Einzelheiten zu Sandfliegenkolonien und benötigtem Material finden Sie unter Lawyer et al.1 Pflegen Sie die Insekten in Brutkästen bei 70% Luftfeuchtigkeit und 26 °C während ihrer gesamten Entwicklung.<ol>
<li>Eines Tages nach der Blutfütterung, fangen blutgefütterte Weibchen von Gruppen von 100-150 in Gipstöpfen mit einem Seitenport. Pflegen Sie die Weibchen, indem Sie sie mit Zuckerlösung (30% Saccharose – genug Volumen, um eine kleine Baumwollkugel zu tränken) füttern, was für die Pflege der Kolonie üblich ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>An Tag 2-3 nach der Blutfütterung, befeuchten Sie NICHT die Gipstöpfe. Die Weibchen auf einem trockenen Substrat zu halten, verhindert eine vorzeitige Eiablage, da Weibchen es vorziehen, Eier auf eine feuchte Umgebung zu legen.</li>
	<li>Führen Sie am 5. Tag nach der Blutfütterung die Embryoentnahme, Mikromanipulation und Mikroinjektion durch. Führen Sie ein feuchtes Filterpapier in die Eiablagekammer ein. Frisch verlegte Embryonen haben keine voll entwickelte Choreographie und wirken weiß. Verwenden Sie während des Verfahrens schwarzes Filterpapier, um die Visualisierung der weißen Embryonen zu erleichtern.</li>
	<li>Übertragen Sie eine kleine Gruppe von Weibchen aus dem Gipstopf in die Ei-Laying-Kammer durch die Seitenöffnungen mit einem Mundsauger. Das Vorhandensein eines feuchten Substrats (das Filterpapier) induziert Weibchen zu Oviposit.</li>
	<li>Nach 30-60 min das Filterpapier mit neu verlegten Embryonen vorsichtig aus der Kammer holen. Das Filterpapier und die Embryonen bis zu 3 Stunden in einer Petrischale aufbewahren. Bewerten Sie während dieser Zeit regelmäßig den Feuchtigkeitsgehalt des Filterpapiers, um sicherzustellen, dass es feucht bleibt. Wiederholen Sie während dieser Zeit die Schritte 2.4 bis 2.6 mit neuen Gruppen von Weibchen und sammeln Sie so viele Embryonen wie möglich.</li>
	<li>Mikroskopdias für die Injektion vorbereiten: Die Eier nacheinander mit einem sehr feinen Pinsel nacheinander sammeln und vorsichtig auf ein anderes Stück feuchtes schwarzes Filterpapier übertragen, das auf einem Mikroskopschlitten mit einem Glasdeckel platziert ist.<ol>
<li>Fügen Sie Wasser in das Filterpapier, genug, um die Embryonen feucht zu halten, aber nicht dazu führen, dass sie weg von der Abdeckung rutschen oder unter dem Deckschein gesaugt werden. Richten Sie die Embryonen gegen den Deckzettel aus. Der Deckelschlupf dient als Backstop, der verhindert, dass die Eier während der Injektion wegrollen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Embryo-Injektionen (Abbildung 3)
<ol><li>Beginnen Sie die Injektionen 2,5 bis 3 Stunden nach Beginn der Eiabfuhr. Führen Sie Injektionen bei Raumtemperatur und Umgebungsfeuchtigkeit im Labor durch.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die ausgerichteten Embryonen genügend Wasser haben, damit sie feucht gehalten werden. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Embryonen während der Injektionen feucht gehalten werden. Wenn sie während des Injektionsprozesses nicht feucht sind, werden Injektionen schwierig, weil die Nadel Probleme hat, den Embryo zu durchbohren. Die richtige Wassermenge ist der Punkt, an dem die Embryonen einen Meniskus wasserumlaufen, aber der Deckelrutsch schwebt nicht auf dem Wasser, wodurch die Embryonen unter den Deckelrutschen schieben. Es ist wichtig, die Wassermenge um die Embryonen während der Injektionen zu überwachen. Fügen Sie Wasser nach Bedarf hinzu, um die Embryonen feucht zu halten.</li>
	<li>Fügen Sie Wasser sorgfältig hinzu, indem Sie eine Bürste mit Wasser benetzen und das Wasser an das hintere Ende des Filterpapiers übertragen. Das Hinzufügen von Wasser auf diese Weise ermöglicht es, Wasser in einer langsamen und kontrollierten Weise hinzugefügt werden, so dass gerade genug hinzugefügt wird, um die Embryonen feucht zu halten. Zu viel Wasser kann dazu führen, dass die Embryonen aus der Ausrichtung schweben, was es schwierig macht, die Embryonen zu injizieren.</li>
	<li>Rücklastinjektion in die Mikroinjektionsnadel mischen. Fügen Sie mit einem handgezeichneten Borosilikatnadelfüller ca. 0,5 bis 1 l Injektionsmischung in die Nadel ein, Gel-Ladepipettenspitzen können ebenfalls verwendet werden. Der Injektionsmix besteht aus einer oder mehreren Führungs-RNA (jeweils 80 ng/l), die auf einen bestimmten Ort abzielt, der mit kommerziellem rekombinantem Cas9-Protein (300 ng/l) gemischt wird.</li>
	<li>Beginnend mit dem Injektionsdruck bei 30 psi, drücken Sie den Injektionsauslöser, um Luft aus der Spitze der Nadel zu vertreiben. Dadurch wird die Injektionsmischung an die Spitze der Nadel zwingen, so dass die Injektionsmischung fließen kann. An diesem Punkt, langsam erhöhen Sie den Halte-/Konstantdruck, bis das Injektionsmaterial zu fließen beginnt, und dann wieder vom Halte-/Konstantdruck, so dass er sich knapp unter dem Punkt der Injektionsmischung befindet, die aus der Nadel fließt. Die gated Einstellung sollte gerade genug Injektionsmaterial liefern, so dass eine kleine Menge an Material gesehen werden kann, um in den Embryo zu gelangen. HINWEIS: Die Injektion von Sandfliegenembryonen unter Halocarbonöl ähnlich wie andere Protokolle, die für Drosophila und Mücken verwendet wurden, wurde ursprünglich getestet, aber der Überlebensprozentsatz für diese Injektionen war sehr gering. Das Überleben wurde durch die Umstellung auf Injektionen auf feuchtem Filterpapier wie oben beschrieben verbessert.</li>
	<li>Setzen Sie die Nadel in die Seite des Embryos ein. Verwenden Sie den Deckelhinterrutsch hinter dem Embryo als Backstop, der der Nadel hilft, den Embryo zu durchbohren. Geben Sie eine kleine Menge Injektionsmischung in den Embryo, bevor Sie die Nadel vorsichtig entfernen.</li>
	<li>Drücken Sie unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel den Injektor, um das aufgefüllte Material von der Nadelspitze zu entfernen. Dies wird helfen, zu verhindern, dass die Nadel verstopft.</li>
	<li>Fahren Sie mit dem nächsten Embryo fort. Zwischen jeder Injektion stellen Sie sicher, dass das Filterpapier feucht ist und die Nadel nicht verstopft ist.</li>
	<li>Sobald alle Embryonen injiziert wurden, zählen Sie die Anzahl der injizierten Embryonen, um eine laufende Zählung zu halten.</li>
	<li>Entfernen Sie den Deckelschlupf, indem Sie dem Filterpapier Wasser hinzufügen, damit der Coverslip schwimmt. Verwenden Sie an dieser Stelle eine Sonde (Holzapplikator-Stick mit Anstecknadel an der Spitze) um das Filterpapier an Ort und Stelle zu halten, während ein Finger verwendet wird, um den Deckelrutsch von den injizierten Embryonen wegzuziehen.</li>
	<li>Überschüssiges Wasser aus dem Filterpapier wegblasen, sobald der Deckelschlupf entfernt wurde.</li>
</ol>4. Post-Injection-Aufzucht (G0) (Abbildung 4)
<ol><li>Übertragen Sie das Filterpapier mit den Embryonen auf mehrere Schichten feuchten Filterpapiers, das in eine Petrischale gelegt wird, um die Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Bewahren Sie die Embryonen hier während der Zeit auf, die für die Injektion anderer Embryonen benötigt wird. Embryonen können maximal 3 Stunden lang gehalten werden. Nach der Injektion werden sie langsam braun.</li>
	<li>Sobald alle Embryonen injiziert wurden, übertragen Sie sie manuell auf zuvor befeuchtete kleine Gipstöpfe. Legen Sie nicht zu viele Embryonen in jeden Topf und halten Sie Denabstand zwischen ihnen, um eine mögliche Pilzkontamination zwischen Individuen zu vermeiden. Bedecken Sie die Töpfe mit einem Bildschirm und lagern Sie sie, wie es typischerweise für Sandfliegenkolonie-Eier, die in Brutkästen bei 70% Luftfeuchtigkeit und 26 °C gehalten werden, während ihrer gesamten Entwicklung durchgeführt würde.</li>
	<li>Entfernen Sie am ersten Tag nach der Injektion alle beschädigten und toten Embryonen mit einem Pinsel. Fügen Sie 100 l 0,5% Propionsäure, Tropfen für Tropfen, auf die Gipstöpfe mit den injizierten Embryonen, um die Pilzkontamination zu begrenzen. Die Freisetzung von Zytoplasma von Embryonen, die während des Injektionsprozesses geschädigt wurden, ist besonders günstig für das Pilzwachstum.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Gipstöpfe jeden Tag und entfernen Sie alle schlechten oder toten Embryonen. Wenn Pilz vorhanden ist, entfernen Sie alle infizierten Embryonen und fügen Sie ein paar Tropfen von 0,5% Propionsäure hinzu.</li>
	<li>Larven schlüpfen zwischen Tag 8 und 12 nach der Injektion. Zweimal täglich die neu entstandenen Larven auf neue Gipstöpfe übertragen, in Gruppen von maximal 5-10. Fügen Sie eine kleine Menge Ankost hinzu und überprüfen Sie das Essen 2-3 mal pro Woche.<ol>
<li>Überwachen Sie sorgfältig die Menge an Larvenfutter, da zu viel das Risiko einer Pilzkontamination erhöht. Sandfliegenlarven überleben besser in Gruppen, aber sie können kannibalistisch sein, wenn es nicht genug Nahrung gibt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn die Larven verpupate, trennen Sie sie nach Geschlecht, um die Weibchen als Jungfrauen zu erhalten. Wenn es viele Überlebende gibt, entsorgen Sie die Männchen und halten Sie nur die Weibchen. HINWEIS: Sowohl Männchen als auch Weibchen können Mutationen tragen und übertragen. Da Weibchen jedoch Jungfrauen gehalten werden müssen, bevor sie gekreuzt werden sollen, ist es einfacher, nur die G0 injizierten Weibchen zu verwenden, um zu vermeiden, dass wt Insekten durch Geschlecht getrennt werden müssen. Die G0 Männchen können als Backup gehalten werden, wenn die Anzahl der erwachsenen Überlebenden gering ist und in diesem Fall mit sortierten wt jungfrauen Weibchen gepaart werden.</li>
</ol>5. Auswahl und Screening von mutierten Allelen (Abbildung 5)
<ol><li>Massenüberquerung der G0 Weibchen mit Wt-Männchen in einem Käfig. Blutfüttern Sie sie ganz, wie es für die normale Pflege der Kolonie nen würde.</li>
	<li>Eines Tages nach der Blutfütterung jedes G0 Weibchen mit 2-3 Gew.-Männchen mit einem Mundsauger in einzelne Gipsröhren übertragen. Füttern Sie die Fliegen mit Zucker auf einer kleinen Baumwollkugel, die jeden Tag gewechselt wird, und verwenden Sie eine Spritze Wasser, um sicherzustellen, dass die Putzfeuchtigkeit für die Eiablage geeignet ist.</li>
	<li>Nachdem die G0-Weibchen Eier gelegt haben (entsprechend G1), sammeln ihre Körper einzeln, beschreibte Eppendorfer Röhren zur späteren Genotypisierung. Pflegen Sie die Embryonen, wie sie normalerweise für Wt-Kolonien durchgeführt werden.</li>
	<li>Extrahieren Sie die DNA aus den G0 Weibchen nach der Methode der Wahl.</li>
	<li>Überprüfen Sie die DNA auf das Vorhandensein von Mutationen, z. B. durch die Entwicklung eines PCR-Assays mit Primern, die die Region der erwarteten CRISPR-Schnitte umgeben.</li>
	<li>Bewahren Sie nur die G1-Embryonen auf, die von G0-Weibchen gelegt wurden und Anzeichen einer Transformation zeigen. Wenn sich diese G1-Embryonen zu Pupas entwickeln, trennen Sie sie nach Geschlecht und halten nur die Weibchen. Kreuzen Sie die G1 Weibchen von der gleichen G0 Weibchen zu Wt Männchen, Blut füttern sie, dann in kleinen Gruppen von 2-3 Weibchen und 4-5 Männchen in kleine Behälter übertragen. HINWEIS: Alle G1 Individuen haben eine Chance, eine einzigartige Mutation zu tragen, also wenn die Anzahl der überlebenden Individuen nicht zu hoch ist, dann ist es besser, G1 Weibchen einzeln mit Wt-Männchen zu kreuzen. Der Fall mehrerer Weibchen, die eine andere Mutation in einem selben Röhrchen tragen, ist selten, kann aber auftreten. Wenn ein solcher Fall nach der Genotypisierung beobachtet wird, sollten dieG2-Nachkommenweibchen dann einzeln mit Wt-Männchen gepaart werden. Dieses Paarungsschema vermeidet die Möglichkeit mehrerer Mutationen in der Nachkommenschaft.</li>
	<li>Nach der Eiablage die weiblichenG1-Körper sammeln und auf Mutationen abschirmen. Bewahren Sie nur die Röhren auf, in denen mindestens ein Weibchen Anzeichen einer Mutation zeigte.</li>
	<li>Für spätere Generationen machen einzelne Paar in-Kreuze. Nach der Eiablage, Bildschirm Eltern für das Vorhandensein von Mutation. Wiederholen Sie dies bei jeder Generation, bis beide Elternteile für die gleiche Mutation homozygot sind. Einmal identifiziert, werden sie die Gründer eines homozygoten mutierten Bestandes sein.</li>
</ol>

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Wir präsentieren hier eine kürzlich entwickelte Embryo-Mikroinjektionsmethode für gezielte Mutagenese von CRISPR/Cas9 in Phlebotomus papatasi Sandfliegen. Embryo-Mikroinjektion zur insektengenetischen Veränderung wurde Mitte der 1980er Jahre21 in Drosophila entwickelt und wird heute routinemäßig in einer Vielzahl von Insekten eingesetzt. Andere Methoden zur Lieferung von genetischen Veränderungsmaterialien wurden für den Einsatz in Insekten entwickelt, wie ReMOT...

Vektorübertragene Krankheiten stellen in ständiger Weiterentwicklung eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Hunderte von Vektorarten, die sich über sehr unterschiedliche phylogene Familien (z. B. Mücken, Zecken, Flöhe) verteilen, sind für die Übertragung einer großen Anzahl von mikrobiellen Krankheitserregern verantwortlich, was nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation zu mehr als 700.000 Todesfällen pro Mensch pro Jahr führt. Unter den Vektorinsekten bilden Phlebotomin-Sandfliegen (Diptera, Psychodidae) eine große Gruppe, mit 80 bewährten Vektorarten, die unterschiedliche phänotypische Merkmale und vektorielle Fähigkeiten aufweisen, die in verschiedenen geographischen Regionen zu finden sind. Sie sind Vektoren für die protozoischen Parasiten der Gattung Leishmania, verursacht etwa 1,3 Millionen neue Fälle von Leishmaniosen und zwischen 20.000 und 30.000 Todesfälle pro Jahr. Leishmaniose klinische Ergebnisse sind vielfältig, mit Symptomen, die von selbstbegrenzenden hautenden Läsionen bis hin zu viszeraler Verbreitung reichen, die in Ermangelung einer Behandlung tödlich ist.
Sandfliegen sind streng terrestrische Insekten. Ihr Lebenszyklus, relativ lang im Vergleich zu anderen Diptera, dauert bis zu drei Monate, abhängig von verschiedenen Parametern wie Temperatur, Feuchtigkeit, und Ernährung. Es besteht aus einem embryonalen Stadium (6 bis 11 Tage), vier Larvenstadien (insgesamt 23 bis 25 Tage) und einem Pupalstadium (9 bis 10 Tage) gefolgt von Metamorphose und dann Erwachsenwerden. Sandfliegen benötigen eine feuchte und warme Umgebung für die Aufzucht. Sowohl Männchen als auch Weibchen ernähren sich von Zucker, der in freier Wildbahn aus Blütennektaren gewonnen wird. Nur Weibchen sind Blutfütterer, da sie Proteine benötigen, die aus der Blutmahlzeit für die Eiproduktion gewonnen werden1.
Ein wichtiger Forschungsschwerpunkt ist die Identifizierung der Art der Vektor-Parasiten-Wechselwirkungen, die zur Entwicklung übertragbarer Infektionen führen. Wie bei anderen Vektorinsekten haben Parameter, die Sandfliegen innewohnen, gezeigt, dass sie ihre Vektorkompetenz beeinflussen, was als ihre Fähigkeit definiert ist, Krankheitserreger zu tragen und auf ihre Wirte zu übertragen. Zum Beispiel kann die Expression von Galektinen durch die Phlebotomus papatasi Sandfliegen-Mitteldarmzellen, die als Rezeptoren fungieren, die Parasitenoberflächenkomponenten erkennen, ihre Vektorkompetenz für Leishmania major2,3direkt beeinflussen. Der Immunantwortweg von Insekten, Immundeficiency (IMD), ist auch entscheidend für die Phlebotomus papatasi Sandfliegenvektor-Kompetenz für Leishmania major4. Eine entscheidende Rolle für Vektorinsekten Immunantwort Bahnen bei der Kontrolle ihrer Übertragung von infektiösen Krankheitserregern wurde ähnlich berichtet in Aedes aegypti Mücken5,6,7, in der Tsetse Fly Glossina morsitans8, und in Anopheles gambiae Mücken9,10.
Studien über Sandfliegen/Leishmanie-Wechselwirkungen wurden durch den Mangel an Methoden zur Modifikation der Genexpression, die für den Einsatz in diesen Insekten angepasst wurden, eingeschränkt. Bis vor kurzem wurdennur 11,12,13,14 durch kleine interferierende RNA (siRNA) durchgeführt. Die Technik, begrenzt durch die Mortalität im Zusammenhang mit der Mikroinjektion von erwachsenen Frauen, führt nur zu einem teilweisen Verlust der Funktion, die nicht von Generation zu Generation übertragen werden kann.
Die CRISPR/Cas9-Technologie hat die funktionelle Genomforschung bei Nicht-Modellorganismen wie Sandfliegen revolutioniert. Modifiziert vom adaptiven Immunsystem in Prokaryoten zur Abwehr von Bakteriophagen15,16, wurde das CRISPR Cas9-System schnell als Genom-Editing-Tool für überlegene eukaryotische Organismen, einschließlich Insekten, angepasst. Das Prinzip der gezielten Genombearbeitung von CRISPR/Cas9 basiert auf der Komplementarität einer einzelnen Führungs-RNA (sgRNA) zu einem bestimmten genomischen Ort. Die Cas9-Nuklease bindet an die sgRNA und erzeugt einen Doppelstrang-DNA-Bruch (dsDNA) in der genomischen DNA, bei dem die sgRNA mit ihrer komplementären Sequenz assoziiert. Der Cas9-sgRNA-Komplex wird durch 17 bis 20 komplementäre Basen in der sgRNA zum gewählten Ort zur Zielsequenz geführt, der dsDNA-Bruch kann dann durch zwei unabhängige Wege repariert werden: nichthomologe Endverbindung (NHEJ) oder homologiegesteuerte Reparatur (HDR)17. Die NHEJ-Reparatur beinhaltet einen einfachen Abschluss der Unterbrechung, führt aber häufig zu kleinen Einfüge-/Löschereignissen. DNA-Reparatur durch HDR verwendet ein Spender-DNA-Molekül, das Homologie mit der Ziel-DNA teilt, als Vorlage für die Reparatur. Insekten besitzen beide Maschinen.
Die CRISPR/Cas9-Technologie kann Mutationen in einem ausgewählten Ort über den NHEJ-Reparaturweg erzeugen; oder für komplexere Genom-Editing-Strategien, wie Knock-Ins oder Ausdrucksreporter, durch den HDR-Pfad mit einer geeigneten Spendervorlage. Bei Sandfliegen wurden null mutierte Allele des Immunantwortfaktors Relish durch NHEJ-vermittelte CRISPR in Phlebotomus papatasi4erzeugt. Sandfliegen-Embryonen wurden auch in einer anderen Studie mit einem CRISPR/Cas9-Mix injiziert, der auf das Gen abzielt, das Yellow kodiert. Dennoch wurden keine Erwachsenen mit der Mutationproduziert 18. Wir beschreiben hier eine detaillierte Methode der Sandfliegengezielten Mutagenese durch NHEJ-vermittelte CRISPR/Cas9, mit einem besonderen Fokus auf die Embryo-Mikroinjektion, ein kritischer Schritt des Protokolls.

<table><tbody><tr><td>Schwarzes Filterpapier 4,25 cm PK100 VWR</td><td></td><td>28342-012</td><td>Schneiden Sie in Rechtecke mit den Maßen 46 x 22 mm. Diese werden zwischen dem Objektträger und dem Deckglas platziert und dienen während der Injektion als feuchte Basisschicht für die Embryonen.</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-543A</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Zum Ausrichten von Embryonen</td></tr><tr><td>Objektträger Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Basisschicht des Mikroinjektions-Setups Abbildung 2A</td></tr><tr><td>Insektenkäfig</td><td>nach Maß oder verschiedene kommerzielle Optionen</td><td></td><td>Polycarbonat-Käfig für erwachsene Tiere, die Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton und Petr Volf. &ldquo; Laborbesiedlung und Massenaufzucht von Phlebotomin-Sandmücken (Diptera, Psychodidae)." Parasit 24. Abgerufen am 6. August 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Larvenfutter</td><td>nach Maß stellte</td> eine Mischung aus Kaninchenfutter und Kaninchenkot Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton und Petr Volf her<td></td><td>. Laborbesiedlung und Massenaufzucht von Phlebotomin-Sandmücken (Diptera, Psychodidae)." Parasit 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Microcaps 100 ml</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Wird zum Nachfüllen von Mikroinjektionsnadeln</td></tr><tr><td>verwendet Mundsauger</td><td>John W. Hock Company</td><td>Modell 612</td><td>Mundsauger mit HEPA-Filter</td></tr><tr><td>Olympus SZX12</td><td>Olympus Life Sciences</td><td></td><td>Mikroinjektionsmikroskop</td></tr><tr><td>Ovipots</td><td>Nalge Unternehmen</td><td></td><td>Die Eiablagen werden aus 125-ml- oder 500-ml-Plolypropylen-Gläsern hergestellt, die durch Bohren von 2,5 cm Löchern in den Boden modifiziert und mit 1 cm Pariser Gips gefüllt werden. Rechtsanwalt, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton und Petr Volf. &ldquo; Laborbesiedlung und Massenaufzucht von Phlebotomin-Sandmücken (Diptera, Psychodidae)." Parasit 24. Abgerufen am 6. August 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Pinsel 6-0</td><td>Any Art Supply Company</td><td>n/a</td><td>Wird zum Ausrichten von Embryonen</td></tr> verwendet <tr><td>Propionsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td>Antimykotikum</td></tr><tr><td>Standardglas Kapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td>Wird zur Herstellung von Mikroinjektionsnadeln</td></tr><tr><td>verwendet Trio-MPC100 Controller und MP845 Manipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Mikroinjektionscontroller und Mikromanipulator</td></tr></tbody></table>

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Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sandfliegen sind die natürlichen Vektoren für Leishmanien-Arten, Protozoen-Parasiten, die ein breites Spektrum von Symptomen produzieren, die von Hautläsionen bis hin zu viszeraler Pathologie reichen. Die Entschlüsselung der Art der Vektor-Parasiten-Wechselwirkungen ist von primärer Bedeutung für ein besseres Verständnis der Leishmanie-Übertragung auf ihre Wirte. Unter den Parametern, die die Sandfliegenvektorkompetenz steuern (d.h. ihre Fähigkeit, Krankheitserreger zu transportieren und zu übertragen), spielten parameter, die diesen Insekten innewohnen, eine Schlüsselrolle. Die Insektenimmunantwort zum Beispiel beeinflusst die Sandfliegenvektorkompetenz auf Leishmania. Die Untersuchung solcher Parameter wurde durch das Fehlen von Methoden zur Veränderung der Genexpression eingeschränkt, die für die Verwendung in diesen Nichtmodellorganismen angepasst wurden. Eine Gendownregulation durch kleine störende RNA (siRNA) ist möglich, aber neben der technischen Herausforderung führt das Silencing nur zu einem partiellen Funktionsverlust, der nicht von Generation zu Generation übertragen werden kann. Die gezielte Mutagenese durch CRISPR/Cas9-Technologie wurde kürzlich an die Phlebotomus papatasi Sandfliege angepasst. Diese Technik führt zur Erzeugung übertragbarer Mutationen in einem speziell ausgewählten Ort, der es ermöglicht, die genesweisend zu untersuchen. Das CRISPR/Cas9-System basiert auf der Induktion gezielter Doppelstrang-DNA-Breaks, die später entweder durch Non-Homologous End Joining (NHEJ) oder durch Homology Driven Repair (HDR) repariert werden. NHEJ besteht aus einem einfachen Abschluss der Pause und führt häufig zu kleinen Einfüge-/Löschereignissen. Im Gegensatz dazu verwendet HDR das Vorhandensein eines Spender-DNA-Moleküls, das Homologie mit der Ziel-DNA teilt, als Vorlage für die Reparatur. Hier präsentieren wir eine Sandfliegen-Embryo-Mikroinjektionsmethode zur gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 mit NHEJ, der bisher einzigen Genommodifikationstechnik, die an Sandfliegenvektoren angepasst ist.

Das hier beschriebene CRISPR/Cas9-Mikroinjektionsprotokoll zur Erzeugung von Sandfliegenmutanten wurde in einer früheren Publikation4eingerichtet. Dieser Ansatz führte zu einer hocheffizienten Mutagenese, da 11 von 540 Personen das Verfahren überlebten, von denen 9 mutiert waren. Beim Entwerfen von Leitfäden für die CRISPR/Cas9-Mutation besteht ein wichtiger erster Schritt darin, die Region um das zielgerichtete Gebiet zu sequenzieren. Die Vorlage für die Sequenzierung sollte von dem Stamm stammen...

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte der gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 bei Sandfliegen: Embryoentnahme, Injektion, Insektenzucht und -identifikation sowie Auswahl von Mutationen von Interesse.

Sandfliege (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjektion für CRISPR/Cas9 Mutagenese

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Die gezielte Mutagenese wurde erst vor kurzem an Sandmücken angepasst und ist eine entscheidende Technik, um die Rolle und Funktion von Genen von Interesse in diesen Vektorinsekten zu verstehen. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein sehr wichtiger Schritt bei der Genom-Editierung von Insekten, aber sie muss an die Arten angepasst werden, mit denen Sie arbeiten, in unserem Fall Sandmücken. Im Vergleich zu den anderen Insektenarten sind die Embryonen der Sandmücke sehr klein.Es dauert lange, bis sie sich entwickeln, und sie reagieren besonders empfindlich auf die Höhe der Luftfeuchtigkeit. Fünf Tage vor der Injektion werden weibliche Sandmücken mit Blut gefüttert, um die Kolonie routinemäßig zu erhalten. Einen Tag nach der Fütterung fangen Sie die blutgefütterten Weibchen in Gipskapseln mit einer Seitenöffnung in Gruppen von 100 bis 150 und füttern Sie die Fliegen mit einer 30%igen Saccharoselösung.Legen Sie am fünften Tag nach der Blutfütterung ein weißes Stück feuchtes Filterpapier in die Eiablagekammer. Und verwenden Sie einen Mundsauger, um etwa 10 Weibchen zu sammeln und aus der Gipskapsel in die Eiablagekammer zu übertragen. Nach 30 bis 60 Minuten nehmen Sie die Petrischale und das Filterpapier aus der Eikammer.Dadurch bleibt das Filterpapier feucht und sammelt während dieser Zeit weiterhin neue Gruppen von Weibchen und Embryonen. Wenn alle Embryonen entnommen wurden, verwenden Sie ein Stereomikroskop und einen sehr feinen Pinsel, um etwa 50 Embryonen vorsichtig auf einzelne Stücke feuchtes schwarzes Filterpapier zu übertragen, auf Objektträger zu legen, die mit einem einzigen Deckglas pro Objektträger bedeckt sind. Geben Sie genug Wasser auf jedes Filterpapier, um die Embryonen feucht zu halten, ohne zu schwimmen oder unter die Deckgläser gesaugt zu werden, und legen Sie die Embryonen gegen die Deckgläser.Legen Sie zwei bis drei Stunden nach Beginn der Eizellentnahme einen Objektträger unter ein Präpariermikroskop und geben Sie mit dem Pinsel vorsichtig Wasser auf das hintere Ende des Filterpapiers. Belasten Sie 0,5 bis 1 Mikroliter Lastinjektion in eine Mikroinjektionsnadel und montieren Sie die Nadel in eine pneumatische Injektionssteuerung, die unter dem Mikroskop auf einen Druck von 30 Pfund pro Quadratzoll eingestellt ist. Drücken Sie den Abzug, um Luft aus der Nadelspitze zu entfernen.Wenn die Luft abgelassen ist, erhöhen Sie langsam den Nachdruck. Wenn das Injektionsmaterial zu fließen beginnt, verringern Sie den Nachdruck, bis er knapp unter dem Punkt der Injektionsmischung liegt, die aus der Nadel fließt, und führen Sie die Nadel in die Seite des ersten Embryos ein. Verwenden Sie das Deckglas hinter dem Embryo als Rückhalt und geben Sie eine kleine Menge Injektionsmischung in den Embryo, bevor Sie die Nadel vorsichtig entfernen.Unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel drücken Sie auf den Injektor, um verfülltes Material von der Nadelspitze zu entfernen und zum nächsten Embryo zu gelangen. Wenn alle Embryonen injiziert wurden, zählen Sie die Anzahl der injizierten Embryonen, um eine laufende Zählung zu führen, und fügen Sie Wasser auf das Filterpapier hinzu, damit der Deckglas schwimmt. Verwenden Sie dann eine Sonde, um das Filterpapier an Ort und Stelle zu halten, während Sie den Deckschirm von den Embryonen wegziehen.Und er war Filterpapier, um das überschüssige Wasser von der Rutsche abzutupfen. Übertragen Sie das Filterpapier auf einen Stapel feuchten Filterpapiers in einer neuen Petrischale und übertragen Sie jeden Embryo manuell auf angefeuchtete, kleine Gipskapseln, ohne dass es zu einem Überfüllungsgelaufen kommt. Decken Sie dann die Pods mit einem Sieb ab und lagern Sie die Pods in einem 26-Grad-Inkubator bei einer Luftfeuchtigkeit von 70 %.Wie bei den meisten erfolgreichen Mikroinjektionsprotokollen ist eine gute Mikroinjektionsnadel wichtig, die für die zu injizierenden Embryonen geeignet ist. Gute, scharfe Nadeln können leicht in den Embryo eindringen, ohne dass das Material nach der Injektion entweichen kann. Die gezogenen Nadeln sollten keine zu lange Verjüngung haben.Andernfalls wird das Lumen der Nadel für einen großen Teil der Verjüngung sehr schmal, was es schwierig macht, den Einspritzdruck hoch genug zu bringen, um das Material durch die Nadel zu drücken. Nach der Injektion aufgezogene Embryonen, die gesund sind, sollten aufbewahrt werden, während beschädigte, pilzkontaminierte, ausgetrocknete oder deformierte Embryonen verworfen werden sollten. Potentiell mutierte Allele können bei nach der Injektion aufgezogenen Individuen durch PCR-Analyse der Region um die erwarteten Beschneidungsstellen identifiziert werden.Nach der Etablierung der Mutantenlinie mit den injizierten Embryonen ermöglicht die Genotypisierungs-PCR die Identifizierung homozygoter mutierter Geschwisterkreuzungen. Es ist wichtig, eine gute Nadel zu haben, um die Embryonen sanft zu manipulieren und zu injizieren. Und um sicherzustellen, dass die Embryonen während des gesamten Eingriffs mit Feuchtigkeit versorgt werden.Die Genom-Editierung bei einigen Fliegen fängt gerade erst an. Diese Technik ist wirklich ein erster Schritt, dem komplexere Strategien zur Genommodifikation folgen sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die Mittelmeerfruchtfliege Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) ist ein weltweiter Schädling der Landwirtschaft. Ein tieferes Verständnis ihrer Biologie ist der Schlüssel, um die Populationen der Medfly zu kontrollieren und so die wirtschaftlichen Auswirkungen zu reduzieren. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein grundlegendes Instrument, das sowohl die Transformation der Keimbahn als auch umgekehrte genetische Studien bei dieser Spezies ermöglicht.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

Mikroinjektion von Nasonia Vitripennis Embryonen ist eine wesentliche Methode zur Erzeugung von erblichen Genom Modifikationen. Hier beschrieben, ist eine detaillierte Anleitung für die Mikroinjektion und Transplantation von Nasonia Vitripennis Embryonen, die zukünftige Genom Manipulation in diesem Organismus erheblich erleichtern wird.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionsverfahren für Culex quinquefasciatus-Embryonen, die für die Arbeit mit CRISPR/Cas9-Genbearbeitungswerkzeugen optimiert sind. Diese Technik kann effizient ortsspezifische, vererbbare Keimbahnmutationen erzeugen, die für den Aufbau genetischer Technologien in diesem wenig untersuchten Krankheitsvektor verwendet werden können.

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 wird zunehmend zur Charakterisierung der Genfunktion in Nicht-Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Knock-out-Linien von Culex pipienserzeugt, von der Vorbereitung von Injektionsmischungen über die Gewinnung und Injektion von Moskitoembryonen bis hin zur Aufzucht, Kreuzung und dem Screening injizierter Moskitos und ihrer Nachkommen auf gewünschte Mutationen.

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

Ei-Mikroinjektion und effiziente Mating für die Genombearbeitung im Firebrat Thermobia domestica

Hier beschreiben wir Methoden für effiziente Puppen- und Erwachseneninjektionen in Nasonia vitripennis als zugängliche Alternativen zur Embryo-Mikroinjektion, die eine funktionelle Analyse von Genen von Interesse entweder mit RNA-Silencing über RNA-Interferenz (RNAi) oder Gen-Knockout durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing ermöglichen.

Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis

Viele Merkmale der Insekten-Eusozialität beruhen auf der Kommunikation innerhalb der Kolonie und der Arbeitsteilung. Die genetische Manipulation wichtiger regulatorischer Gene in Ameisenembryonen durch Mikroinjektion und CRISPR-vermittelte Mutagenese liefert Einblicke in die Natur altruistischen Verhaltens bei eusozialen Insekten.

Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator

Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.

Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Hierin werden Protokolle zur Entnahme und Mikroinjektion von präzellulären Maiszikadenembryonen zum Zwecke der Modifikation ihres Genoms durch CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editierung oder zur Zugabe markierter transponierbarer Elemente durch Keimbahntransformation vorgestellt.

Mikroinjektion von Maiszikade, Peregrinus maidis, Embryonen für die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung

Dieser Artikel stellt die Schritt-für-Schritt-Protokolle für die CRISPR/Cas9-Mutagenese der orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis vor. Detaillierte Schritte, die von diesem standardisierten Protokoll bereitgestellt werden, werden als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen für funktionelle Genstudien in B. dorsalis dienen.

Protokolle für CRISPR/Cas9-Mutagenese der Orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis

Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein optimiertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen vor, ein entscheidender Schritt für die Entstehung transgener Fliegen.

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Lernen Sie CRISPR/Cas9-Mutagenese bei Sandfliegen durch Embryo-Mikroinjektion. Diese Methode ermöglicht gezielte Genomeditierung in Phlebotomus papatasi für die Erforschung von Vektorgenetik.

Sandfliege (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjektion für CRISPR/Cas9 Mutagenese

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