Name: Quantifizierung der Fibrillar Collagen Organisation mit Curvelet Transform-Based Tools (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Organisation fibrillärer Kollagenfasern in der extrazellulären Matrix mit Curvelet-Transform-basierten MATLAB-Tools quantifizieren. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen gesunder und erkrankter Gewebe.

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Wir danken vielen Mitwirkenden und Anwendern von CT-FIRE und CurveAlign im Laufe der Jahre, dr. Rob Nowak, Dr. Carolyn Pehlke, Dr. Jeremy Bredfeldt, Guneet Mehta, Andrew Leicht, Dr. Adib Keikhosravi, Dr. Matt Conklin, Dr. Jayne Squirrell, Dr. Paolo Provenzano, Dr. Brenda Ogle, Dr. Patricia Keely, Dr. Joseph Szulczewski, Dr. Suzanne Ponik und weitere technische Beiträge von Swati Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Semiconductor Research Corporation, des Morgridge Institute for Research und der NIH-Stipendien R01CA19996, R01CA181385 und U54CA210190 an K.W.E. unterstützt.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von CT-FIRE und CurveAlign für die fibrillare Kollagenquantifizierung und kann auf jedes Bild mit Kollagenfasern oder anderen linienartigen oder faserähnlichen, länglichen Strukturen angewendet werden, die für die Analyse durch CT-FIRE oder CurveAlign geeignet sind. Beispielsweise könnten Elastin oder elastische Fasern auf dieser Plattform auf ähnliche Weise verarbeitet werden. Wir haben beide Werkzeuge auf rechnerisch erzeugten synthetischen Fasern getestet21<...

Fibrillare Kollagene sind prominente, strukturelle ECM-Komponenten. Ihre Organisation ändert Auswirkungen Gewebefunktion und sind wahrscheinlich mit dem Fortschreiten vieler Krankheiten von Osteogenesis imperfecta1, Herzfunktionsstörung2, und Wundheilung3 zu verschiedenen Arten von Krebs einschließlich Brust4,5,6, Eierstock7,8, Niere9und Bauchspeicheldrüsenkrebs10 . Viele etablierte bildgebende Modalitäten können verwendet werden, um fibrillares Kollagen zu visualisieren, wie z. B. Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation11, Flecken oder Farbstoffe in Verbindung mit Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskopie oder polarisierter Lichtmikroskopie12, flüssige kristallbasierte Polarisationsmikroskopie (LC-PolScope)13und Elektronenmikroskopie14. Mit der zunehmenden Bedeutung der fibrillaren Kollagenorganisation und der zunehmenden Anwendung dieser Methoden ist auch der Bedarf an verbesserten Ansätzen zur Kollagenfaseranalyse gestiegen.
Es wurden viele Anstrengungen unternommen, um Berechnungsmethoden zur automatisierten Messung von fibrillarem Kollagen zu entwickeln. Frei verfügbare Software-Tools konzentrieren sich hauptsächlich auf die Berechnung der Faserausrichtung oder -ausrichtung, indem entweder der erste Derivat oder der Strukturtensor für die Pixel15,16oder Fourier transform-based spectrum analysis für Bildkacheln17übernommen wird. Alle diese Tools unterliegen Einschränkungen, wie z. B. der Anforderung manueller Schritte, der Ungenauigkeit bei der Erkennung der Faserkante im lauten Hintergrund oder dem Fehlen einer lokalisierten Feature-Charakterisierung.
Im Vergleich zu anderen frei verfügbaren Open-Source-Software-Tools verwenden die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden CT – eine optimale, multiskale, gerichtete Bilddarstellungsmethode –, um Rauschen von fibrillaren Kollagenbildern zu entfernen und Faserkanten zu verbessern oder zu verfolgen. Informationen über Standort und Ausrichtung können direkt aus einer Faser bereitgestellt werden, anstatt die indirekten pixel- oder fensterweisen Informationen zu verwenden, um die Metriken der Faserorganisation abzuleiten. Dieses CT-basierte Framework18,19,20,21 kann die Faserorganisation auf globaler, ROI- oder Faserbasis quantifizieren, hauptsächlich über zwei separate, aber verknüpfte Pakete mit den Namen "CT-FIRE"18,21 und "CurveAlign"19,21. Was die Implementierung der Software betrifft, können in CT-FIRE CT-Koeffizienten auf mehreren Skalen verwendet werden, um ein Bild zu rekonstruieren, das Kanten verbessert und Rauschen reduziert. Anschließend wird ein individueller Faserextraktionsalgorithmus auf das CT-rekonstruierte Bild angewendet, um Fasern zu verfolgen, um ihre repräsentativen Mittelpunkte zu finden, Faserzweige von den Mittelpunkten zu erweitern und Faserzweige zu einem Glasfasernetz zu verbinden. In CurveAlign können CT-Koeffizienten auf einer benutzerdefinierten Skala verwendet werden, um die lokale Faserausrichtung zu verfolgen, wobei die Ausrichtung und die Positionen von Kurvengezurteilen extrahiert und gruppiert werden, um die Faserausrichtung an den entsprechenden Positionen zu schätzen. Dieses daraus resultierende Quantifizierungsframework wurde seit mehr als zehn Jahren entwickelt und hat sich in vielen Aspekten wie Funktionalität, Benutzeroberfläche und Modularität stark weiterentwickelt. Dieses Tool kann beispielsweise die lokale Faserausrichtung visualisieren und ermöglicht es dem Benutzer, bis zu dreißig Fasermerkmale einschließlich einzelner Fasereigenschaften wie Länge, Winkel, Breite und Geradheit sowie Massenmessungen wie Dichte und Ausrichtung zu messen. Zusätzlich kann der Anwender den Faserwinkel relativ zu manuell oder automatisch segmentierten Grenzen messen, was beispielsweise eine wichtige Rolle bei der bildbasierten Biomarkerentwicklung beiBrustkrebs-22- und Bauchspeicheldrüsenkrebsstudien10spielt. Diese Plattform bietet mehrere Feature-Module, darunter module für die ROI-Analyse, die automatische Grenzerstellung und die Nachbearbeitung. Das ROI-Modul kann verwendet werden, um verschiedene ROI-Formen zu kommentieren und entsprechende ROI-Analysen durchzuführen. Als Anwendungsbeispiel kann das automatische Boundary Creation Modul verwendet werden, um Hämatoxylin und Eosin (H&E) Helle Feldbilder mit SHG-Bildern der zweiten harmonischen Generation zu registrieren und die Bildmaske von Tumorgrenzen aus den registrierten H&E-Bildern zu erzeugen. Das Nachbearbeitungsmodul kann die Verarbeitung und Integration von Ausgabedatendateien aus einzelnen Bildern für eine mögliche statistische Auswertung erleichtern.
Diese Quantifizierungsplattform erfordert keine Vorkenntnisse in der Programmierung oder Bildverarbeitung und kann große Datensätze einschließlich Hunderter oder Tausender Bilder verarbeiten, was eine effiziente Quantifizierung der Kollagenorganisation für biologische oder biomedizinische Anwendungen ermöglicht. Es wurde in verschiedenen Forschungsbereichen von vielen Forschern auf der ganzen Welt, einschließlich uns selbst, weit verbreitet. Es gibt vier Hauptpublikationen zu CT-FIRE und CurveAlign18,19,20,21, von denen die ersten drei 272 Mal zitiert wurden (Stand 2020-05-04 laut Google Scholar). Eine Überprüfung der Publikationen, die diese Plattform zitierten (CT-FIRE oder CurveAlign), zeigt, dass es ungefähr 110 Zeitschriftenpapiere gibt, die sie direkt für ihre Analyse verwendet haben, in denen etwa 35 Publikationen mit unserer Gruppe kollaboriert wurden, und die anderen (ca. 75) wurden von anderen Gruppen geschrieben. Zum Beispiel, Diese Plattform wurde für die folgenden Studien verwendet: Brustkrebs22,23,24, Bauchspeicheldrüsenkrebs10,25, Nierenkrebs9,26, Wundheilung3,27,28,29,30, Eierstockkrebs8,31,7, uterosacral ligament32, hypophosphatemic dentin33, bas Zellkarzinom34, hypoxisches Sarkom35, Knorpelgewebe36, Herzfunktionsstörungen37, Neuronen38, Glioblastom39, lymphatische Kontraktionen40, faserige Cacffolds41, Magenkrebs42, Mikrotubuli43und Blasenfibrose44. Abbildung 1 zeigt die krebsbildende Anwendung von CurveAlign, um die tumorassoziierten Kollagensignaturen von Brustkrebs19 aus dem SHG-Bild zu finden. Abbildung 2 beschreibt einen typischen schematischen Workflow dieser Plattform. Obwohl diese Tools technisch überprüft wurden18,19,21, und ein reguläres Protokoll20 für die Ausrichtungsanalyse mit CurveAlign ist auch verfügbar, ein visuelles Protokoll, das alle wesentlichen Funktionen demonstriert, könnte nützlich sein. Ein visualisiertes Protokoll, wie hier vorgestellt, wird den Lernprozess der Nutzung dieser Plattform erleichtern und Probleme und Fragen, die Benutzer haben könnten, effizienter behandeln.

<table><tbody><tr><td>CT-FIRE</td><td>University of Wisconsin-Madison</td><td>N/A</td><td>Open-Source-Software erhältlich von https://eliceirilab.org/software/ctfire/</td></tr> <tr><td>CurveAlign</td><td>University of Wisconsin-Madison</td><td>N/A</td><td>Open-Source-Software erhältlich bei https://eliceirilab.org/software/curvealign/</td></tr></tbody></table>

quantifizierung der fibrillar collagen organisation mit curvelet transform-based tools

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillare Kollagene sind prominente komponenten der extrazellulären Matrix (ECM), und ihre topologischen Veränderungen haben sich gezeigt, dass sie mit dem Fortschreiten einer breiten Palette von Krankheiten wie Brust-, Eierstock-, Nieren- und Bauchspeicheldrüsenkrebs in Verbindung gebracht werden. Frei verfügbare Software-Tools zur Faserquantifizierung konzentrieren sich hauptsächlich auf die Berechnung der Faserausrichtung oder -ausrichtung und unterliegen Einschränkungen wie der Anforderung manueller Schritte, ungenauigkeiten bei der Erkennung der Faserkante im lauten Hintergrund oder dem Fehlen einer lokalisierten Feature-Charakterisierung. Das in diesem Protokoll beschriebene Kollagenfaserquantitierungstool zeichnet sich durch eine optimale multiskalierende Bilddarstellung aus, die durch Curvelet-Transformation (CT) ermöglicht wird. Dieser algorithmische Ansatz ermöglicht die Entfernung von Rauschen von fibrillaren Kollagenbildern und die Verbesserung von Faserkanten, um Positions- und Orientierungsinformationen direkt aus einer Faser bereitzustellen, anstatt die indirekten pixel- oder fensterweisen Informationen aus anderen Werkzeugen zu verwenden. Dieses CT-basierte Framework enthält zwei separate, aber verknüpfte Pakete mit den Namen "CT-FIRE" und "CurveAlign", die die Faserorganisation auf globaler, Interessensgebiet-Basis (ROI) oder auf individueller Faserbasis quantifizieren können. Dieses Quantifizierungskonzept wurde seit mehr als zehn Jahren entwickelt und hat sich nun zu einer umfassenden und nutzergesteuerten Collagen-Quantifizierungsplattform entwickelt. Mit dieser Plattform kann man bis zu etwa dreißig Fasermerkmale messen, einschließlich einzelner Fasereigenschaften wie Länge, Winkel, Breite und Geradheit sowie Massenmessungen wie Dichte und Ausrichtung. Darüber hinaus kann der Benutzer den Faserwinkel relativ zu manuelloder automatisch segmentierten Grenzen messen. Diese Plattform bietet auch mehrere zusätzliche Module, einschließlich der Module für die ROI-Analyse, die automatische Grenzerstellung und die Nachbearbeitung. Die Verwendung dieser Plattform erfordert keine Vorkenntnisse in der Programmierung oder Bildverarbeitung und kann große Datensätze einschließlich Hunderter oder Tausender Bilder verarbeiten, was eine effiziente Quantifizierung der Kollagenfaserorganisation für biologische oder biomedizinische Anwendungen ermöglicht.

Diese Methoden wurden in zahlreichen Studien erfolgreich angewandt. Einige typische Anwendungen sind: 1) Conklin et al.22 verwendeten CurveAlign, um tumorassoziierte Kollagensignaturen zu berechnen, und fanden heraus, dass Kollagenfasern häufiger senkrecht zum Kanalumfang bei duktalen Karzinom-In-situ-Läsionen (DCIS) ausgerichtet waren; 2) Drifka et al.10 nutzten den CT-FIRE-Modus in CurveAlign, um die stromale Kollagenausrichtung für pankreastisches duktorzinom und normale...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Verwendung eines curvelet transform-basierten Open-Source-Softwaretools MATLAB zur Quantifizierung der fibrillaren Kollagenorganisation in der extrazellulären Matrix von normalem und krankem Gewebe vor. Dieses Werkzeug kann auf Bilder mit Kollagenfasern oder anderen Arten von linienähnlichen Strukturen angewendet werden.

Quantifizierung der Fibrillar Collagen Organisation mit Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...

Dieses Tool hilft bei der Quantifizierung von Veränderungen in der fibrillären Kollagenorganisation in der extrazellulären Matrix, die mit vielen Krankheiten in einer globalen Region von Interesse und auf der Basis einzelner Fasern verbunden sind. Dieses Werkzeug verwendet die Curvelet-Transformation, eine optimale Methode zur gerichteten Bilddarstellung mit mehreren Skalen, um Bildrauschen zu entfernen und Faserkanten zu verbessern. Umfangreiche und benutzerfreundliche Module ermöglichen eine effiziente Quantifizierung.Befolgen Sie für die Extraktion einzelner Fasern das Protokoll zum Öffnen des CT-FIRE und klicken Sie auf Dateien öffnen, um ein oder mehrere Bilder von Interesse auszuwählen. Klicken Sie im Parameterfenster auf "Aktualisieren" und passen Sie den Hintergrundschwellenwert und den Nukleationssuchradius an. Wenn alle Parameter festgelegt wurden, klicken Sie auf Ausführen.Nachdem die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf ein beliebiges Element in der Ausgabetabelle, um die Ergebnisse zu visualisieren, und überprüfen Sie den Unterordner ctFIREout auf die Ausgabedateien. Um einen Interessenbereich zu analysieren, klicken Sie auf Dateien öffnen, um ein oder mehrere Bilder zu laden, und wählen Sie das Bild aus, das mit Anmerkungen versehen werden soll. Wählen Sie im Bereich "Ausführungsoptionen" im Dropdown-Menü "Region of Interest Manager" aus und klicken Sie auf "Ausführen", um das Modul "Region of Interest Manager" zu starten.Klicken Sie anschließend auf das Dropdown-Menü D des Menüs "Interessenbereich zeichnen" und zeichnen Sie die Interessenbereiche. Wenn eine CT-FIRE-Vollbildanalyse durchgeführt wurde und die Ergebnisse im Standardverzeichnis gespeichert werden, klicken Sie auf einen oder mehrere Interessenbereiche in der Liste der Interessenbereiche und dann auf CT-FIRE Interessenbereichsanalysator, um das Modul für die Analyse der Interessenregion nach dem Erstellen zu starten. Wenn keine CT-FIRE-Vollbildanalyse durchgeführt wurde, klicken Sie auf einen oder mehrere der Interessenbereiche in der Liste der Interessenbereiche und dann auf CT-FIRE auf ROI anwenden, um die CT-FIRE-Analyse direkt auf die ausgewählten Interessenbereiche anzuwenden.Für eine erweiterte Nachbearbeitung aktivieren Sie das Kontrollkästchen out. adv und klicken Sie auf Nachbearbeitung, um die erweiterte grafische Nachbearbeitungsoberfläche zu starten. Klicken Sie im Analysemodul auf Datei auswählen und Verbindungslinien visualisieren, damit die Verbindungsliniennummer basierend auf den Beschriftungen auf der Registerkarte Originalfasern eingegeben werden kann.Klicken Sie auf Update bestätigen, um zum Schwellenwertvorgang zu gelangen, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für die Schwellenwerteingabe, um die Schwellenwerteinstellungen zu aktivieren. Wählen Sie eine der vier Schwellenwertoptionen aus dem Dropdown-Menü aus und geben Sie die gewünschten Schwellenwerte im Schwellenwertbereich für eine oder mehrere Fasereigenschaften ein. Klicken Sie dann auf Schwellenwert jetzt, um die oben genannten Schwellenwertbedingungen anzuwenden, und überprüfen Sie die Eingabeaufforderung mit dem Namen, der auf Metrikvisualisierung endet, um die ausgewählten Fasern mit den benutzerdefinierten Farbkarten auf den Originalbildern zu sehen.Wenn der Schwellenwert festgelegt wurde, klicken Sie auf Verbindungslinien speichern, um die ausgewählten Verbindungslinieninformationen zu speichern, und klicken Sie auf Statistiken generieren und dann auf OK, um die Zusammenfassungsstatistiken zu generieren. Um Ergebnisse aus mehreren Bildern zu kombinieren, aktivieren Sie den Batch-Modus und wählen Sie mehrere Bilder aus, die analysiert werden sollen, bevor Sie die Zusammenfassungsstatistiken wie gezeigt generieren. Um CT-basierte Fasermerkmale zu extrahieren, befolgen Sie das Protokoll zum Öffnen der CurveAlign-Software, klicken Sie in der grafischen Hauptbenutzeroberfläche auf Bilder abrufen und wählen Sie ein oder mehrere Bilder oder Bildstapel aus dem Eingabeaufforderungsfenster aus.Geben Sie den Anteil der Koeffs ein, der beibehalten werden soll, d. h. den Anteil der größten CT-Koeffizienten, die in der Verbindungslinienanalyse verwendet werden, und klicken Sie auf Ausführen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um einen gewünschten Schwellenwert festzulegen. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, werden einige zusammenfassende Statistiken für jedes Bild in einer Ausgabetabelle angezeigt, und alle Ausgabedateien werden automatisch in einem Unterordner mit dem Namen CA_out im Verzeichnis der Originalbilder gespeichert.Um CT-FIRE-basierte Fasermerkmale zu extrahieren, klicken Sie auf das Dropdown-Menü für die Faseranalysemethode und wählen Sie CT-FIRE-Fasern aus, um den Fasermittelpunkt und den Faserwinkel zur Darstellung der Faser zu verwenden. Wählen Sie für die relative Ausrichtungsanalyse der Tumorgrenze die TIFF-Randbedingung aus. Öffnen Sie die CurveAlign-Software, klicken Sie in der grafischen Hauptbenutzeroberfläche auf Bilder abrufen und wählen Sie ein oder mehrere Bilder oder Bildstapel aus dem Eingabeaufforderungsfenster aus.Geben Sie im Bereich Primärparameter den Abstand von der nächstgelegenen Begrenzung ein, um nur die Verbindungslinien innerhalb dieses Entfernungsbereichs auszuwerten. Aktivieren Sie im Bereich Ausgabeoptionen das Kontrollkästchen Berandungszuordnung, um die Visualisierung des Punktes auf der Berandung zu ermöglichen, der mit einer Verbindungslinie, einem Verbindungsliniensegment oder einem Curvelet verknüpft ist, und klicken Sie auf Ausführen, und klicken Sie dann auf die Ausgabetabelle, um die Ergebnisse zu visualisieren. Wenn eine Vollbild-CurveAlign-Analyse durchgeführt wurde und die Ergebnisse im Standardverzeichnis gespeichert werden, klicken Sie in der Liste "Interessenbereich" auf einen oder mehrere Interessenbereiche, und klicken Sie dann auf CurveAlign Region of Interest Analyzer, um eine Analyse nach der Analyse des Interessenbereichs auszuführen.Wenn noch keine Vollbild-Kurvenausrichtungsanalyse durchgeführt wurde, klicken Sie in der Liste der Interessenbereiche auf einen oder mehrere Interessenbereiche, und klicken Sie auf Kurvenausrichtung auf Interessenbereich anwenden, um die Kurvenausrichtungsanalyse direkt auf die ausgewählten Interessenbereiche anzuwenden. In diesem Bild ist ein Overlay-Bild eines Gewebe-Microarray-Kerns zu sehen. Bei der Vergrößerung sind die Fasern parallel und senkrecht zur Tumorgrenze innerhalb des interessierenden Bereichs zu sehen.Das CurveAlign-Ausgabe-Overlay-Bild zeigt die Tumorgrenzen und die repräsentativen Faserpositionen und -ausrichtungen. Mit dieser Methode lassen sich nicht nur Kollagenfasern, sondern auch andere linienförmige Strukturen wie Elastin quantifizieren und können möglicherweise die Früherkennung und prognostische Analyse von Krebs erleichtern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Erfahren Sie, wie Sie die Organisation fibrillärer Kollagenfasern in der extrazellulären Matrix mit Curvelet-Transform-basierten MATLAB-Tools quantifizieren. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen gesunder und erkrankter Gewebe.

Quantifizierung der Fibrillar Collagen Organisation mit Curvelet Transform-Based Tools

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